미래의 새로운 병원체로 인한 팬데믹(pandemic)의 대비, 암유전자의 조기 발견과 다양한 질환의 진단을 위한 정밀 의료(precision medicine)에 대한 높은 관심과 수요, 유전자 변이에 대한 수준 높은 진단과 치료법의 개발, 그리고 새로운 변이 유전자의 발견 등으로 인해 높은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 요구하는 많은 분자진단학적 검사법들이 COVID-19 이후 계속해서 개발되고 있다[1]. 향후 발생할 신종 유행병에 대비하기 위하여 초기 단계에서 감염원의 확산을 최대한 늦추고 백신과 치료제의 개발을 위한 시간을 벌기 위해 신속하고 정확한 조기 진단검사의 중요성이 매우 강조되고 있다[2]. 특히 진단검사를 이용한 정확한 병원체의 검출이 팬데믹을 억제하기 위한 출발점으로, 정밀하고 민감도가 높은 분자진단학적 검사의 중요성이 많이 강조되고 있다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 미량의 시료에서 표적 유전자의 염기서열(sequence)을 지수적으로 증폭시키는 이론을 기반으로 하는 분자진단학적 기법이다. 기존의 PCR (conventional PCR)을 1세대라 하며, 최종 증폭 산물을 확인하는 아가로스젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통해 증폭된 유전자 염기서열의 정성분석이 가능한 시스템으로, 정량적 분석은 불가능하였다. 2세대는 상대적 정량(relative quantitation)이 가능한 실시간 PCR (real-time PCR 또는 quantitative PCR, qPCR)로써, 1세대의 단점을 보완하기 위해 개발되었다. qPCR은 Ct 값(threshold per cycle value, Ct value)을 통해 실시간(real-time)으로 형광물질을 검출함으로써 상대적 정량 분석이 가능하여 qPCR이라 명명하였으며, 검사소요 시간도 기존 PCR보다 짧고 민감도 및 정밀도가 향상되었다. 정량적인 분석을 위해 표준곡선(standard curve)이 필수적이며, PCR의 효율에 따라 결괏값에 편차가 생길 수 있는 단점이 있다. 간혹 실시간 PCR을 RT-PCR로 표기하는 경우가 있는데 이는 잘못된 표기이다. RT-PCR은 특정 RNA를 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용하여 상보적 DNA (complementary DNA, cDNA)로 합성한 후 PCR로 증폭하는 역전사 PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)의 표기이다.

3세대 PCR을 디지털 PCR (digital PCR, dPCR)이라 하며, qPCR의 상대적 정량분석의 한계점을 극복하기 위하여 절대 정량화(absolute quantitation)가 가능하며, 더 높은 민감도와 정밀도를 얻을 수 있도록 개발된 새로운 개념의 PCR 방식이다.

이 종설 논문에서는 새로이 대두되고 있는 dPCR에 대한 세계적 시장 상황, dPCR의 역사, 원리 및 개요, dPCR의 유형(types), 응용 분야(application), qPCR과의 비교, 그리고 국내와 국외에서 dPCR 장비 및 시약을 판매하고 있는 기업 등을 소개하고, 향후 dPCR이 임상병리사들의 진단을 위한 검사에 적용되는 신속성, 사용자 편의성, 접근성, 그리고 경제성에서 검사실에서 qPCR의 게임 체인저가 되어 적용될 수 있는지 추론해 보고자 한다.

1. 디지털 polymerase chain reaction의 시장

2024년 4월 글로벌 시장 조사기업 360iResearch Private Limited의 시장보고서인 “디지털 PCR 시장: 제품 유형, 기술, 용도, 최종 사용자별 - 세계 예측(2024∼2030년)”에 의하면 “디지털 PCR 시장 규모는 2024년에는 62억 달러에 달할 것으로 예상되며, 2030년 예측은 112억 5,000만 달러로 연평균 성장률(compound annual growth rate, CAGR) 10.35%로 예측된다.”라고 하였다[3]. 이 보고서의 지역별 인사이트에서 “미국에서는 강력한 연구 인프라, 대형 제약 및 생명공학 기업의 존재, 헬스케어 및 진단에 대한 대규모 투자가 디지털 PCR 기술의 도입 및 구현을 주도하고 있다. 종양 연구에 대한 투자와 감염성 질환 진단에 대한 집중은 이 지역의 dPCR에 대한 수요를 더욱 증가시켜 세계 상황에서 큰 시장 성장을 가져오고 있으며, EMEA (Europe, the Middle East and Africa) 지역은 국가마다 경제력, 기술력 및 의료 시스템이 다르기 때문에 다양한 시장 도입이 이루어지고 있다. (중략) 아시아 태평양이 dPCR 시장에서 가장 빠른 성장세를 보이는 이유는 헬스케어 인프라가 빠르게 발전하고, 생명공학 및 제약 연구에 대한 투자가 증가하고, 정밀 의료에 대한 관심이 높아졌기 때문이다. 또한 인구 증가와 만성 질환의 유병률 증가로 인해 dPCR을 포함한 첨단 진단 기술의 채택이 증가하고 있다[3].”고 보고하였다.

2024년 4월 의약품 제조 및 하이테크 관련 조직의 비즈니스 리더를 위하여 전하고 있는 IMARC group (the International Market Analysis Research and Consulting Group)에서도 “세계 디지털 PCR 시장 규모는 2023년 47억 달러에 달했다. 향후 IMARC Group은 2032년까지 시장이 2024∼2032년 사이 9.25%의 CAGR로 2032년까지 107억 달러에 달할 것으로 예측했다. 핵산 정량 정확도 향상, 액체 생검 수요 증가, 지놈 연구(genomic research)의 획기적인 발전, 생명공학 및 제약 산업의 확장, 광범위한 연구 투자 활동은 시장을 주도하는 주요 요인 중 일부이다[4].”라고 하였다

2024년 6월 글로벌 시장조사와 컨설팅 기업으로, 미래 시장 성장에 대한 분석을 제공하고 있는 Polaris Market Research의 “세계의 디지털 PCR 시장 - 규모, 점유율, 동향, 산업 분석 보고서: 제품별, 기술별, 용도별, 최종 사용자별, 지역별 시장 예측(2024∼2032년)”에 의하면 “세계 디지털 PCR 시장 규모는 2032년까지 187억 8,000만 달러에 이를 것으로 예상된다[5].”고 하였다. 그리고 시장의 규모가 증가하는 원인으로 “디지털 PCR 시장 수요는 정확성, 감도, 다양한 분야에 걸친 용도의 확대에 의해 촉진되고 있다. 정확하고 신뢰할 수 있는 핵산 정량을 제공하는 이 기술의 능력은 진단, 조사, 농업, 환경 검사의 진보에 필수적이며, 그 확산과 디지털 PCR 시장의 성장을 가속하고 있다[5].”고 하였다.

2024년 8월 지속 가능한 개발목표 달성을 위해 새로운 시장, 네트워크 및 협력자와의 혁신을 연결하고 글로벌 시장정보를 제공하고 있는 SkyQuest Technology Consulting Pvt. Ltd.의 “디지털 PCR 시장 규모, 점유율, 성장 분석: 오퍼링별, 최종 사용자별, 용도별, 지역별 - 산업 예측(2024∼2031년)”에 의하면 “세계의 디지털 PCR 시장 규모는 2022년에 68억 3,000만 달러에 달하며, 예측 기간(2024∼2031년)의 CAGR은 9.02%로, 2023년 85억 달러에서 2031년까지는 158억 6,000만 달러로 성장할 전망이다[6].”라고 하였고, 그 배경으로는 “디지털 PCR은 그 정확성과 민감도로 인해 유전자 검사, 질병 진단 및 연구에 필수적인 요소로 자리매김하고 있다. 이 시장은 의료 전문가, 임상 실험실 및 연구자들에게 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공하고, 궁극적으로 환자 치료와 과학의 진보를 강화하는 첨단 분자진단 툴을 제공하는 것을 목표로 한다. 유전성 질환 및 감염성 질환의 발병률 증가, 맞춤형 의료에 대한 수요 증가, 유전체 연구의 발전 등 여러 가지 요인이 시장 확대를 촉진하고 있다[6]. 그러나 디지털 PCR 장비의 높은 가격과 잠재적 사용자들의 낮은 인지도는 여전히 도전과제로 남아있다[6].”라고 분석하였다.

2024년 10월 첨단 기술 동향을 중점적으로 연구하는 리서치 및 자문회사인 BIS Research Inc.의 “디지털 PCR 시장 - 세계 및 지역 분석: 유형, 용도, 최종 사용자 및 국가별 분석 및 예측(2024∼2034년)” 시장보고서에서는 “세계 디지털 PCR 시장 규모는 2023년 6억 7,810만 달러, 2024년 7억 7,620만 달러에서 예측 기간 동안 15.75%의 CAGR로, 성장하여 2034년에는 133억 5,100만 달러 규모로 성장할 것으로 예상된다[7].”라고 하며, 수요 증가의 원인으로 “유전성 질환의 선별 및 진단을 위한 개인 맞춤형 의료의 채택 증가에 기인한다. 이러한 접근법은 환자 개개인의 특성에 맞는 치료를 제공하는데, 디지털 PCR은 다양한 암과 관련된 희귀한 유전자 변이를 검출하고 정량화할 수 있게 해줌으로써 중요한 역할을 하고 있다. 또한, 전염병의 확산으로 인해 의료 서비스 제공업체들이 신속하고 정확한 진단 솔루션을 찾고 있는 것도 디지털 PCR에 대한 수요를 증가시키고 있다[7].”라고 하였다.

글로벌 디지털 PCR 시장에서 가장 큰 점유율을 차지하는 지역은 북미 지역이며, 2024∼2029년 예측 기간에서 가장 빠르게 성장하는 지역은 아시아 태평양 지역으로 추정하고 있다.

이와 같이 대부분의 글로벌 바이오테크놀로지 관련 리서치 자문회사의 시장보고서에는 디지털 PCR이 향후 가장 성장 가능성이 높은 분야 중 하나로 지목하고 있다. 그 이유로 디지털 PCR은 COVID-19 팬데믹과 같은 감염성 질환에 대한 바이러스 양의 모니터링을 통해 대유행 제어전략 안내, 유전성 질환의 선별 및 진단, 개인 맞춤형 의료의 솔루션 증가 및 치료 반응 모니터링, 질병의 조기 발견, 다양한 응용 분야에서 DNA 및 RNA와 같은 핵산의 절대 정량 및 분석을 위한 고정밀 첨단 분자진단학 기술의 수요 증가, 검사 신뢰도에 대한 핵산 정량화의 정확도 향상, 저농도 표적 검출, 유전자 발현 수준 평가, 유전적 돌연변이(mutation) 분석에 대한 신뢰성 향상, 높은 민감도, 액체생검의 수요 증가, 유전체 연구의 눈부신 발전, 환경 모니터링, 의약품 개발 그리고 바이오 제조 공정에서 정확한 정량화 등에서 다른 분자진단학적 검사에 비해 많은 이점을 보이고 있기 때문이라 생각된다.

2. 디지털 polymerase chain reaction의 역사

1992년 Sykes 등[8]에 의해 처음으로 digital PCR (dPCR)로 기술되었다. 그들은 한계 희석(limiting dilution), 종말점 PCR (end-point PCR), 푸아송 통계(Poisson statistics)를 결합하면 핵산 농도의 절대적 측정을 산출할 수 있다는 것을 알아냈으며, 정량적 기술로 확립한 이래로 현재까지 이어져 내려오고 있다[8].

1999년 존스 홉킨스 대학의 Vogelstein과 Kinzler [9]는 단일 템플릿 분자(single template molecules)가 각각 분리된 파티션(partition)에서 개별적으로 증폭할 수 있을 정도로 시료를 희석하고 분할한 후, 형광 프로브를 사용하여 증폭 후 형광 신호가 있는 단일 생성물을 검출 및 분석하는 방법을 개발하는 혁신적인 연구를 수행하였다. 이 새로운 방법(novel method)을 설명하기 위해 “디지털 PCR”이라는 용어가 만들어졌다[10].

2003년 Kinzler와 Vogelstein은 dPCR을 계속 개선하여 BEAMing (beads, emulsion, amplification, and magnetics) 기술이라는 개선된 방법을 개발했다[11]. 새로운 프로토콜은 에멀전(emulsion)을 사용하여 단일 튜브(single tube)에서 증폭반응을 구획화하였다[11].

2006∼2007년 미세유체 칩(microfluidic chip)과 마이크로어레이(microarray)를 기반으로 한 최초의 상용 dPCR 시스템이 출시되었고, 2010년 회전 미세유체 디스크(spinning microfluidic disc)를 사용하는 최초의 상용 dPCR 장비가 출시되었다.

2011년에는 물-오일 에멀전/드롭릿(water-oil emulsion/droplet)을 기반으로 하는 최초의 상용 dPCR 장비가 출시되었으며, 2013년에는 최초의 상용 마이크로플레이트 기반 dPCR 장비가 출시되었다[12]. 2020년에는 최초의 상용 나노플레이트(nanoplate) 기반 dPCR 장비가 출시되었다.

3. 디지털 polymerase chain reaction의 원리 및 특징

오늘날 정밀하고 복잡한 연구를 위해 기존 PCR의 기술을 넘어서는 심도 있는 정보가 필요한데, dPCR은 일상적인 연구 목적과 진단을 위한 간단하고 실용적인 기술이 될 수도 있다.

많은 논문에서 2세대의 qPCR과 3세대의 dPCR을 많이 비교하고 있다. 그 이유 중 하나는 현재 연구실이나 진단을 위한 검사실에서 가장 많이 핵산을 정량화하는 방법이 qPCR이고, 가장 많이 보급되어 있기 때문이다. 각각의 이점(advantage)과 한계(limitation)가 있으며, 일부는 유사한 기능도 존재하기 때문에, 연구자들이나 검사자들은 선택의 어려움을 겪을 수 있다. 표준화되었으며 익숙한 qPCR과, 정밀하고 안정적인 dPCR 중 어떤 정량화된 PCR을 사용하여야 할까? 결론은 연구 및 검사의 목적을 얼마나 효율적으로 달성하고, 어떤 응용 분야에 사용할 것인지 또한 시료 유형, PCR 억제제 존재 여부, 경제적 요인, 속도, 그리고 처리량과 같은 여러 요인에 따라 선택하여야 할 것으로 생각한다. 그러므로 각 방법의 특징과 차이점을 명확히 알고 있어야 한다.

qPCR을 이용한 분석은 오랫동안 유전자 분석을 위한 최적표준법(gold standard)으로 여겨져 왔다. 원리는 시료를 증폭 주기 후 형광 강도를 측정할 때 대조군(참조 곡선[reference curve] 또는 표준곡선)에 대한 표준화가 필요하므로 상대적 정량화만 허용된다. 주기당 Ct 값을 제공하고 Ct의 차이를 사용하여 초기 핵산의 양을 계산한다[13]. 하지만 표적 서열의 초기 농도가 낮을 경우 초기 증폭 사이클이 지수적이지 않을 수 있고, 검출 가능한 수준으로 증폭되지 않는 불확실성을 야기할 수 있으며[10], 증폭 효율(amplification efficiency)의 변화가 qPCR 결과에 영향을 미칠 수 있다[14]. 또한 표적 서열의 PCR 증폭 효율과 참조 물질(reference materials)의 효율이 다를 수 있으며, 참조 샘플을 사용하여 표준곡선을 구성하지 않으면 정확한 양을 측정할 수 없다[14]. 따라서 qPCR은 측정을 달성하는 데 필요한 추정으로 인해 정밀하지 않을 수 있다[15]. dPCR에서 정량화할 수 있는 최대 표적 수가 분할에 의해 제한되기 때문에 동적 범위(dynamic range)를 수행할 수 있는 시료 농도 범위는 qPCR이 dPCR보다 높다[16].

dPCR은 핵산(nucleic acids)에 대하여 정밀하고, 매우 높은 민감도와 정량화를 가능하게 한다. dPCR과 qPCR의 주요 차이는 핵산의 양을 측정하는 방법에 있으며, 같은 성분의 마스터 믹스 용액(master mix solution; buffer, deoxynucleotide triphosphates [dNTP], DNA polymerase, primer, probe)을 제조하고, 시료 내에서 하나의 반응을 수행하는 것은 동일하다. qPCR은 bulk PCR을 수행하지만 dPCR은 시료를 많은 수의 분할로 분리되고, 반응은 각 분할에서 개별적으로 수행된다[17]. 시료를 준비하는 방식은 qPCR과 유사하지만, 증폭 전에 시료를 수천에서 수만 개의 개별 반응으로 나누는 시료 분할은 dPCR의 고유한 특징이다[18]. 분할을 하는 이유는 첫째, 검출 한계(limit of detection, LOD)를 개선하고, 단일 표적 분자를 증폭하여 검출함으로써 유효농도(effective concentration)를 증가하기 위함이다. 둘째, 표적과 배경의 비율을 증가함으로써 농축 효과를 부여하기 위함이다. 셋째, 전체 농도 대비 개별 분자를 측정함으로써 정밀도를 높이고 선형성을 제공하기 위하여 시행한다. 분할의 수가 많을수록 정밀도가 높아지며 동적 범위가 넓어진다[18].

dPCR은 한계 희석과 분할, 종말점 PCR, 그리고 푸아송 통계 분석을 결합하여 핵산 농도를 절대적으로 정량화하는 방법이다[11]. 시료와 마스터 믹스가 혼합된 용액을 nano fluidic PCR 기술을 이용하여 무작위로 나노리터(nanoliter, nL) 크기의 드롭릿(droplet; 여러 문헌에서 “방울, 물방울, 미세 방울, 작은 방울, 그리고 액적” 등의 용어로 표현됨)을 수천∼수십만 개로 분할한다[19]. 분할된 각 드롭릿에서 개별적으로 PCR 증폭반응을 수행한 후[20], 증폭반응이 끝나면 형광 프로브를 사용하여 표적 서열(target sequence)이 증폭된 양성반응(positive reaction) 드롭릿이 “1”로 평가되고, 증폭되지 않은 음성반응(negative reaction) 드롭릿이 “0”으로 평가되는 디지털 시그널(digital signal)인 바이너리 판독값(binary readout)으로 형광을 확인하여 계수하는 기술이다[10]. 이러한 분할을 통해 핵산의 양을 보다 안정적으로 수집(collection)하고 민감하게 측정할 수 있다. “디지털”이란 용어는 일련의 1과 0으로 인코딩된 정보가 있는 논리 회로에서 계산이 수행되는 디지털 컴퓨터에서 유래되었다. 종말점에서 분할된 각 드롭릿에는 0개, 1개 또는 2개 이상의 표적 분자가 포함되어 있다. 디지털 신호의 장점은 기기가 모든 가능성의 범위가 아닌 두 신호만 구별한다. 계수된 신호를 확률론에서 단위시간 안에 어떤 이벤트가 몇 번 발생할 것인지를 표현하는 이산 확률분포인 푸아송 분포를 사용하여 시료 내의 형광을 내는 표적 분자 분포를 정확하게 계수하고 최종적으로 검체 μL당 복제 수로 결괏값을 표적 서열의 절대 정량화로 산출할 수 있다[21].

qPCR과 비교하여 dPCR에서 제공되는 특징들은 (1) 핵산 정량화를 위해 필수적인 표준곡선이나 참조 물질에 의존하지 않고 절대 정량 분석이 가능하다[21, 22]. (2) 분할과 종말점 측정으로 인한 높은 정밀성으로 복잡한 배경에서 희귀 이벤트(rare event)를 검출하는 데 적합하고, 높은 재현성(reproducibility)을 보여준다[13, 20, 23]. qPCR은 유전자 발현의 차이나 2배 미만의 복제 수 변이(copy number variations, CNV)의 차이를 구별할 수 없다. 반면, dPCR은 더 높은 정밀도를 가지고 있으며 유전자 발현의 30% 미만의 차이를 감지하고, 1개의 복제만 다른 복제 수 변이를 구별하며, 0.1% 미만의 빈도로 나타나는 대립유전자(alleles)를 식별하는 것으로 나타났다[22]. (3) qPCR과 비교하여 1,000배 높은 향상된 민감도를 나타내어 표적 핵산 분자의 농도가 낮아도 검출이 가능하다[19, 24]. (4) 낮은 변동계수(coefficient of variation, CV)를 갖기 때문에 PCR 효율에 의해 발생하는 오차가 거의 없어 항상 일정한 결과가 보장된다[19, 25, 26]. (5) dPCR은 종말점 PCR 산물의 증폭을 측정하므로 PCR 억제제(PCR inhibitors)의 존재에 대해 높은 저항성을 갖고 있다. 그리고 프라이머 템플릿 불일치(primer template mismatch)로 인해 증폭 효율이 저하되어 발생하는 아티팩트(artifacts)에 덜 민감하다[22, 27]. (6) 시료 처리량(throughput)은 하루에 처리할 수 있는 고유한 시료의 수로, qPCR의 경우 대량의 유사한 시료가 동일한 프로토콜과 단일 보정(calibration)으로 처리되는 경우 적합하며, dPCR은 서로 다른 시료의 절대 정량화에 적합하여 대량의 시료는 수행하기 어렵다[8, 28]. (7) dPCR은 qPCR의 마스터 믹스(주형 DNA, 형광-퀀처 프로브[fluorescence-quencher probes], 프라이머, DNA 중합효소, dNTP, MgCl₂, 그리고 반응 완충액)로 구성된 TaqMan 분석과 유사하게 제조된다는 점[9]과 사용자 편의성(ease of use)이다.

dPCR의 제한점으로 분할을 위해 복잡한 유체 역학 체계를 사용해야 하므로 프로세스가 더 복잡하고, 드롭릿 크기와 모양의 변동성으로 인해 재현성에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 데이터 품질이 열 진동으로 인한 드롭릿의 융합에 의해 영향을 받을 수 있는 점이다. 손상된 드롭릿은 비특이적 증폭 또는 양성 및 음성 드롭릿을 구분하는 임곗값 설정을 어렵게 만든다. Table 1에서는 qPCR과 dPCR의 특징을 비교하였으며, Table 2에서는 각각의 이점과 한계에 대하여 비교하였다.

Table 1

Comparison of the characteristics for qPCR and dPCR

	qPCR	dPCR
Quantitation	Relative	Absolute
Standard curve	Require	No
Reference	Require	No criteria
PCR reaction	Bulk sample (flexible response volume)	Sample partitioning (droplet individual PCR)
Precision	Middle	High
Sensitivity (%)	0.1∼5	0.01∼1
Inhibitors	Vulnerable	High tolerance
Data collected	Exponential phase	Based on Poisson statistics in end point
Measurement of amplification	Each cycle	End point
Copy number variation	Unsuitable	Suitable
Dynamic range	High	Middle
Reproducibility	Middle	High
Throughout	Wide	Many
Rare target	Impact	No impact
Large volume sample	Suitable	Unsuitable
Multiplexing	Low	High
Ease of use	Require	Little training
Cost	Middle	High

Abbreviations: qPCR, quantitative polymerase chain reaction; dPCR, digital polymerase chain reaction.

Table 2

Benefits and limitations of qPCR and dPCR

	qPCR	dPCR
Benefits	- Wide dynamic range - Suitable for analysis of very large amplicons - Two-fold changes in target concentration can be detected - Fast turnaround time - Low chance of contamination - No post-PCR processing - Established method - Low-priced than dPCR	- Absolute target quantitation - No calibration curves -PCR efficiency is unaffected by differences between calibrant and sample - Improved sensitivity - High precision and reproducibility - Suitable for detection of rare targets - Unaffected by PCR inhibitors - Little training
Limitations	-Relies on standard curves, which add time, cost and adversely affect PCR efficiency - Less precise than dPCR - Sensitive to PCR inhibitors, contaminants, nontarget DNA - Poor interlaboratory data reproducibility - Requires training personnel	- Low dynamic range - Not suitable for very large sample volumes - Could have lower throughput than qPCR - Cause overestimation -Experimental design is more challenging than with endpoint PCR - Expensive

Abbreviations: qPCR, quantitative polymerase chain reaction; dPCR, digital polymerase chain reaction; PCR, polymerase chain reaction.

4. 디지털 polymerase chain reaction의 유형

1) 드롭릿 디지털 polymerase chain reaction (droplet digital PCR, ddPCR)

ddPCR은 기술 발전과 수요 증가에 기인하여 전 세계적으로 가장 많이 판매된 제품이다. 시스템은 드롭릿 생성기(droplet generator), 유전자 증폭기(thermal cycler), 그리고 드롭릿 판독기(droplet reader)로 구성된다. 20 μL 샘플 반응을 물-오일 에멀젼 기반으로 하는 드롭릿 기술이다[17]. 드롭릿 생성기에서 약 20,000개의 nL 크기의 오일 드롭릿(oil droplets)으로 나눈다[29]. 그 후 96웰 PCR 플레이트에서 종말점까지 유전자 증폭 장비를 사용하여 증폭한 후 드롭릿 유세포 분석기(droplet flow cytometer)에서 각 시료 웰의 모든 드롭릿에 대한 형광 진폭(fluorescence amplitude)을 형광 검출기(fluorescence detector)를 통해 판독하는 방법이다[23, 30]. ddPCR 시스템에서 시료 분할은 단일 템플릿 분자의 민감하고 특이적인 검출과, 정확한 정량화를 한다. 동시에 표적 경쟁(target competition)의 영향을 완화하여 PCR 증폭이 억제에 덜 민감하며, 단일 염기서열만 분석의 판별 능력을 크게 향상시킨다. QuantaSoft라는 전용 프로그램을 통해, 드롭릿을 읽어내는 것부터 분석까지 자동으로 진행되며, 별도의 과정 없이 결과를 확인할 수 있다. 최종 결과는 복제 수당 μL의 수치로 각 파장에 따른 유전자의 결과를 확인할 수 있고, FAM/HEX의 비율과 모든 데이터는 엑셀 및 이미지로 옮길 수 있다.

2) 나노플레이트 디지털 polymerase chain reaction PCR (nanoplate digital PCR, ndPCR)

ndPCR과 ddPCR의 가장 큰 차이점은 파티셔닝 분리방식이다. ddPCR은 드롭릿 생성기를 사용하여 파티션을 생성하지만, ndPCR은 디지털 PCR 플레이트를 사용하여 생성된다. 디지털 분석은 96웰 또는 24웰 디지털 PCR 플레이트에서 수행된다. 결과는 전용 소프트웨어에서 분석하며 표적 서열의 μL당 복제 농도와 양성 시료 또는 탬플릿 대조군 없음(no template control, NTC)과 같은 정도관리를 제공한다[31]. 장점은 실행시간이 2시간밖에 걸리지 않으며, 오염의 위험을 줄일 수 있고, 드롭릿과 관련된 크기 및 융합에 대한 가변성이 적다. 장비의 수가 적어 실험실 공간을 많이 차지하지 않는다[31].

3) 칩 기반 디지털 polymerase chain reaction (chip-based digital PCR, cdPCR)

cdPCR은 dPCR 반응 혼합물을 칩에서 나노 크기(nano size)의 10,000∼45,000개 파티션으로 나누어진 후, 종말점 PCR 유전자 증폭 장비를 사용하여 증폭시키고 형광 필터(HEX, FAM, Cy5, Cy5.5 그리고 Texas Red)가 장착된 카메라 판독기(camera reader)를 사용하여 각 칩의 모든 파티션에 대해 형광을 검출하는 dPCR 방법이다. 표적 서열의 복사 수는 제공되는 소프트웨어에서 계산된다[32]. 파티셔닝은 약 1분 정도 소요되며, 자동 로드기(auto-loader)를 사용하여 간편하다. 또한 드롭릿이 항상 채널을 따라 흐르므로 교차오염(cross contamination)을 줄일 수 있으며[32], 실링 인핸서(sealing enhancer)를 사용하여 PCR 반응 동안 증발을 방지할 수 있는 장점이 있다[31].

4) 마이크로어레이 플레이트 디지털 polymerase chain reaction (microarray plate digital PCR, MAP)

이 유형의 dPCR은 미세유체역학 어레이 플레이트(microfluidic array plate) 기술을 기반으로 한 디지털 PCR 플랫폼이며 이 시스템을 통해 구획화, 유전자 증폭, 데이터 획득 등 dPCR에 필요한 모든 단계를 하나의 기기(single instrument)에서 수행할 수 있어 사용이 편리하다[33]. 현미경 슬라이드를 통해 에칭된 20,000개의 웰/파티션으로 구성된 오픈 어레이 플레이트(open-array plate)가 포함되어 있다. 플레이트는 시료를 양쪽에서 밀봉하고 혼합될 수 없는 액체인 오일에 담가 증발이나 교차 오염을 방지한다. 플레이트는 유전자 증폭기에서 종말점 PCR을 수행하며, 별도의 기기에서 분석된다[16, 34]. 단계를 최소화하고, 일관성을 최대화하기 위해 익숙한 qPCR과 동일한 진행절차(workflow)가 적용되었다[10].

5) 칩-인-어-튜브 디지털 polymerase chain reaction (chip-in-a-tube digital PCR)

이 유형의 dPCR은 칩 기반 dPCR과 ddPCR을 결합한 방식이다. dPCR 시스템은 8개의 표준 PCR 튜브를 사용한다. 각 튜브 내부에는 10,000개의 파티션을 포함한 미니어처 사다리꼴 모양(trapezoidal-shaped)의 칩이 들어 있다. dPCR 혼합물이 각 튜브에 첨가되면 모세관 작용에 의해 액체는 파티션 안으로 빠르게 들어간다. 파티션은 실링 용액에 의해 밀봉되고 튜브는 유전자 증폭기에서 PCR을 수행한다. 그 후 튜브-스트립을 전용 리더기에서 판독하여 dPCR 반응의 모든 파티션에서 형광 신호를 동시에 검출한다. 국내 (주)바이오디사에서 이 유형의 원리를 이용하여 Clarity Plus Digital PCR를 출시하였다.

6) 반도체 칩 기반 디지털 polymerase chain reaction (semiconductor chip-based digital PCR)

이 유형의 dPCR은 “lab on an array (LOAA) dPCR”이라고도 한다. LOAA dPCR은 카트리지의 2차원 반도체 칩에서 파티셔닝으로 분리한다. 반도체 플레이트는 micro electro mechanical system (MEMS) 기술을 기반으로 하며, 표적 분자를 56∼ 1,000개의 웰로 나누어 주입할 수 있다. 웰의 수가 증가할수록 웰의 크기는 점차 작은 부피로 분할된다. 표적 핵산의 증폭과 각 웰의 형광분석은 하나의 장치에서 순차적으로 수행된다[34].

7) BEAMing 디지털 polymerase chain reaction (beads, emulsion, amplification, and magnetics digital PCR)

BEAMing은 0.2%의 검출률로 매우 민감한 검사법이며, 비드(beads), 에멀전, 증폭, 그리고 자기(magnetics)의 네 가지 주요 구성요소로 구성된다. 원리는 dPCR과 자기 비드 그리고 유세포분석기를 결합한 것이다[3, 11]. 프라이머는 바이오틴-스트렙토애비딘 복합체(biotin-streptavidin complex)를 형성하는 반응을 사용하여 자성 비드에 결합한다. 미세 에멀전(microemulsion) 내에는 하나 이하의 템플릿 분자와 하나 이하의 비드가 포함되어 있으며, 각 드롭릿 내에서 PCR이 수행된다. PCR 과정이 끝나면 비드가 자기적으로 정제되며, 변성 후 비드를 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션하여 서로 다른 주형을 구별한다. 그 후 결합된 혼성화 프로브에 형광 표지된 항체가 접합된다. 마지막으로 증폭된 생성물은 유세포 분석법에 의해 형광 비드로 계산된다[11]. 그러나 BEAMing 검사법은 복잡한 진행절차와 높은 비용으로 인해 일상적인 임상 용도로는 비현실적이다[35].

5. 디지털 polymerase chain reaction의 응용 분야

dPCR은 기초 연구, 임상 진단, 그리고 환경 테스트 등 다양한 응용 분야에서 중요성이 증가하고 있다. 주요 응용 분야는 다음과 같다.

1) 희귀 서열 검출(rare sequence detection)

시료의 복잡한 배경에서 낮은 농도의 표적 핵산 서열을 정확하게 검출하는 것은 PCR 분석에 있어 어려운 과제이다. qPCR의 경우 정상 유전자의 농도가 높을 경우 저농도 변이 서열의 증폭에 대한 편향(bias)이 종종 관찰되어 저농도의 돌연변이를 검출하는 데 한계가 있다. dPCR은 절대 정량화와 표준곡선이 필요치 않고, 증폭 사이클 수와 무관하기 때문에 희귀 서열 검출의 한계를 극복하고 희귀 표적 농도 측정의 정확도와 재현성 모두를 향상시킬 수 있다. 또한 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP), 대립 유전자 변이, 전좌 변이(allelic variant), 그리고 RNA 편집(edited RNA) 검증[36] 등과 같은 관련 서열을 검출할 때 분할은 풍부한 배경인 야생형(wild-type)과 극소수인 종(species)과의 경쟁을 줄인다. 그 예로 마이크로바이옴(microbiome) 분석은 qPCR에서 저농도 종의 검출은 불충분하였다[37]. dPCR 분석은 경쟁 서열이 전혀 또는 거의 없는 소수의 드롭릿에만 존재하므로 증폭 및 검출의 감지가 용이하고, PCR 억제제에 대한 내성이 높기 때문에 최종 결과에 영향을 미치지 않는다[27]. qPCR 분석은 약 1%의 희귀 표적의 하한선을 보이지만, dPCR은 0.001%의 희귀 표적 서열을 검출할 수 있어, 민감도가 3배 더 높다. dPCR은 1,250,000개 세포 중 1개의 희귀한 서열을 검출할 수 있어 희귀 서열인 낮은 바이러스 부하량 또는 바이크로바이옴 부하량 검출이 가능하다[23].

2) 희귀 돌연변이 검출(rare mutation detection, RMD)

RMD는 야생형 배경에서 매우 낮은 빈도(1% 미만 또는 0.1%)로 존재하는 염기서열 변이를 검출하는 것을 의미한다. 점 돌연변이(point mutations) 또는 단일 염기 다형성과 같은 희귀 이벤트를 검출하고 정량화하기 위해서는 정확하고 민감하며 정밀한 방법이 필요하다[10]. 이는 두 개의 매우 유사한 대립유전자에서 어느 하나의 존재비가 높을 경우 이를 구별하기 위함이다.

dPCR에서 수만 개로 분할하면 정교한 민감도와 우수한 정밀도로 인해 풍부한 야생형 배경에서 경쟁하는 표적 핵산을 분리하여 민감도를 높여 희귀 표적 검출과 단일 뉴클레오타이드 변이의 검출 확률을 크게 향상시키고 정량화할 수 있다[38]. dPCR은 야생형 배경이 200,000배가 많은 상태에서 돌연변이 DNA를 검출할 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 qPCR로 달성할 수 있는 것보다 2,000배 더 민감하다[10]. dPCR은 까다로운 시료에서도 하나의 돌연변이 복제를 찾을 수 있기 때문에 희귀 분자를 검출하고 정량화할 수 있으며 특정 암의 바이오마커 발견, 조기 종양 발견 그리고 치료 반응 모니터링을 위한 새로운 기회를 제공한다[39]. 또한 멀티플렉싱(multiplexing)을 할 수 있는 기능을 통해 단일 시료에서 여러 표적을 동시에 검출할 수 있어 효율성을 향상시키고 이 기술의 진단 잠재력을 확장한다.

dPCR의 높은 민감도와 정밀도로 인해 여러 시점의 낮은 분석 물질 농도에서 암 바이오마커(cancer biomarker)나 미량의 유전적 변이체의 검출에 대한 신뢰도가 높아져 종양혈액학(oncohematology)에서 최소한의 잔류 질환 검출과 같은 응용 분야에 제공된다[40]. 이러한 신뢰성은 특히 환자 치료와 잠재적 재발에 대한 정보에 따라 결정을 내리는 데 유용한 데이터를 제공하며, 일관성이 필수적인 임상 환경에서 매우 중요하다.

3) 복제 수 변이 분석(copy number variation analysis, CNV analysis)

CNV란 참조 유전체(reference genome)에 비해 특정 DNA 분절의 복제 수가 가변적으로 존재하는 경우로, 종 내 개인간의 유전적 다양성에 기여한다[41]. CNV 분석은 개인 지놈에 있는 특정 유전자의 복제 수를 결정하며, 암, 신경계 질환, 그리고 자가면역질환 등 많은 질병과 관련이 있다. 질병 관련 CNV는 유전되거나 새로운 형태로 생성될 수 있다[42]. 최근까지 qPCR 분석과 마이크로 어레이 교잡법(microarray hybridization)이 유전체(genome)의 CNV를 스크리닝하는 데 주로 사용되어 왔다. qPCR에서 CNV를 정확하게 구별하려면 많은 수의 복제가 필요하고, 2배 미만의 복제 수 변이의 차이를 구별할 수 없으며, 증폭 효율에 민감하여 부정확성의 주요 원인이 되어 능력이 제한적이었다[43]. 유전적 다양성(genetic diversity)으로 인한 유전자 중복(amplification), 결손(deletion), 전위(translocation), 역위(inversion) 그리고 점돌연변이[44] 외에도 암의 신호 경로와 관련된 유전자 등에 대해 dPCR은 뛰어난 민감도와 고해상도(high-resolution) 그리고 증폭 효율에 덜 민감하기 때문에 낮은 농도에 대한 복제 수의 변이 검출이 가능하여 내재적 한계를 극복한다[45]. 이런 이점을 이용하여 인간 표피 성장 인자 수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 유전자의 증폭과 유방암 진행 간의 연관성을 연구하는 데 사용되었다[46].

dPCR은 CNV를 프로파일링하는 고처리량(high-throughput) 연구에 매우 적합하고[9, 10], 유전자의 1.2배 변화와 같은 작은 폴드 변화의 검출이 가능하며, 멀티플렉싱(multiplexing) 기능으로 CNV 분석을 할 수 있다[47]. CNV 복제 수의 증가는 암을 유발[48]할 수 있는데, 종양 조직은 주로 formalin fixed paraffin embedded (FFPE) 조직으로 보존된다. FFPE는 PCR 반응을 억제하고 DNA를 손상시키는데 qPCR은 반응 속도의 비교에 의존하기 때문에 복제 수를 결정하는 데 오류가 발생할 수 있다. dPCR 분석은 억제제가 있는 경우에도 정확한 결과를 얻을 수 있으며 품질이 좋지 않은 DNA의 문제를 극복할 수 있다[49]. FFPE 유방 조직에서 HER2에 대한 면역조직화학(immunohistochemistry) 검사와 dPCR 분석은 모두 100% 일치하였다[50].

CNV는 또한 알코올 의존(alcohol dependence)에서 뇌전증(epilepsy)에 이르기까지 다양한 신경 질환에 영향을 미친다[51]. dPCR 기술은 CNV 분석에 필요한 수준의 정밀도와 해상도를 제공하므로, 유전자 좌위의 분석, 신경학적 상태 그리고 잠재적으로 질병 진단의 복제 수의 변화 정량화에 매우 유용할 것이다.

4) 액체생검 검사(liquid biopsy testing)

검사 시 최소한의 위험을 초래하는 액체생검은 체액을 채취하여 분석하는 비침습적(non-invasive) 검사방법으로, 암과 같은 질병의 진단, 치료반응, 그리고 잠재적 치료법에 대한 새로운 내성에 대한 모니터링 도구로 사용되어 왔다[52]. 비침습적 검사는 생검에 위험이 높은 조직과 신체 부위에 특히 유용하다. 혈액, 객담, 소변, 그리고 대변과 같은 체액이 사용되며, 복잡한 배경에서 저농도의 표적을 검출하기 위한 dPCR의 높은 민감도는 증상이 나타나기 전에 질병을 발견하고 조기에 효과적인 치료와 맞춤형 치료를 제공할 수 있다[52].

혈액에서 추출한 무세포 DNA (circulating cell-free DNA, cfDNA)에는 다량의 야생형 세포 외에 극히 미량의 암 등 질병과 관련된 세포가 세포자멸사(apoptosis)나 괴사되었을 때 방출한 DNA의 단편인 순환 종양 DNA (circulation tumor DNA, ctDNA)가 포함되어 있다[33].

기존에는 차세대 염기서열(next-generation sequencing, NGS)이나 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 이용하였지만 ctDNA의 농도가 낮기 때문에 검출한계가 10% 이하로 검출되었다[53]. 낮은 LOD는 잔류 질병 모니터링(residual disease monitoring) 중 재발에 대한 문제를 야기할 수 있다[53].

암 돌연변이에서 방출되는 ctDNA는 기존의 종양 생검에서 진단된 돌연변이를 반영하기 때문에 액체생검은 종양학(oncology) 분야에서 활발히 연구∙개발되어 왔다[54]. 액체생검에서 얻은 검체로부터 ctDNA 단편은 일반적으로 작고 농도가 매우 낮기 때문에, dPCR의 높은 민감도는 ctDNA 연구를 위한 이상적인 도구가 된다. 암 환자의 ctDNA의 희귀 돌연변이, 종양 부하, 잔류 종양 입증, 치료 저항성 돌연변이(treatment-resistant mutations)를 검사하여 치료과정에 따른 반응과 내성 그리고 질병 진행을 모니터링할 수 있고[55], 질병을 추적하는 분자 바이오마커(biomarker)로 사용할 수 있는 비용 효율적이며 신속한 방법이다[23]. 또한 암을 유발하는 유전적 돌연변이를 식별하고 추적하는 데 사용되어 암을 조기 발견하고 정량화할 수 있다. 특히 반복적인 조직 생검이 불가능한 폐암 환자의 경우 연속검사를 진행할 수 있어 임상에서 특히 유용하기 때문에 질병 진단의 범위가 빠르게 확장되고 있다[54].

2016년 Dana-Farber Cancer Institute에서 dPCR을 사용한 전향적 임상시험을 통해 가장 흔한 폐암의 형태인 비소세포 폐암(non-small-cell lung cancer, NSCLC) 환자의 예측 진단(predictive diagnostic) 도구로서 액체 생검의 임상적 이점이 확인되었다[56]. 이를 기점으로 액체생검을 이용하여 유방암(breast cancers)에서 수술 전∙후 ctDNA의 검출[57]과 잔류 종양 검출[58], 대장암(colorectal cancers) [59], 그리고 자가면역반응으로 췌장의 β 세포의 파괴로 인 순환 인슐린 수치가 감소하는 1형 당뇨병(type 1 diabetes)의 조기 검출 및 모니터링[60] 등에 dPCR의 응용이 증가하고 있다.

5) 유전자 발현 및 miRNA 분석(gene expression and miRNA analysis)

유전자 발현 분석의 대부분은 전사(transcription) 수준을 정량화하는 데 초점을 맞추고 있다. RT-qPCR은 상보적 DNA (cDNA)로 역전사하고, mRNA, siRNA, miRNA 등 RNA 표적의 수를 유전자 발현을 정량화하고 검출하는 데 일반적으로 사용된다.

dPCR은 지놈 DNA 메틸화의 검출 및 측정, 절대 정량화를 통한 전사 분석의 민감도 증가, 그리고 혈액과 같은 복잡한 검체에서 빠른 회전율을 보이는 희귀 mRNA 및 miRNA를 정량화하고 검출하는 데 사용되며, 재현성 있는 결과를 제공하고 있다[61]. 임상적으로 혈액에서 순환하는 miRNA는 안정적이며 암을 포함한 질병의 지표로 사용하기에 적합한 것으로 나타났다[62].

6) 병원체 검출 및 감염병 진단(pathogen detection and infectious disease diagnosis)

dPCR을 가장 광범위하게 사용한 분야는 미생물학일 것이다. 마이크로바이옴(microbiome) 분석은, 대부분 생물군에 많은 수의 종과 아종(subspecies)이 있고 종종 지속적으로 변화하는 특성으로 인해 어렵고 노동 집약적일 수 있다. 전염병과 유행성 질병의 유병률이 증가함에 따라 병원균 검출과 마이크로바이옴 검출에 대한 개선 필요성이 강조되고 있다[62].

qPCR은 전통적으로 병원균 검출 분야에서 사용되는 응용 분야에 선호되는 기술이었지만 dPCR은 높은 민감도와 빠른 결과 분석, 복잡한 배경에서 혈액 내 희귀 표적을 증폭하는 능력[63], 휴믹산과 같은 PCR 억제제에 대한 저항성[27], 그리고 절대 정량화는 마이크로바이옴 분석을 개선할 수 있는 공중 보건 및 역학에서 필수적이다. dPCR은 병원체와 마이크로바이옴의 변화를 식별, 검출, 특성화, 그리고 모니터링하는 데 매우 유용하며, 정확한 진단과 적시에 개입할 수 있는 가치 있는 정보를 제공하는 응용 분야에서 중추적인 역할을 한다[64].

dPCR의 응용 분야는 지속적으로 확장되어 식품 안전을 위한 식품 매개 병원균 검출[65], 미생물의 약물 내성(drug resistance), 미생물 유전자형 연구, 항균제 내성 유전자 조사, 바이러스/박테리아-숙주 관계 분석, 그리고 수생 시스템 및 미생물의 생물학적 분해와 같은 환경 분야 등 매우 광범위하게 적용되고 있다[66].

7) 차세대 염기서열 라이브러리 분석(next-generation sequencing library analysis, NGS library analysis)

DNA 염기서열 분석은 DNA 가닥의 뉴클레오타이드 순서를 결정하는 과정이다. NGS는 한 번의 실행으로 전체 지놈(full genome), 전체 엑소좀(full exome), 전사체(transcriptome), 그리고 표적 유전자 영역의 염기서열 분석에 사용된다[67]. NGS 라이브러리의 준비는 표적 DNA (genomic 또는 cDNA)의 단편화로 시작된다. 이어서 DNA 단편을 올리고뉴클레오타이드와 연결한 후 PCR로 증폭하면 모든 서열이 겹치는 PCR 산물에 여러 번 표시된다. 시퀀싱 후 라이브러리의 판독값이 정렬되고 조립된다.

시퀀싱 실행에 과도한 라이브러리를 추가하면 데이터를 해결할 수 없거나, 일부 NGS 기술에서 신호가 혼합될 수 있으며, 충분하지 않으면 희귀 표적에 대한 검출이 손상되거나 시퀀스에 공백이 발생할 수 있으므로, 최적의 시퀀싱 실행을 위해서는 정확한 정량화가 필수적이다[68]. dPCR 분석은 참조 표준물질과 표준곡선을 사용하지 않고 NGS 라이브러리의 절대 정량화를 통해 정확도를 더욱 높일 수 있기 때문에 서열 분석결과의 검증을 위한 연구에 이상적이며 NGS와 보완적이기 때문에 자주 이용된다[69]. dPCR은 NGS 진행절차의 효율성을 개선하고 시퀀싱 데이터를 검증하는 데 있어 가치가 있다. dPCR의 가장 특징 중 하나인 동적 분할(dynamic partitioning) 기능으로 증폭 전에 PCR 반응을 분할하여 많은 개별 앰플리콘에서 보다 균일한 증폭을 제공함으로써 개선된 NGS를 달성할 수 있다[69].

8) 식품 및 환경 모니터링(food & environmental monitoring)

qPCR에 비해 억제제에 대한 내성이 향상된 dPCR은 유전자 변형 유기체(genetically modified organism, GMO) [70], 식품의 오염 식별 검사, 식수에서 분변 오염[27], 그리고 토양과 폐수(wastewater) 또는 하수(sewage) 내 특정 미생물 및 바이러스 병원체 검출[66] 등의 다양한 환경 응용 분야에서 핵산 추출을 정확하게 정량하여 희귀 표적을 검출할 수 있다. 높은 정확도로 인해 사전 배양 없이 복잡한 환경 시료를 분석할 수 있는 dPCR은 환경 모니터링에 중요한 용도로 사용되고 있다.

6. 디지털 polymerase chain reaction 판매 기업(digital polymerase chain reaction sales companies

dPCR은 기존 기술을 개선함으로써 발전된 생명공학 기술이다. 팬데믹이었던 COVID-19을 겪으면서 연구 개발 활동이 증가하고, 혁신적인 장치를 도입하면서 향후 dPCR의 시장 성장이 촉진될 것으로 전망된다. 공공기관보다는 민간업체에 의해 주도되어 개발되고 있으며, Bio-Rad Laboratories, Inc., Thermo Fisher Scientific Inc., Sysmex Corporation, JN Medsys, 그리고 Fluidigm Corporation은 글로벌 dPCR 시장에서 운영되는 주요 회사이다.

dPCR 기기 및 키트를 판매하는 기업 중 시장에서 주요 점유율을 차지한 회사는 Bio-Rad Laboratories, Inc., ThermoFisher Scientific Inc., 그리고 Qiagen의 3사로, 2024년까지 Bio-Rad Laboratories, Inc.가 가장 높은 시장 점유율로 시장을 장악했다. 그 외 Stilla Technologies, Sysmex Corporation, JN Medsys 그리고 Standard BioTools Inc. (Fluidigm Corporation)가 있다. dPCR과 관련된 기기를 판매하고 있는 글로벌 기업(Table 3)과 국내 기업(Table 4)을 소개하였다.

Table 3

The global digital PCR companies

Corporations	Nations	Products	Types
Bio-Rad Laboratories, Inc.	USA	QX200 Droplet Digital PCR System	Droplet digital PCR
ThermoFisher Scientific Inc.	USA	Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q Digital PCR System	Microarray plate digital PCR
Qiagen	Germany	QIACuity One 5plex Digital PCR System	Nanoplate digital PCR
Stilla Technologies	France	NioTM Digital PCR System and naica® system	Microfluidic chips digital PCR
Sysmex Corporation	Japan	OncoBEAMTM System	BEAMing technology
Standard BioTools Inc.	USA	Biomark X9TM System	Microfluidic chips digital PCR
JN Medsys	Singapore	ClarityTM Digital PCR System	Chip-in-a-tube technology
Precigenome LLC.	USA	DropDx digital PCR System	Droplet digital PCR
Fluidigm Corporation	USA	Biomark X9TM System	Microfluidic chips digital PCR
Roche Diagnostics	USA	Digital LightCycler Analyze	Chip-based digital PCR
RainDance	USA	RainDrop	BEAMing technology

Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; BEAMing, beads, emulsion, amplification, and magnetics.

Table 4

The digital PCR companies in Korea

Corporations	Products	Number of partition	Types
BioTNS	MiKro dPCR Droplet Generator and MiKro dPCR Droplet Analyzer	20,000	Droplet digital PCR
RevoSketch	DigiQuark	100,000	3.5 Generation digital PCR: droplet digital PCR (use of centrifugal force)
Optolane	GenoplexoTM chip	Do not open	LOAA analyzer; semiconductor chip-based dPCR
BioD	Clarity Plus Digital PCR	45,000	Chip-in-a-tube technology

Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; dPCR, digital polymerase chain reaction; LOAA, lab on an array; ETRI, Electronics and Telecommunications Research Institute.

dPCR은 의학, 생명공학, 제약계, 그리고 산업계에 이르기까지 모든 실험실에서 빠르게 주류 기술로 자리 잡고 있다. dPCR 시장은 제품 유형(dPCR 장비, 소모품, 시약, 소프트웨어 그리고 서비스), 애플리케이션(임상 진단, 연구 및 기타 애플리케이션) 그리고 지리적(북미, 유럽, 아시아 태평양, 중동 및 아프리카, 남미) 요인에 기인한다. 미국이 포함된 북미는 높은 만성 질환 유병률, 확립된 의료 인프라와 같은 요인으로 인해 dPCR의 전체 시장을 지배할 것으로 예상된다. 특히 미국은 지원적인 의료 정책, 유전 공학 및 지놈 연구의 증가 추세, 많은 환자 수 그리고 발전된 의료 시장으로 인해 최대 점유율을 차지한다.

dPCR 성장이 증가하게 될 배경으로 분할이라는 고유한 기능으로 기존의 qPCR보다 정밀도와 민감도에서 뛰어나기 때문이다. 감염병에 대한 유병률의 증가, 만성질환의 증가, 잠복 감염의 조기 검출, 유방암 등을 검출하기 위한 액체생검과 같이 미량의 DNA 유전자 돌연변이를 조기에 정확하게 감별, 유전자 바이오마커(genetic biomarker), 희귀 돌연변이의 정확한 정량화, 이수성(aneuploidy)에 대한 태아 검사의 개선, 예방적 진단 도구의 개발, 개인 맞춤형 약물 투여를 위한 약리유전체학(pharmacogenomics) 연구 촉진, 질환의 치료 반응 모니터링, 그리고 개인 맞춤형 의학과 정밀 종양학 분야 등에 있어 의미 있는 임상적 이점을 제공하므로 필요성은 지속적으로 증가할 것으로 예상한다.

dPCR 채택의 제한 요인으로 고가의 장비 비용과 높은 장비의 유지∙보수 비용으로, 이는 개발도상국의 시장을 제약하고 대중화를 제약하는 큰 요인이다. dPCR 기기는 정교한 기술과 기기가 필요하며, 미세유체 칩이나 드롭릿 생성기와 같은 특수 부품들은 제조 비용 상승의 원인이 된다. 또한 다른 정밀도와 민감도가 높은 분자생물학적 진단 기법의 개발과 존재로 시장 성장이 제한될 수도 있다. 숙련된 전문가의 양성이 실패하면 개발도상국에서는 dPCR의 채택이 생기지 않을 수 있다.

하지만 임상 진단, 개인 맞춤형 의학 그리고 감염병 감시 분야에서 dPCR의 높은 정밀도, 높은 민감도, 그리고 매우 다양한 응용 분야는 dPCR 영역의 지속적인 기술 발전과 혁신으로 인해 성장의 핵심 동력이 되고 있다.

qPCR에서 dPCR로 전환에는 고려해야 할 몇 가지 요소가 있다. qPCR과 dPCR은 프라이머, 프로브, DNA 결합 염료, 프라이머 및 프로브 디자인 등 기본적인 화학물질 대부분이 유사하다. 하지만 다음 사항들은 고려하여야 한다. 첫째, dPCR 시스템에 특화된 dMIOE (digital Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)를 준수하여야 하며, 둘째, 분석이 dMIQE 지침을 충족하는지 확인하고, 게시된 프라이머의 특이성을 확인하여야 한다. 셋째로, 프라이머는 전문 소프트웨어로 설계하고, ≥150 bp의 앰플리콘을 생성하여야 하며, 30%∼70% GC 함량을 갖는 18∼30개 뉴클레오타이드 길이이어야 한다. 또한 용융온도는 58℃∼62℃이고 반복적인 서열, 3'-말단 교차 상보성, 프라이머 내 또는 프라이머 간 교차 상보성, 3'템플릿 불일치, 3'말단에 ≥3 G 또는 C, 프라이머 결합 부위에 특이적으로 2차 구조를 형성하는 영역이 없어야 한다. 셋째로, 프로브 디자인은 전문 소프트웨어로 설계하고, 프로브의 용융 온도는 프라이머의 용융 온도보다 8℃∼10℃ 높아야 한다. 프로브의 5'-말단에 G가 없고 ≥4 G 뉴클레오타이드도 없어야 하며, 프로브가 프라이머와 상보적이지 않고, G 염기보다 C 염기가 더 많도록 결합 가닥을 사용하여야 한다.

향후 분자 진단을 위해 dPCR을 선택하여야 하는 이유로 첫째, 핵산을 정밀하게 정량화하여 연구자와 임상의가 확신을 갖고 결과를 해석할 수 있는 정확성, 둘째, 임상 및 연구 환경에서 정보에 입각한 의사 결정에 매우 중요한 신뢰성(reliablility), 셋째, 종양학에서 감염성 질환에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 다양한 진단과제를 해결하는 데 유연성을 제공하는 광범위한 응용 분야, 그리고 넷째로, 최신 기술 발전을 진단 진행절차에 통합하여 분자 진단의 선두 주자가 될 수 있는 혁신(innovation)이라 할 수 있다.

디지털 polymerase chain reaction (PCR)은 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 정밀하게 정량화할 수 있는 고급 분자 생물학 기술로, 기존의 실시간 PCR (quantitative PCR [qPCR]) 방법보다 크게 개선되었다. 상대적 정량화를 제공하는 qPCR과 달리 digital PCR (dPCR)은 시료를 수만 개의 개별 반응으로 분할하여 절대 정량화를 제공하므로 풍부한 야생형 배경 속에 저농도의 표적을 검출할 수 있다. 이 기술은 PCR 억제제의 효과를 최소화하며, 희귀 서열 검출, 희귀 변이 검출, 복제 수 변이 분석, 액체 생검 검사, 유전자 발현 및 RNA 분석, 병원체 검출 및 감염병 진단, 차세대 염기서열 라이브러리 분석, 그리고 식품 및 환경 모니터링의 응용 분야에서 특히 유용하다. 낮은 빈도의 돌연변이와 복제 수 변화를 감지하는 기능 덕분에 dPCR은 개인 맞춤형 의학 및 암 연구에서 강력한 도구가 되었다. 이 종설 논문에서는 dPCR의 시장, 역사, 원리, 유형, 응용 분야, qPCR과 dPCR의 비교, 그리고 기업에 대하여 소개한다. 기술이 계속 발전함에 따라 dPCR은 복잡한 생물학적 시스템에 대한 이해를 높이고 환자 결과를 개선하는 데 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.

None

This research was supported by Hyejeon College grant.

None

Lee D, Professor.

The article is prepared by a single author.

This article does not require IRB/IACUC approval because there are no human and animal participants.