조직병리검사란 인체에서 발생하는 각종 질환이나 질병의 원인, 기전과 그로 인해 변형된 조직의 병적인 조직형태를 분석하여 질병을 진단하고 연구하는 검사이다[1-3].
생체를 이루고 있는 세포들은 각각의 목적에 따라 기능을 수행하기 위해 고유한 형태와 구조로 되어 있으며, 세포들의 정상 형태와 고유구조의 변화는 질병의 경과상에서도 큰 의미가 있다[4, 5]. 따라서 조직병리학적 검사는 여러 조직의 고유한 구조를 유지하여 검사하는 것이 매우 중요하다[2, 3].
일반적인 조직표본이란 생검, 절제 그리고 수술 등으로 적출된 생체조직을 고정한 후 여러 조직처리과정을 거쳐 현미경으로 볼 수 있도록 제작한 표본을 말한다. 조직병리검사에 있어서 최상의 조직표본이란 조직의 구조적, 화학적 변화가 최소화된 표본이다[6]. 생체로부터 분리된 조직은 세포 내 활성과정의 중단으로 인해 pH가 감소하여 용해소체에서 유출된 가수분해효소의 작용으로 자가융해(autolysis)가 발생하고, 그 후 미생물이 증식하여 부패(microbial putrefaction)가 일어나 형태, 구조 및 성분 등의 변화가 발생한다. 이러한 조직의 변화를 사후변화(postmortem changes)라 한다. 이러한 사후변화를 방지하고, 살아있는 상태의 조직과 최대한 같은 구조를 유지하도록 화학적 또는 물리적으로 처리하는 과정을 고정이라고 한다[7, 8].
고정작용은, 조직표본의 염색성뿐만 아니라 진단을 위한 여러 조직검사에도 영향을 미치기 때문에 매우 중요하다[3, 9-12].
고정제 및 고정과정에 대한 접근은 지금까지 많은 선행연구가 진행되었으며 고정제가 작용하는 다양한 기전이 밝혀져 왔다[13, 14]. 고정은 크게 가열, 동결건조, 극초단파 고정과 같은 물리적인 방법과 고정제를 이용한 화학적 방법으로 나눌 수 있다. 현재 일반적으로 조직진단 검사과정에 널리 사용되고 있는 고정제는 10% Neutral Buffer Formalin (NBF)이다[8, 15].
고정에 영향을 미치는 조건으로 알려져 있는 것은 조직의 크기, pH 그리고 고정의 시간과 온도 등이 있다. 조직의 크기는 클수록 고정속도가 느려지며, pH는 생체와 같은 pH 7에서 가장 잘 고정된다. 고정시간은 길수록, 온도는 높을수록 고정력이 좋은 것으로 알려져 있다[3, 16]. 하지만 고정력이 좋다고 하여 조직을 이용한 모든 검사항목에 좋은 것은 아니다. 예를 들어 과고정이 되면 DNA의 손상으로 핵산을 이용한 분자검사에는 적절하지 않다는 연구를 찾아볼 수 있다[10].
고정에 널리 사용되고 있는 10% NBF는 실온에서 시간당 1 mm의 침투력을 가지는 것으로 알려져 있다[11, 14]. 고정력은 여러 가지 조건에 의해 영향을 받는다. 하지만 이러한 고정조건의 차이가 병리진단을 위한 검사에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 실험논문은 많지 않다. 또한 단독의 고정조건 변경에 따른 단독검사의 차이를 다루고 있는 논문들을 찾아볼 수 있으나 여러 조건을 변경하여 실험한 논문은 찾아보기가 힘들다. 따라서 본 연구에서는 조직 검사를 위한 파라핀 블록 제작과정에 영향을 주는 고정조건을 종합하여 변경해보고 해당 조건이 조직의 염색성과 조직의 DNA purity에 어떠한 영향을 주는지, 그리고 어떠한 조건에 더 영향을 많이 받는지 확인해 보려고 한다.
또한 조건별 고정 정도의 차이는 각 세포의 고유 특성에 따라서도 다르게 나타난다[17-19]. 따라서 특성이 다른 두 가지의 장기를 설정하여 실험을 진행하였다. 대상 조직으로는 실질장기인 간조직과 점막을 포함하는 장관조직(colon, small intestine)으로 설정하였다. 일반적 조직 염색인 hematoxylin-eosin (H&E) 염색[20]과 각 장기의 특성을 평가할 수 있는 특수염색을 시행하여 염색성을 평가하였다. H&E 염색은 세포의 핵과 세포질을 구분하여 염색해 세포의 형태 및 수를 확인하여 암을 진단하기 위해 제작된 모든 formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) 블록에 시행되는 염색이다. 특수염색으로 liver는 간조직의 구조와 간세포의 배열을 보기 위한 reticulin 염색[21]을 시행하였고, 위장관 조직은 점막의 mucin을 염색하여 위장관 조직의 기능을 평가하기 위해 시행하는 periodic acid–Schiff (PAS) 염색을 시행하였다[22].
또한 고정의 정도는 유전정보를 이용하는 분자병리검사에도 영향을 준다고 알려져 있다. 핵산의 경우 고정시간이 길어질수록 DNA의 보존 정도나 품질이 떨어지는 것으로 확인된 선행연구들을 찾아볼 수 있다[10, 23].
이에 본 실험에서는 고정에 영향을 미치는 인자들 중 시간과 온도에 변화를 주고, 이를 각각 다른 특성을 가진 두 종류의 조직에 적용하여 염색성을 확인하였다. 그리고 DNA의 보존성을 확인하여 각각의 검사에 고정조건이 어떠한 영향을 주는지 확인하였다. 이 실험을 통해 각 조직이 고정시간과 온도 중 어떠한 조건에 영향을 더 많이 받는지 확인해보고자 한다.
병리과에 의뢰되는 검체 중 실질장기와 다른 고유기능을 가지고 있는 점막을 포함하고 있는 장기를 검체로 선정하였다. 실질장기로는 liver를, mucosa를 포함하고 있는 장기로는 colon과 small intestine을 선정하여 진행하였고, 해당 실험은 서울대학교의과대학/서울대학교병원 의학연구윤리심의위원회의 IRB 승인을 받아 진행하였다(IRB No. 2109-155-1258).
검체는 염색성 및 DNA quality 평가에 용이할 수 있도록 정상조직을 이용하였다.
병리과에 의뢰되는 검체 중 대상에 해당하는 검체가 접수되면 확인 후 정상 조직을 정형화한 크기에 맞추어 절취하였다. 각 장기의 크기는 liver 1×1×1 cm, intestine 2×2 cm로 정형화하였다.
고정액은 10% NBF를 이용하였다. 고정액의 양은 조직크기의 20배 이상인 50 mL로 설정하였다[23]. 절취된 검체는 각각의 조건하에 고정을 진행하였다. 고정조건은 온도 4℃, 25℃ 그리고 50℃에서 각각 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 그리고 24시간 진행하였다.
실질장기인 liver의 경우 단면을 내어 육안상 고정액이 침투한 부분까지의 깊이를 mm로 측정하였다. 장관조직인 colon과 small intestine의 경우에는 육안으로 확인이 불가하기 때문에 측정하지 않았다.
각각의 조건으로 고정된 조직은 자동침투기 PELORIS Rapid Tissue Processor (Leica)에서 탈수-투명-침투 과정을 거쳐 HistoStarTM Embedding Workstation (Thermo scientific)에서 paraffin으로 포매하여 permanent block을 제작하였다. 검사의 재현성을 위해 각 조건별 2 case 이상의 블럭을 제작하였다. 각 조건에 따라 제작된 FFPE 블록 개수는 다음과 같다(Table 1). 제작된 permanent block을 검사 목적에 따라 H&E 염색을 위한 조직표본의 두께는 3.5 µm, DNA 측정을 위한 paraffin section은 10 µm 1장으로 제작하였다.
A number of sample
1 h | 2 h | 4 h | 8 h | 24 h | |
---|---|---|---|---|---|
Liver | |||||
4℃ | 2 | 3 | 2 | 2 | 3 |
25℃ | 2 | 3 | 2 | 2 | 3 |
50℃ | 2 | 3 | 2 | 2 | 3 |
Intestine | |||||
4℃ | 3 | 5 | 2 | 3 | 2 |
25℃ | 4 | 5 | 2 | 3 | 3 |
50℃ | 3 | 5 | 2 | 3 | 2 |
H&E 염색은 Dako CoverStainer (Agilent)를 사용하였으며 진행과정은 Table S1에 나타내었다.
Reticulin 염색은 BenchMark Special Stains (Roche) 장비를 사용하였고, 해당 사의 Reticulum II staining Kit를 이용하여 염색을 진행하였으며 그 순서는 Table S2에 나타내었다.
PAS 염색은 BenchMark Special Stains (Roche) 장비를 사용하였고 해당 사의 PAS staining Kit를 이용하여 염색을 진행하였으며, 그 순서는 Table S3에 나타내었다.
실질장기인 liver의 경우 H&E 염색 및 특수염색인 reticulin 염색을 시행하여 육안상 고정액의 침투 정도를 기반으로 조직의 구조적 차이, 세포 괴사 여부 및 염색성의 차이를 평가하였다. 점막 부위를 포함하고 있는 intestine의 경우는 H&E 염색과 PAS 염색을 종합하여 mucosal change, proper muscle layer degeneration 두 가지 항목을 설정하여, 그 정도를 반정량적으로 0∼3점으로 척도화하여 평가하였다(Figure 1). 이는 곧 점수가 높을수록 변화가 큰 것으로, 고정력이 좋지 않음을 나타낸다. 해당 평가는 병리의사가 수행하였다.
10 µm로 제작된 파라핀 section 1장을 Maxwell CSC Instrument (Promega)를 사용하여 제조사의 진행 과정에 따라 DNA를 추출하였다. 해당 진행 과정에는 Maxwell FFPE Plus Kit (Promega)를 사용하였다. Incubation buffer를 이용하여 FFPE sample을 전처리 한 후 Maxwell CSC FFPE DNA 시약을 사용하였다. 추출된 DNA는 농도(ng/µL) 및 purity를 측정하였다. 해당 과정에는 Nanodrop 1000 Spectrophotpmeter (Thermo scientific)을 사용하였으며 purity는 A260/A280 비의 측정을 통해 이루어졌다. 추출된 DNA는 ‒80℃ deepfreezer (Thermo scientific)에 보관하였다.
추출된 DNA가 깨지지 않고 완전한 상태로 추출되었는지를 확인하기 위해 DNA integrity number (DIN)를 측정하였다. DNA 완전성 평가는 Genomic DNA ScreeTape (Agilent)를 사용하여 DIN값을 측정하였다. 완전한 DNA는 DIN10으로 표시되며 DNA가 분해되면 DIN값이 낮아지고 완전히 분해된 DNA는 DIN1로 표시된다. DIN의 측정은 TapeStation (Agilent) 제조사의 진행 과정에 따라 진행하였다.
통계분석은 SPSS 25.0 Software (IBM Corp.)를 이용하였다. 또한 각각의 조건에 대한 샘플의 수가 많지 않아 비모수 검정(Kruskal–Wallis test)을 이용하여 분석하였다.
Liver의 육안상 침투율의 경우 고정조건별 각 case의 평균값을 확인하였을 때 시간당 침투율은 각각 4℃에서 0.35 mm, 25℃에서 0.48 mm, 50℃에서 0.56 mm으로 나타났다(Figure 2). 온도가 높을수록, 고정시간이 길어질수록 육안상 침투력은 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
Liver의 경우 H&E 염색 및 특수염색인 reticulin 염색을 종합하여 육안상 고정액의 침투 정도를 기반으로 조직의 구조적 차이 및 염색성의 차이를 평가하여 보았다.
각각의 온도와 시간별로 나누어 제작된 조직 슬라이드를 검경하였을 때 육안상 고정액의 침투율과는 달리 H&E 염색 슬라이드에서 현미경상의 조직형태학적 차이는 관찰되지 않았다(Figure 3). 특수염색인 reticulin 염색 슬라이드에서는 모든 그룹에서 시간이 길어질수록 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였으나 미미하였다(Figure 4).
H&E 염색과 PAS 염색을 종합하여 mucosal change, proper muscle layer degeneration 소견 두 가지 항목을 반정량적으로 1, 2, 3점으로 나누어 병리의사가 평가하였다.
이를 평가한 결과 mucosal change 평가점수는 각 온도에서 고정시간에 따라 4℃에서 1시간 고정한 경우 1.0±0.0, 2시간 고정한 경우 0.8±0.5, 4시간 고정한 경우 0.5±0.7, 8시간 고정한 경우 0.6±0.6 그리고 24시간 고정한 경우 0.0±0.0 (P=0.219)으로 나타났고 같은 시간에서 각각 측정한 결과 25℃에서는 1.5±1.3, 1.0±0.7, 1.8±0.0, 0.5±0.75, 1.0±1.0 그리고 0.6±0.5 (P=0.754)로, 50℃에서는 1.3±1.5, 1.4±0.5, 1.0±1.5, 1.3±1.1 그리고 0.5±0.7 (P=0.806)로 평가되었다(Figures 5, 6).
Proper muscle layer degeneration 평가점수는 각 온도에서 고정시간에 따라 4℃에서 1시간 고정한 경우 1.3±0.5, 2시간 고정한 경우 0.8±0.8, 4시간 고정한 경우 1.0±0.0, 8시간 고정한 경우 0.5±0.7 그리고 24시간 고정한 경우 1.0±0.0 (P=0.626)으로 나타났고, 같은 시간에서 각각 측정한 결과 25℃에서는 1.7±0.6, 1.4±0.5, 1.6±0.6, 1.0±0.0 그리고 1.6±1.1 (P=0.690), 50℃에서는 1.0±1.4, 1.2±0.8, 2.0±1.0, 1.3±0.6 그리고 1.5±0.7 (P=0.853)로 평가되었다(Figure 7).
각 온도에서 시간에 따라 mucosal change와 proper muscle layer degeneration 평가점수 모두가 유의한 결과를 나타내지는 않았으나 각 온도에서 시간이 길수록, 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 확인할 수 있었다. 유의한 결과를 나타내지는 않았다.
그룹별 조직에서 DNA를 추출하여 A260/A280 비의 측정을 통해 purity를 측정한 결과 liver는 4℃에서 1시간 고정한 경우 1.77±0.01, 2시간 고정한 경우 1.80±0.05, 4시간 고정한 경우 1.60±0.18, 8시간 고정한 경우 1.72±0.05 그리고 24시간 고정한 경우 1.50±0.11로 나타났고(P=0.039), 같은 시간에서 각각 측정한 결과 25℃에서는 1.56±0.06, 1.67±0.05, 1.73±0.15, 1.76±0.09 그리고 1.65±0.02로(P=0.196), 50℃에서는 1.72±0.08, 1.68±0.09, 1.70±0.01, 1.71±0.08 그리고 1.73±0.11로 나타났다(P=0.991).
Intestine은 4℃에서 1시간 고정한 경우 1.71±0.08, 2시간 고정한 경우 1.55±0.23, 4시간 고정한 경우 1.75±0.00, 8시간 고정한 경우 1.73±0.05 그리고 24시간 고정한 경우 1.77±0.08로 나타났고(P=0.307), 같은 시간에서 각각 측정한 결과 25℃에서는 1.62±0.19, 1.71±0.24, 1.79±0.05, 1.74±0.06 (P=0.535) 그리고 1.76±0.05로, 50℃에서는 1.79±0.12, 1.74±0.08, 1.75±0.01, 1.74±0.02 그리고 1.70±0.08로 나타났다(P=0.885) (Table 2). DNA purity 측정 결과 liver와 intestine 모두에서 같은 온도조건의 시간에 따른 purity 값의 유의한 차이는 볼 수 없었다.
Result of DNA purity
A260/A280 ratio | |||||
---|---|---|---|---|---|
1 h | 2 h | 4 h | 8 h | 24 h | |
Liver | |||||
4℃ | 1.77±0.01 | 1.80±0.05 | 1.60±0.18 | 1.72±0.05 | 1.50±0.11 |
25℃ | 1.56±0.06 | 1.67±0.05 | 1.73±0.15 | 1.76±0.10 | 1.65±0.02 |
50℃ | 1.72±0.08 | 1.68±0.08 | 1.70±0.08 | 1.71±0.08 | 1.73±0.11 |
Intestine | |||||
4℃ | 1.71±0.08 | 1.55±0.23 | 1.75±0.00 | 1.73±0.05 | 1.77±0.08 |
25℃ | 1.62±0.19 | 1.71±0.24 | 1.79±0.05 | 1.74±0.06 | 1.76±0.05 |
50℃ | 1.79±0.12 | 1.74±0.08 | 1.75±0.01 | 1.74±0.02 | 1.70±0.08 |
그룹별 조직에서 추출된 DNA로 DIN을 측정한 결과 liver는 4℃에서 1시간 고정한 경우 6.15±0.07, 2시간 고정한 경우 6.63±0.31, 4시간 고정한 경우 6.40±0.42, 8시간 고정한 경우 4.65±0.64 그리고 24시간 고정한 경우 4.06±1.42로 나타났고(P=0.055) 같은 시간에서 각각 측정한 결과 25℃는 6.75±0.21, 5.73±1.42, 4.95±1.63, 4.7±0.57 그리고 2.1±1.10 (P=0.094)로, 50℃에서는 6.3±0.28, 5.93±0.49, 3.1±0.42, 4.00±0.28 그리고 1.47±0.72로 나타났다(P=0.037) (Figure 8).
Intestine은 4℃에서 1시간 고정한 경우 6.97±0.15, 2시간 고정한 경우 6.74±0.60, 4시간 고정한 경우 6.75±0.50, 8시간 고정한 경우 6.20±0.20 그리고 24시간 고정한 경우 2.60±0.70으로 나타났고(P=0.078) 같은 시간에서 각각 측정한 결과 25℃는 7.17±0.22, 6.70±0.56, 5.70±0.85, 4.80±0.76 그리고 2.63±1.13 (P=0.010)으로, 50℃에서는 6.5±0.44, 5.18±0.81, 3.55±0.35, 2.60±0.46 그리고 1.90±0.28로 나타났다(P=0.012) (Figure 9).
Liver의 경우 모든 온도에서 고정시간에 따른 DIN 값의 유의한 차이를 보지 못했으나 24시간에서 가장 낮은 DIN 값을 확인할 수 있었다. Intestine에서는 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 DIN 값이 낮아지는 경향을 확인할 수 있었다. 25℃와 50℃에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
병리검사에 널리 사용되고 있는 고정액인 10% NBF는 이론상 실온에서 1시간에 1 mm 침투하는 것으로 알려져 있다. 하지만 고정은 조직의 특성, 시간, 온도, pH 등 여러 가지 조건에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있어 이를 일반화하기는 힘들다고 생각하였다. 본 실험은 이와 같은 이론을 확인해보고 3가지의 고정조건 변경에 따른 검사결과의 차이를 확인하고자 시행하였다.
조건은 검사실에서 현실적으로 변경 가능한 조직의 종류, 고정의 온도와 시간이었다. 이에 따른 육안상 고정액의 침투 정도와 현미경하에서 염색성을 평가하고 DNA purity 및 integrity number 측정을 통해 보존성 차이를 평가하였다.
본 실험에서 침투력을 확인해본 결과 실온에서 시간당 침투력은 0.48 mm로 확인되었다. 실험에 사용한 liver의 크기로는 실온에서 5시간이면 완전히 고정액이 침투되어야 한다. 하지만 확인해본 결과 모든 온도에서 8시간 이후에도 완전한 침투를 확인할 수 없었다. 이는 고정액의 침투력 또한 고정조건 및 환경에 영향을 받음을 확인할 수 있는 결과였다. 염색성 평가의 결과 liver의 경우 육안상 고정액 침투력의 차이를 보여 염색성의 차이를 기대하였으나 H&E 염색 및 특수염색을 종합하여 염색성을 평가하였을 때 histology상에는 큰 영향이 없는 것으로 확인되었다. 모든 온도조건에서 시간이 길수록 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였으나 차이가 미미하였고 histology상에는 큰 영향이 없는 것으로 확인되었다. 이는 고정 후 FFPE 블록 제작까지의 시간이 길지 않았기 때문에 어느 정도 신선한 상태로 제작되어 histology상 차이가 크게 보이지 않았다고 생각된다. 점막조직인 intestine (colon, small intestine)의 염색성은 H&E 염색 및 특수염색 소견에서 mucosal change, proper muscle layer degeneration은 통계적으로 유의한 차이는 없었으나 고정시간이 길수록 mucosal change와 proper muscle layer degeneration의 정도가 적으며, 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였다. 통계적으로 유의한 차이는 아니었다. 모든 항목에서 온도에 따른 차이는 거의 보이지 않았다.
두 가지 조직 모두에서 고정시간과 온도에 따른 염색성은 유의한 차이는 아니었으나 고정시간이 길어질수록 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였다. 따라서 염색성은 온도보다 시간의 영향이 큰 것으로 보였다. 모든 염색성은 진단 가능한 범위 내 염색성이었다.
DNA 보존성을 평가한 결과 liver는 DNA purity 값의 고정의 온도나 시간에 따라 큰 차이가 없었다. 이 또한 염색성과 마찬가지로 수술 후 FFPE 블록을 제작하기까지의 검사실의 turnaround time이 길지 않아 큰 차이가 없는 것으로 보인다. DIN을 확인하여 보았을 때 유의한 차이를 보지 못했으나, 고정시간이 길수록 DIN 값이 낮아지는 경향을 보였고, 모든 온도에서 24시간 고정한 조직의 DIN 값이 가장 낮게 나타났다. Intestine은 liver와 마찬가지로 DNA purity에는 큰 차이를 보이지 않았으나 DIN 값은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 DIN 값이 낮아지는 경향을 보였으며, 25℃에서와 50℃에서는 유의한 차이를 확인할 수 있었다. 4℃에서 유의한 차이를 보지 못했다는 것은 점막조직은 25℃와 50℃보다 4℃에서 autolysis가 더디게 진행되기 때문에 조직의 변화가 적은 것으로 생각된다. 즉 냉장에서 짧은 시간 고정을 진행한 것이 점막조직의 DNA 손상이 최소화되었음을 확인하였다.
DNA 보존성은 2가지 조직 모두에서 purity에는 차이가 없었으나 DIN 값의 차이를 확인할 수 있었다. liver에서는 모든 온도에서 24시간 고정, 즉 과고정 시 DIN 값이 가장 낮았고, intestine에서는 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 DIN 값이 낮아졌으며, 역시 24시간에서 가장 낮은 DIN 값을 나타냈다. 즉 고정시간이 길어질수록 DNA가 분해되어 안정성이 떨어지는 것을 볼 수 있었고, 따라서 과고정된 검체는 분자병리검사에 부적합한 것을 확인했다. 통계적으로 유의한 차이는 intestine에서만 보였다. 이를 통해 DNA 보존성은 점막조직이 영향을 더 많이 받으며 온도와 시간 모두의 영향을 받으나 두 가지 조직 모두에서 차이가 확인된 시간의 영향이 더 큰 것을 볼 수 있었다.
따라서 본 연구에서는 염색성에는 고정의 온도보다 시간의 영향이 더 있음을 볼 수 있었고, DNA 보존성 또한 시간의 영향이 더 크며, 고정시간이 길어질수록 DIN 값이 떨어지는 경향을 확인하였다. Intestine의 25℃와 50℃에서 유의한 DIN 값의 감소를 확인하였다. 즉 조직특성에 따라 고정조건에 받는 영향이 다르며 실질장기보다 점막을 포함하고 있는 장기가 조직검사 진행에 있어 고정의 영향을 더 많이 받는 것을 확인하였다.
본 실험을 진행함에 있어서 한계점들도 있었다. 먼저 모든 조직에서 수술 종료 후 검체 접수까지의 시간이 다르므로, 더 정확한 실험을 위해서는 이 또한 고려하여 연구를 진행할 필요가 있다. 또한 염색성 평가의 경우 liver는 육안상 정상실질로 확인되어도, 환자에 따라 현미경하에서 실질특성의 차이가 있으므로 정상실질 판독상 fatty change, inflammation, fibrosis 등의 비슷한 특성의 환자들을 추가하여 추후 재평가함이 필요할 것으로 생각된다. Intestine의 경우 colon과 small intestine이 이용되었다. 일반적으로 small intestine이 colon보다 mucin이 많아 특수염색인 PAS 염색이 더 진하게 나타난다. 따라서 정확한 평가를 위해서는 한 가지의 조직을 이용해 경향을 더 정확하게 파악함이 필요하다. 또한 DNA 보존성 평가에서는 시간에 따른 경향과 최적의 조건을 파악할 수 있었다. 하지만 보다 정확한 평가를 위해서는 같은 조건의 충분한 수의 sample을 추가하여 후속연구를 진행해야 할 필요가 있을 것으로 생각된다. 또한 낮은 온도조건을 추가로 설정하여 실험한다면 분자병리검사를 시행함에 있어 보다 나은 DNA quality를 위한 고정조건 설정에 도움이 될 것으로 생각된다.
이러한 부분들을 보완하여 후속연구를 진행한다면 모든 조직검사에 효율적인 조직 블럭을 제작하기 위한 고정조건을 설정에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구는 일반적으로 조직검사에 사용되는 고정액인 10% NBF를 이용한 고정과정에 시간과 온도의 변화를 주어 다른 특성을 가진 실질장기와 장관조직에 적용하여 보았고, 각 조건에 따른 염색성과, DNA 보존성을 분석하여 평가하였다. 염색성은 고정시간이 길어질수록 진한 경향을 보였으나 DNA 보존성은 시간이 길수록 떨어지는 것을 확인하였다. 유의한 값은 intestine의 DIN 값에서 볼 수 있었다. 즉 고정조건은 온도보다 시간의 영향이 있음을 볼 수 있었고, DNA 보존성은 4℃에서 가장 좋음을 확인하였다. 또한 조직에 따라 고정에 받는 영향이 다름을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 후속 연구를 진행한다면, 본 연구 결과는 향후 조직검사 목적이나 진단을 위한 검사 중요도에 따른 최적의 고정조건설정에 기초적인 자료로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
병리과의 조직병리검사에서 진단까지의 과정 중 가장 초기단계이자 기본이 되는 과정은 고정이다. 고정은 진단을 위해 생체로부터 떼어낸 조직을 생체와 같은 구조로 유지하기 위해 실행하는 과정이다. 고정에는 영향을 미치는 여러 가지 요인이 있다. 조직의 종류에 따른 특성, 고정의 시간, 온도, pH 등이 이에 해당한다. 따라서 본 논문에서는 이러한 요인들 중 조직 종류, 시간과 온도에 변화를 주어 고정을 진행하고, 각 조건에 따른 염색성과 DNA 보존성을 평가하여 고정의 조건이 검사에 어떠한 영향을 미치며 어떠한 인자의 영향이 더 큰지 확인해 보고자 시행하였다. 고정은 4℃ (냉장), 25℃ (실온), 50℃ (oven)에서 각각 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 그리고 24시간 진행하였고 24시간은 과고정 상태를 확인하기 위해 설정하였다. 조직의 종류는 특성에 따라 실질장기와 점막층을 포함하고 있는 장관조직으로 선정하였다. 실질장기로는 liver를 장관조직에는 colon과 small intestine을 함께 사용하였다. 염색성 H&E 염색과 각 장기의 특성에 맞는 특수염색을 종합하여 평가하였다. 특수염색으로 liver는 reticulin 염색, intestine은 periodic-acid–Schiff (PAS) 염색을 시행하였으며 liver의 조직형태학적 변화와 염색성, 장관조직의 mucosal change, proper muscle layer degeneration으로 염색성을 확인하였다. DNA 보존성 평가는 DNA purity 측정 후 안정성 확인을 위해 DNA integrity number (DIN)를 평가하였다. 그 결과 염색성 평가의 경우 liver는 현미경하에서 조직형태학적 차이는 관찰되지 않았으며, 모든 온도에서 시간이 길수록 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였다. Intestine은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 mucosal change, proper muscle layer degeneration의 정도가 적었으며, PAS 염색성이 상대적으로 진해지는 경향을 보였다. DNA 보존성 평가는 liver의 경우 purity의 차이는 거의 없었으며 DIN 값은 모든 온도에서 가장 오랜 시간 고정한 조건에서 가장 낮은 값을 나타냈다. Intestine은 purity의 차이는 거의 없었으며 DIN 값은 모든 온도에서 고정시간이 길어질수록 DIN 값이 낮아졌다. 유의한 차이는 25℃와 50℃에서 확인되었다. 이는 4℃에서 DNA가 가장 안전하게 고정됨을 의미한다. 본 실험을 통해 고정은 염색성과 DNA 보존성 모두에서 시간과 온도조건 중 시간의 영향이 더 있음을 확인할 수 있었고, 점막을 포함하고 있는 조직이 고정조건에 더 민감하며, 4℃에서 DNA가 안정하게 고정되는 것으로 평가되었다. 추후 고정조건을 추가적으로 설정하고 한계점을 보완하여 연구를 진행한다면, 본 연구 결과는 향후 조직병리검사의 목적이나 진단을 위한 고정조건설정에 관한 연구에 기초적인 자료로 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
Supplementary data can be found with this article online at https://doi.org/10.15324/kjcls.2024.56.3.217.
kjcls-56-3-217-supple.pdfThis article is a condensed form of the first author’s master’s thesis from Korea University.
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Jeong D, Clinical laboratory technologist.
The article is prepared by a single author.
All procedures were performed in accordance with protocols approved by the Seoul National University College of Medicine, Seoul National University Hospital (Approval numbers: H-2109-155-1258).