그람음성균(Gram-negative bacteria)의 세포 외막은 인지질(phospholipids)과 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)로 이루어진 비대칭적 이중막으로 되어있다[1]. LPS는 고정영역(anchoring region)인 lipid A와 중간 영역인 중심 다당류(core oligosaccharide) 및 최외각 영역인 O-antigen (O-specific polysaccharide)으로 이루어져 있고, 환경적 위협에 대한 보호막 및 장벽의 역할을 한다[2, 3]. 엔도톡신(endotoxin)으로 알려진 lipid A는 세포 외막의 바깥쪽 단일막(outer monolayer)을 구성하고 있는 당지질로써 두 개의 인산화된 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)에 여러 개의 포화지방산이 연결된 구조를 가지고 있다[4]. Lipid A는 병원성을 갖는 물질로 그람음성균의 세포막 손상에 의해 사람의 혈액 내로 다량의 LPS가 노출될 경우 lipid A에 의해 생체내의 과도한 면역반응이 일어나 고열, 패혈증(sepsis) 및 독성쇼크증후군(toxic shock syndrome) 등이 유발되는 것으로 알려져 있다[5, 6].

엔도톡신을 검출할 수 있는 방법은 토끼를 이용한 발열성물질시험(rabbit pyrogen test)과 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate, LAL) 시약을 사용한 엔도톡신 시험으로 나눌 수 있다[7, 8]. 발열성물질시험은 토끼의 정맥에 시험물질을 투여하여 발열여부를 확인하는 시험법으로 정량평가가 어렵고 시간과 비용이 많이 드는 단점이 있으며, 최근 실험동물의 보호와 윤리적인 취급 문제로 인해 동물 대체 시험법으로 전환되고 있다. LAL시험은 발열성물질시험을 대신하여 미국 식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)으로부터 승인을 받은 in vitro 검사법으로 투구게(Limulus polyphemus)의 혈액세포(amebocytes) 추출성분이 LPS와 민감하게 반응하는 원리를 이용한 시험법이다[9, 10]. LAL시험은 발열성물질시험보다 검사시간이 짧고 감도가 우수하며 정량이 가능한 장점이 있어 주사제, 의료기기 및 생물학적제제의 엔도톡신 검출시험에 주로 사용된다[11, 12]. 하지만 LAL 시약의 수요 증가에 따라 투구게의 남획으로 개체수가 급격히 감소하여 투구게가 멸종 위기종으로 구분됨에 따라 LAL 반응의 시작 물질인 factor C를 유전공학기술(genetic engineering techniques)을 이용하여 생산된 재조합 factor C (recombinant factor C)를 사용한 LAL 시험법도 개발되어 대체시험으로 인정받고 있다[13, 14]. 최근 국내에서도 유전자재조합 시약을 이용한 엔도톡신 시험법이 동물 대체 엔도톡신 시험법으로 대한민국약전의 일반정보에 등재되어 앞으로 활용도가 증가할 것으로 사료된다.

진단용 방사성의약품은 fluorine-18 (¹⁸F), carbon-11 (¹¹C), gallium-68 (⁶⁸Ga)과 같이 방사선을 방출하는 방사성동위원소를 포도당, 펩타이드, 저분자화합물 등에 화학적으로 합성한 의약품이다[15, 16]. 진단용 방사성의약품은 체내에 투여된 후 표지 물질의 생리 활성에 따라 특정 조직이나 장기로 분포된 후 이들로부터 방출되는 방사선을 양전자방출단층촬영(positron emission tomography)기기 등의 의료영상장비를 사용하여 병변의 위치와 대사변화를 영상으로 평가하여 질병을 진단할 수 있다[17]. 진단용 방사성의약품은 화학반응으로 합성되기 때문에 의약품 내 다양한 반응간섭인자가 존재할 수 있지만 이들이 엔도톡신 시험에 끼치는 영향에 대한 연구는 미흡하다. 이에 본 연구에서는 진단용 방사성의약품 내 엔도톡신 시험에 영향을 줄 수 있는 반응간섭인자를 파악하고, 이들 반응간섭인자가 겔 응고 LAL시험(gel-clot LAL test) 및 비색 LAL시험(chromogenic LAL test)에 미치는 영향 및 허용범위를 평가하였다. 또한 유전자재조합 시약을 이용한 엔도톡신 시험법을 방사성의약품에 적용하여 기존 시험법과의 차이를 확인하고자 하였다.

1.재료

에탄올(ethanol), 아세토니트릴(acetonitrile), 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 1 N 염산 용액, 1 N 수산화나트륨 용액은 Sigma-Aldrich사에서 구매하였고, 생리식염수 및 주사용수는 대한약품공업에서 구매하였다. 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)는 GERBU Biotechnik GmbH사의 제품을 사용하였다. 겔 응고 LAL시험을 위해 Charles River Laboratories사의 Endosafe^Ⓡ Gel-clot LAL 시약[분석감도 0.125 endotoxin unit (EU)/mL]을 사용하였고, 비색 LAL시험을 위해 Charles River Laboratories사의 분광광도계(spectrophotometer) Endosafe^Ⓡ Nexgen-PTS^TM (version V11.1.0)와 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge 및 Endosafe^Ⓡ trillium^Ⓡ Recombinant Cascade Reagent (rCR) cartridge (이하 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge)를 사용하였다. Endosafe^Ⓡ cartridge는 분석 감도가 5∼0.05 EU/mL인 제품을 사용하였고, Charles River Laboratories Korea로부터 제공받아 사용하였다.

2.방사성의약품의 합성

Ga-68 에도트레오타이드(⁶⁸Ga-DOTATOC) 주사액은 BIK Therapeutics사의 BIKBox^Ⓡ 자동합성장치와 ⁶⁸Ga-DOTATOC BIKBox^Ⓡ 카세트를 사용하여 합성하였다. ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터는 iThemba LABS사의 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga generator (50 mCi) 제품을 사용하였다. 먼저 카세트를 BIKBox^Ⓡ 자동합성장치에 장착한 후 주사용수로 희석한 전구체와 2.7 M HEPES 바이알 및 용리액 바이알을 카세트에 설치하였다. 전구체와 HEPES 완충액을 반응용기로 이송한 후 2.5 mL의 0.6 N 염산(Rotem Industries)을 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga generator에 흘려주어 용출된 ⁶⁸Ga 용액을 반응용기로 이동하였다. 혼합액을 100℃에서 7분간 표지반응 후 반응 용기를 55℃ 이하로 냉각시킨 다음 혼합액을 증류수 3 mL와 희석한 후 Sep-Pak^Ⓡ plus light C18 cartridge (Waters)에 통과시켰다. 주사용수를 사용하여 Sep-Pak^Ⓡ C18 cartridge를 세척하여 불순물을 제거한 후 Sep-Pak^Ⓡ C18 cartridge에 흡착된 ⁶⁸Ga-DOTATOC을 1 mL의 용리액(50% 에탄올/생리식염수 v/v)으로 통과시킨 후 생리식염수 9 mL로 희석한 다음 0.2 μm 멸균필터를 통과시켜 합성을 완료하였다.

방사성의약품 내 HEPES의 잔존량은 Waters사의 Alliance e2695 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하여 역상 HPLC 컬럼(ZORBAX SB-Aq, 4.6×150 mm, 5 μm; Agilent Technologies)에 이동상으로 15 mM 포름산암모늄(ammonium formate)을 1 mL/min의 유속으로 흘려주어 분석하였다. 잔존 에탄올의 양은 Agilent Technologies사의 7890A 가스크로마토그래피(gas chromatography)기기를 사용하였고, 컬럼은 DB-624 (Agilent Technologies)를 사용하여 분석하였다.

3.엔도톡신 시험

겔 응고 LAL시험을 위해 투구게 혈액세포 추출성분으로 만든 Endosafe^Ⓡ Gel-clot LAL 시약을 검액과 섞은 후 가열기(heating block)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 양성대조군은 표준 엔도톡신 시약(control standard endotoxin)을 엔도톡신 시험용 물(LAL reagent water, Charles River Laboratories)로 희석하여 Endosafe^Ⓡ Gel-clot LAL 시약의 분석감도의 20배에 해당되는 2.5 EU/mL의 농도로 제작하여 사용하였다. 음성대조군으로 엔도톡신 시험용 물만 사용하여 반응하였다. 시험결과는 대한민국약전 일반 시험법에 따라 반응 후 반응용기를 180°로 회전하여 관찰하였을 때 견고한 겔이 형성되었을 경우 양성으로 판정하였고, 겔이 형성되지 않거나 형성된 겔이 흘러내릴 경우 음성으로 판정하였다. 만약 시험군과 양성대조군 모두 겔 형성이 되지 않는 경우 반응간섭인자에 의해 겔 형성 LAL 반응이 저해된 것으로 판단하였다.

비색 LAL시험을 위해 투구게 혈액세포 추출성분으로 만든 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 유전자재조합 시약으로 만든 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge를 사용하여 Endosafe^Ⓡ Nexgen-PTS^TM로 분석하였다(Figure 1A). 두 카트리지는 LAL 시약, 발색 기질(chromogenic substrate) 및 표준 엔도톡신 시약이 내장되어 있고 검량선 정보도 내장되어 있어 간편하게 사용할 수 있고 15분 이내에 결과를 알 수 있는 장점이 있다. 먼저 카트리지를 Endosafe^Ⓡ Nexgen-PTS^TM에 장착한 후 카트리지 로트번호, 검량선 정보가 포함된 검교정 코드(calibration code), 희석배수 및 샘플정보를 기입하였다. 마이크로 피펫을 사용하여 카트리지의 샘플 주입구에 검액을 25 μL씩 주입한 후 분석을 시작하였다. 검사완료 후 결과보고서에서 회수율(spike recovery)이 50%에서 200%의 범위에 있을 경우 검액에 반응간섭인자가 존재하지 않는다고 판정하였고, 양성대조군 반응시간(spike channel reaction time)과 샘플 반응시간(sample channel reaction time)의 변동계수(coefficient of variation)가 25% 미만일 경우 반응이 잘 수행되었다고 판단하였다. 검액 시험 전 사용한 카트리지에 내장된 검량선의 신뢰성을 확인하기 위하여 엔도톡신 시험용 물로 예비시험을 실시하였다(Figure 1B). 모든 시험은 대한민국약전 일반 시험법의 엔도톡신 시험법에 따라 2회 이상 반복 측정하여 평가하였다.

Fig. 1. (A) Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate (LAL) portable endotoxin detection system and four-channel LAL reagent Endosafe^Ⓡ cartridge. The Endosafe^Ⓡ cartridge contains standard endotoxin (spike), LAL reagent, and chromogenic substrate. (B) The complete test report of the Endosafe^Ⓡ endotoxin testing system.

4.반응간섭인자용 시험용액 제조

반응간섭인자 시험을 위하여 엔도톡신 시험용 물과 0.1 N 염산 및 0.1 N 수산화나트륨을 사용하여 pH 2, 3, 4, 8, 10의 시험용액을 제작하였다. 용액의 pH는 Mettler-Toledo사의 pH 측정기 S220 모델을 사용하여 확인하였다. 유기용매에 의한 반응간섭 영향을 평가하기 위하여 에탄올을 엔도톡신 시험용 물에 희석하여 0.5%, 1%, 2%, 4% (v/v) 에탄올 용액을 제작하였고, 엔도톡신 시험용 물을 사용하여 0.041% (v/v) 아세토니트릴 용액과 0.5% (v/v) 다이메틸 설폭사이드 용액을 제작하였다. 완충용액의 농도에 따른 반응간섭 영향을 평가하기 위해 HEPES를 엔도톡신 시험용 물에 녹여 20 μg/mL, 200 μg/mL, 2,000 μg/mL의 농도로 시험용액를 제작하였다. 반응간섭인자용 시험용액 제조 시 엔도톡신의 오염에 의한 위양성 결과를 방지하기 위해 엔도톡신이 제거된 피펫 팁과 초자기구를 사용하였다. 또한 시험결과에 대한 신뢰성 확보를 위해 검교정이 완료된 pH 측정기와 Endosafe^Ⓡ Nexgen-PTS^TM를 사용하여 분석하였다.

1.방사성의약품 내 반응간섭인자 평가

⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액 내 반응간섭인자를 확인하기 위하여 방사성의약품의 pH, 잔류용매시험, 화학적 이물시험을 실시하였다. ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액의 pH는 약 4로 측정되었고, 가스크로마토그래피로 잔류용매를 분석 시 에탄올의 함량은 5.8%±0.5%로 측정되었으며, HPLC로 화학적 이물을 분석하였을 때 HEPES는 10∼50 μg/mL로 측정되었다(N=5) (Table 1).

Table 1

The test results of interfering factors in ⁶⁸Ga-DOTATOC injection

Test	Method	Acceptance criteria	Result
pH	pH meter	4∼8	4
Chemical purity	HPLC	HEPES<200 μg/V	10∼50 μg/mL
Residual solvents	Gas chromatography	Ethanol: ≤10% (v/v)	5.8%±0.5%

Abbreviations: HPLC, high-performance liquid chromatography; HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; V, maximum recommended dose in milliliters; v, volume.

⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액의 엔도톡신 시험으로 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험을 실시하였다(Table 2). 겔 응고 LAL시험 결과 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액은 gel-clot LAL 시약에서 겔 형성이 관찰되지 않았고 엔도톡신 용액을 사용한 양성대조군에서도 겔 형성이 관찰되지 않아 반응간섭인자에 의해 LAL 반응이 저해되었음을 확인하였다. 비색 LAL 시험법으로 검액을 시험하기 전 엔도톡신 시험용 물로 예비시험을 실시한 결과 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율은 각각 119%±5.3% (N=3)와 127%±2.5% (N=3)로 측정되었다. ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액의 비색 LAL시험에서는 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge 모두 회수율이 0% 미만으로 측정되어 부적합으로 판정되었다. 하지만 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액을 주사용수를 사용하여 10배로 희석한 후 재분석 하였을 때 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge의 회수율은 101.3%±4.9% (N=3)로 측정되었으며, Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율은 106.3%±2.1% (N=3)로 측정되었다. 방사성의약품을 검액으로 사용한 모든 시험에서 엔도톡신의 농도는 0.05 EU/mL 미만으로 측정되었으며, 양성대조군 반응시간과 샘플 반응시간의 변동계수 값은 모두 0%로 측정되어 시험이 적합하게 수행되었음을 확인하였다.

Table 2

Bacterial endotoxin test of ⁶⁸Ga-DOTATOC injection

Method	Gel-clot method			Chromogenic method
				EndosafeⓇ LAL cartridge			EndosafeⓇ rCR cartridge
Dilution factor	Sample solution	PPC	Endotoxin value (EU/mL)	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability
1:1	‒	‒	Invalid	<0	<0.500	Fail	<0	<0.500	Fail
1:10	‒	‒	Invalid	101.3±4.9	<0.500	Pass	106.3±2.1	<0.500	Pass
1:20	‒	+	<0.125	111.0±2.8	<0.500	Pass	136.5±2.1	<0.500	Pass
1:100	‒	+	<0.125	132.5±2.1	<0.500	Pass	177.5±3.5	<0.500	Pass

Abbreviations: LAL, Limulus Amebocyte Lysate; rCR, recombinant cascade reagent; PPC, positive product control; EU, endotoxin unit; +, firm gel formed; ‒, no gel formed.

2.pH에 의한 간섭 영향

pH가 반응간섭인자로 엔도톡신 시험에 미치는 영향을 확인하기 위하여 pH 2, 3, 4, 8, 10의 시험용액을 사용하여 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험을 실시하였다(Table 3). 겔 응고 LAL시험에서 pH가 3에서 8 사이인 시험용액 모두 gel-clot LAL 시약에서 겔 형성이 관찰되지 않았지만 양성대조군에서는 겔 형성이 관찰되었다. 하지만 pH 2의 시험용액에서는 시험군과 양성대조군 모두 겔 형성이 관찰되지 않았고, pH 10에서는 시험군과 양성대조군 모두 겔형성이 관찰되어 pH 2와 pH 10에서는 LAL 반응 시 각각 위음성과 위양성이 나타나는 것을 확인하였다.

Table 3

Interfering effects of pH on the endotoxin test

Method	Gel-clot method			Chromogenic method
				EndosafeⓇ LAL cartridge			EndosafeⓇ rCR cartridge
	Sample solution	PPC	Endotoxin value (EU/mL)	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability
pH 2	‒	‒	Invalid	<0	<0.500	Fail	<1	<0.500	Fail
pH 3	‒	+	<0.125	82.5±0.7	<0.500	Pass	137.0±7.1	<0.500	Pass
pH 4	‒	+	<0.125	104.5±3.5	<0.500	Pass	144.0±5.7	<0.500	Pass
pH 8	‒	+	<0.125	92.5±0.7	<0.500	Pass	137.0±4.2	<0.500	Pass
pH 10	+	+	Invalid	111.0±2.8	<0.500	Pass	162.5±6.4	<0.500	Pass

Abbreviations: LAL, Limulus Amebocyte Lysate; rCR, recombinant cascade reagent; PPC, positive product control; EU, endotoxin unit; +, firm gel formed; ‒, no gel formed.

비색 LAL시험에서는 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge 모두 pH 3 이상의 시험용액의 회수율은 정상범위에 포함되어 적합으로 판정되었지만 pH 2의 시험용액은 회수율이 1% 이하로 측정되어 부적합으로 판정되었다. 모든 시험에서 양성대조군 반응시간과 샘플 반응시간의 변동계수 값이 0%로 측정되어 시험과정을 신뢰할 수 있었고 엔도톡신의 농도는 0.05 EU/mL 미만으로 측정되었다.

3.유기용매에 의한 간섭 영향

LAL시험에서 유기용매가 반응간섭인자로 미치는 영향을 확인하기 위하여 0.5%, 1%, 2%, 4%의 에탄올 용액으로 엔도톡신 시험을 실시하였다(Table 4). 겔 응고 LAL시험을 시행한 결과 2% 이상의 에탄올 용액은 시험군과 양성대조군 모두 겔이 형성되지 않아 LAL 반응이 저해되는 것을 확인하였다. 하지만 1% 이하의 에탄올 용액은 gel-clot LAL 시약에서 겔이 형성 되지 않았지만 양성대조군에서는 겔이 형성되어 LAL 반응에 간섭을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 그리고 0.041% 아세토니트릴 용액과 0.5% 다이메틸 설폭사이드 용액 모두 gel-clot LAL 시약에서 겔이 형성 되지 않았지만 양성대조군에서는 겔이 형성이 관찰되어 두 농도에서는 간섭 영향이 없음을 확인하였다.

Table 4

Interfering effects of organic solvent on the endotoxin test

Method	Gel-clot method			Chromogenic method
				EndosafeⓇ LAL cartridge			EndosafeⓇ rCR cartridge
	Sample solution	PPC	Endotoxin value (EU/mL)	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability
EtOH 0.5%	‒	+	<0.125	109.0±1.4	<0.500	Pass	92.5±3.5	<0.500	Pass
EtOH 1%	‒	+	<0.125	67.3±4.0	<0.500	Pass	59.7±10.0	<0.500	Pass
EtOH 2%	‒	‒	Invalid	23.0±2.8	<0.500	Fail	16.5±2.1	<0.500	Fail
EtOH 4%	‒	‒	Invalid	<0	<0.500	Fail	<1	<0.500	Fail
ACN 0.041%	‒	+	<0.125	144.5±4.9	<0.500	Pass	151.5±4.9	<0.500	Pass
DMSO 0.5%	‒	+	<0.125	94.0±1.4	<0.500	Pass	120.5±0.7	<0.500	Pass

Abbreviations: LAL, Limulus Amebocyte Lysate; rCR, recombinant cascade reagent; PPC, positive product control; EU, endotoxin unit; EtOH, ethanol; ACN, acetonitrile; DMSO, dimethyl sulfoxide; +, firm gel formed; ‒, no gel formed.

비색 LAL시험에서는 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge 모두 2% 이상의 에탄올 용액에서는 회수율이 정상범위를 벗어나 부적합으로 판정되었다. 하지만 1% 이하의 농도에서 두 종류의 카트리지 모두 회수율이 정상범위 내에 포함되어 적합으로 판정되었다. 다만 0.5% 에탄올 용액의 회수율은 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge 모두 90% 이상이었지만, 1% 에탄올 용액의 경우 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge는 회수율은 67.3%±4.0% (N=3)였으며, Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율은 59.7%±10.0% (N=3)로 측정되었다. 0.041% 아세토니트릴 용액과 0.5% 다이메틸 설폭사이드 용액의 경우 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge 두 카트리지 모두 회수율이 모두 정상범위 내에 포함되어 적합으로 판정되었다. 모든 시험에서 양성대조군 반응시간과 샘플 반응시간의 변동계수 값은 0%로 시험과정이 적합하게 수행되었음을 확인하였다.

4.완충용액에 의한 간섭 영향

LAL시험에서 완충용액이 반응간섭인자로 시험결과에 미치는 영향을 확인하기 위하여 20 μg/mL, 200 μg/mL 및 2,000 μg/mL의 HEPES 용액으로 엔도톡신 시험을 실시하였다(Table 5). 겔 응고 LAL시험 시 모든 농도구간의 시험용액에서 겔 형성이 관찰되지 않았지만 양성대조군에서는 겔 형성이 관찰되어 HEPES는 2,000 μg/mL에서도 겔 형성 LAL 반응이 저해되지 않음을 확인하였다.

Table 5

Interfering effects of HEPES buffer concentration on the endotoxin test

Method	Gel-clot method			Chromogenic method
				EndosafeⓇ LAL cartridge			EndosafeⓇ rCR cartridge
	Sample solution	PPC	Endotoxin value (EU/mL)	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability	Spike recovery (%)	Endotoxin value (EU/mL)	Test suitability
20 μg/mL	‒	+	<0.125	104.0±1.4	<0.500	Pass	143.0±9.8	<0.500	Pass
200 μg/mL	‒	+	<0.125	94.5±2.1	<0.500	Pass	158.0±1.4	<0.500	Pass
2,000 μg/mL	‒	+	<0.125	94.0±1.4	<0.500	Pass	130.0±2.8	<0.500	Pass

Abbreviations: HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; LAL, Limulus Amebocyte Lysate; rCR, recombinant cascade reagent; PPC, positive product control; EU, endotoxin unit; +, firm gel formed; ‒, no gel formed.

비색 LAL 시험법 결과 또한 겔 응고 LAL시험의 결과와 동일하게 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge 모두 2,000 μg/mL 농도까지 회수율이 정상범위 내에 포함되어 적합으로 판정되었으며, 엔도톡신의 농도도 0.05 EU/mL 미만으로 측정되었다. 또한, 양성대조군 반응시간과 샘플 반응시간의 변동계수 값도 0%로 측정되어 시험과정은 적합하게 수행되었음을 확인하였다. 다만 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율은 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge보다 전반적으로 높게 측정되었다.

외상손상, 호흡기 등으로 그람음성균의 직접적인 침입에 의한 감염 외에 엔도톡신이 인체 내 감염되는 경로는 주로 오염된 의료장치나 비경구 의약품의 사용에 의해 발생된다. 특히, 정맥내로 투여되는 주사제나 이식 의료기기 및 심혈관계, 림프계, 중추신경계 등에 직간접적으로 접촉하는 의료기기에 엔도톡신이 오염될 경우 환자에게 심각한 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 엔도톡신 오염의 허용 수준은 규정으로 엄격하게 제한하고 있다. 정상인의 혈장에는 약 0.01∼0.5 EU/mL의 엔도톡신이 존재하는데[18], FDA는 의료기기의 경우 용출액 내 검출될 수 있는 엔도톡신 농도를 0.5 EU/mL 미만으로 제한하고 뇌척수액과 접촉하는 제품인 경우 0.06 EU/mL로 제한하며, 근육이나 정맥으로 투여되는 주사제는 5 EU/kg/hour로 허용기준을 설정하고 있다[19]. 진단용 방사성의약품은 주사제의 형태로 제조되어 혈관 내로 단회 투여 되므로 엔도톡신의 허용기준은 175 EU/V [V: 유효시간 내 투여되는 최대 부피(mL)] 미만으로 제한하고 있다[20, 21]. 특히, 진단용 방사성의약품은 유기용매와 완충용액 등을 사용하여 방사성동위원소를 생물학적 활성을 갖는 물질에 화학적인 표지반응을 통해 제조되기 때문에 다양한 반응간섭물질이 의약품 내 포함될 수 있다. 이에 본 연구에서는 진단용 방사성의약품 내 존재하는 반응간섭인자들이 엔도톡신 시험에 끼치는 영향에 대해 분석하고자 하였다.

1956년 Bang [22]은 투구게의 혈액이 그람음성균과 반응하여 응고되는 현상을 처음 발견하였다. 이후 Levin 등[23]이 투구게의 혈액세포 분비물이 그람음성균의 세포외막 성분인 LPS와 반응하여 응고되는 원리를 밝혀내면서 이를 응용하여 LPS를 검출할 수 있는 LAL 시험법이 개발되었다. LAL 시약에는 LPS에 민감하게 반응하여 활성화되는 세린 단백질분해효소 효소원(serine protease zymogen)인 factor C가 존재하는데, factor C가 LPS와 결합하여 활성화되면 이는 또 다른 세린 단백질분해효소인 factor B를 연쇄적으로 활성화시키고, 활성화된 factor B는 전응고 효소(proclotting enzyme)를 활성화시킨다[24]. 활성화된 응고효소(clotting enzyme)는 LAL 시약 내 응고원(coagulogen)을 응고물(coagulin)로 전환시켜 겔 형태의 단백질 덩이(clot)를 형성하거나 합성 펩타이드 발색 기질(synthetic peptide chromogen substrate)을 분해시켜 발생되는 빛을 분광광도계로 측정하여 엔도톡신을 검출 및 정량할 수 있다(Figure 2) [25]. 하지만 시험물질 내에 반응간섭인자가 존재할 경우 LAL 반응에 간섭이 일어나 위음성의 결과를 초래할 수 있으며, 엔도톡신 검사에 영향을 미치는 반응간섭인자로 강산, 계면활성제, 이가 양이온(divalent cations), 단백질분해효소 등이 알려져 있다[26, 27].

Fig. 2. Schematic diagram of the Limulus amoebocyte lysate (LAL) reaction. The cascade of endotoxin detection in (A) traditional LAL assay and (B) recombinant cascade reagent assays.

엔도톡신 시험은 LAL 반응의 분석방법에 따라 겔화법, 비탁법 및 비색법으로 분류할 수 있다. 의약품의 엔도톡신 시험에서 가장 일반적으로 사용되는 방법은 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험이다. 이에 본 연구에서는 임상에서 사용되는 방사성의약품 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액 내 반응간섭인자를 분석하고, 이들이 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험에 미치는 영향을 분석하였다. 또한 투구게 혈액세포 추출성분으로 만든 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 재조합 단백질로 만든 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge간의 성능을 비교하였다. ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액 내 존재할 수 있는 엔도톡신 반응간섭인자는 pH와 유기용매, 완충용액 등이 있다. 유럽 약전(European pharmacopeia)의 지침에 기재된 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액의 품질관리기준에 의하면 pH는 4∼8이어야 하고, 잔류용매인 에탄올은 10% (v/v) 이하로 존재해야하며, 화학적 이물인 HEPES는 200 μg/V (V: 유효시간 내 투여되는 최대 부피) 미만으로 존재해야 한다[28, 29]. 본 시험에서 사용한 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액 내 존재하는 반응간섭인자들은 모두 품질관리 기준범위 내로 존재하였다. 하지만 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액의 엔도톡신 시험은 모두 위음성으로 판정되었다. 겔 응고 LAL시험의 경우 양성대조군에서 겔의 형성이 관찰되지 않아 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액에 존재하는 반응간섭인자가 간섭현상을 일으킨 것으로 판단하였다. ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액의 비색 LAL시험에서도 겔 응고 LAL시험과 유사하게 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge 모두 회수율이 정상범위의 하한값보다 낮게 측정되어 부적합으로 판정되었다. 하지만 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액을 10배 희석한 후 재시험하였을 때 두 카트리지의 회수율은 모두 정상범위에 포함되었다.

진단용 방사성의약품 내 존재하는 반응간섭인자들의 허용범위를 평가하기 위해 다양한 범위의 pH 시험용액과 유기용매 용액 및 완충용액을 사용하여 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험을 실시하였다. 엔도톡신 시험은 세린 단백질분해효소 등을 사용한 효소반응(enzymatic reaction)기반 검사법으로 단백질인 효소가 강산, 강염기, 유기용매 등에 의해 변성될 경우 촉매 성질을 상실할 수 있다. 진단용 방사성의약품의 pH 기준범위는 대부분 4에서 8 이내로 설정되어 있는데, 본 연구를 통해 품질관리 허용기준인 pH 4부터 pH 8은 엔도톡신 시험에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 강염기인 pH 10의 경우 겔 응고 LAL시험에서 위양성이 나타났지만 비색 LAL시험에서는 간섭현상이 발견되지 않았고, Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge에서 측정된 회수율도 모두 정상범위에 포함되었다. 하지만 pH 2에서는 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험 모두 부적합으로 판정되었다. 본 결과를 통해 LAL 반응은 산성조건일 경우 pH 3까지는 효소의 활성이 유지되지만 pH 2에서는 효소 활성이 억제되어 간섭현상이 발생됨을 알 수 있었다.

방사성의약품 합성에 사용되는 대표적인 유기용매로 에탄올, 아세토니트릴, 다이메틸 설폭사이드 등이 있다. 아세토니트릴과 다이멜틸 설폭사이드는 표지반응 후 분리정제 과정과 불순물 제거과정에서 대부분 제거된다. 하지만 에탄올은 표지물질의 최종 정제과정에서 용리 목적으로 사용되므로 완제품 내 에탄올이 포함될 수 있다. 본 연구를 통해 검액 내 에탄올이 2% 이상 존재할 경우 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험 모두 간섭현상이 발생되는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 1% 에탄올 용액의 경우 비색 LAL시험 시 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율이 모두 정상범위에 포함되었지만 측정된 회수율 값이 정상범위의 하한값에 근접한 값을 가지므로 반응간섭인자의 영향을 줄이기 위하여 검체를 희석하여 분석할 필요성이 있는 것으로 사료된다. 아세토니트릴과 다이멜틸 설폭사이드는 품질관리 허용기준의 최대농도에서도 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험 모두 간섭현상이 발생되지 않았다.

⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액을 합성 시 표지반응의 pH를 조정하기 위하여 고농도의 HEPES를 사용한다. 합성과정 중 HEPES를 제거하기 위해 주사용수로 세척과정을 거치지지만 완제품 내 HEPES가 불순물로 포함될 수 있다. 이에 본 연구에서는 HEPES가 엔도톡신 시험에 반응간섭인자로 끼치는 영향을 평가하기 위하여 최대 2,000 μg/mL 농도까지 분석하였으나 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험 모두 적합으로 판정되었다. 또한 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율도 정상범위 내로 측정되었다.

진단용 방사성의약품 내 포함될 수 있는 불순물 중 엔도톡신은 투여 직후 환자에게 고열, 오한 등의 부작용을 유발 시킬 수 있으므로 투여 전 품질관리를 통해 안정성을 검증해야 한다. 본 연구에서 진단용 방사성의약품 내 존재할 수 있는 엔도톡신 시험의 반응간섭인자를 평가하였으며, 품질관리 기준범위내로 존재하는 반응간섭인자 중 유기용매인 에탄올이 가장 큰 영향을 끼치는 것으로 나타났다. 하지만 방사성의약품을 희석하여 에탄올의 농도를 1% 미만으로 낮추어 엔도톡신 시험을 시행할 경우 간섭을 극복할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 본 연구를 통해 재조합 단백질로 만든 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge는 투구게의 혈액성분으로 만든 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge를 비교 시 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율은 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge보다 전반적으로 높게 측정되었지만 반응간섭인자의 영향과 시험결과가 동일하여 성능에 큰 차이가 없음을 알 수 있었다. 진단용 방사성의약품마다 완제품 내 포함되는 반응간섭인자의 종류와 농도는 다를 수 있다. 이에, 방사성의약품의 엔도톡신 시험 전 결과에 영향을 줄 수 있는 반응간섭인자를 확인하고, 적절한 희석배수 설정을 통해 반응간섭인자의 간섭을 줄임으로써 검사의 정확도를 높일 필요성이 있다. 본 연구결과는 향후 새로이 개발되는 방사성의약품의 엔도톡신 시험 시 반응간섭인자를 평가하고 허용범위를 설정하는데 큰 도움이 될 것으로 사료된다.

엔도톡신 시험은 투구게의 혈구세포 추출성분인 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate, LAL)가 그람음성균의 지질다당체와 반응하여 응고하는 원리를 이용한 in vitro 시험법이다. 엔도톡신이 혈액 내 노출될 경우 환자에게 심각한 부작용을 발생시킬 수 있으므로 진단용 방사성의약품은 제조 후 반드시 엔도톡신 시험을 통해 의약품 내 오염여부를 확인해야 한다. 진단용 방사성의약품은 유기용매와 완충용액 등을 사용하여 화학반응을 통해 제조되므로 다양한 반응간섭물질이 의약품 내 존재할 수 있다. 이에 본 연구에서는 방사성의약품에 존재하는 엔도톡신 시험의 반응간섭인자를 분석하고 이들의 허용범위를 평가하고자 하였다. 방사성의약품의 엔도톡신 시험을 위해 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험을 실시하였고, 비색 LAL시험에서는 혈액성분으로 만든 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 재조합 단백질로 만든 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 성능을 비교하였다. 방사성의약품 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액의 엔토톡신 시험 반응간섭인자 평가 시 pH, 유기용매, 완충용액이 있었으며, 그 중 유기용매인 에탄올이 엔도톡신 시험에 간섭현상을 일으켰다. 하지만 ⁶⁸Ga-DOTATOC 주사액을 10배 희석할 경우 간섭현상을 극복 할 수 있었다. 진단용 방사성의약품 내 존재할 수 있는 반응간섭인자들의 허용범위를 평가하였으며, pH의 경우 pH 4∼8에서는 간섭현상이 없었고, 유기용매의 경우 에탄올 1% 이하에서는 간섭현상이 발생되지 않았다. 완충용액 HEPES는 2,000 μg/mL까지는 간섭현상이 발생되지 않았다. 본 연구를 통해 진단용 방사성의약품의 엔도톡신 시험에서 유기용매인 에탄올의 농도가 가장 중요한 반응간섭인자임을 확인하였고, 적절한 희석을 통해 1% 미만의 농도로 낮출 경우 엔도톡신 시험을 시행할 경우 간섭을 극복할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 Endosafe^Ⓡ LAL cartridge와 Endosafe^Ⓡ rCR cartridge의 회수율도 비슷하게 측정되어 성능에 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 본 연구결과는 향후 새로운 진단용 방사성의약품의 엔도톡신 시험 시 반응간섭인자를 평가하는데 큰 도움이 될 것으로 기대한다.

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Park JY, Clinical laboratory technologist.

The article is prepared by a single author.

This article does not require IRB/IACUC approval because there are no human and animal participants.