대한민국은 평균수명의 증가 및 저출산 경향에 의해 빠른 속도로 고령화가 진행되고 있으며, 2026년에는 고령자 인구 비율이 20%를 넘어 초고령사회가 될 것으로 전망된다[1]. 이러한 변화에 대처하기 위해 노인의 삶과 건강에 관한 관심이 증가하고 있다[2]. 동시에 노화 억제에 관한 연구 및 제품군을 의미하는 “항노화(anti-aging)”에 대한 관심이 증가하고 있다.

노화의 원인으로는 다양한 원인이 언급되고 있다. 가장 많이 언급되는 세포 내부적 노화 원인은 DNA 손상, 텔로미어(telomere) 단축, 세포 소기관 손상 등이 있으며, 이러한 원인이 축적됨에 따라 암 발생, 조직의 영구적 손상 또는 노화세포(senescent cell)가 발생하기 시작한다[3]. 노화세포는 좀비 세포(zombie cell)라고도 불리며, 세포 내에서 상기 노화 원인이 축적되어 소거되어야 할 세포가 소거되지 못하고 염증을 지속적으로 유도하는 세포이다[4, 5]. 이러한 세포의 노화 과정에서 가장 중요한 요소는 유리기(free radical)이다[6]. 대표적인 유리기로는 세포의 에너지 대사과정에서 주로 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species)과 염증반응에서 주로 발견되는 활성질소종(reactive nitrogen species)이 있다[7]. 이들은 세포 내에서 짧게는 nanosecond, 길게는 하루 정도의 반감기를 가지며, 이는 매우 빠르게 세포 내의 거대분자(macromolecule), 즉 DNA, RNA, 지질(lipid), 단백질(protein)과 반응하여 이들을 산화시켜 정상적인 대사활동을 불가능하게 만든다[8].

한편 세포 외부적 노화의 원인으로는 자외선에 의한 광노화[9], 외부 물질에 의한 염증성 노화[10], 외부의 온도 변화에 따른 열노화 등이 존재한다[11]. 많은 항노화 제품은 이러한 외부 요인으로부터 세포를 보호하는 것을 목표로 한다.

한편 자외선과 열 같은 노화 원인의 경우 외부와 직접적으로 접촉하는 피부의 노화와 밀접하게 관련이 있으나, 염증에 의한 노화의 경우 피부뿐만 아니라 인체 내부의 노화와도 밀접하게 관련되어 있어 단순히 미적인 의미에서의 항노화가 아닌 질병 및 수명과 관련된 건강적인 의미에서의 항노화요소로서 염증성 노화(inflammaging)는 중요한 연구 주제로 다뤄지고 있다[12, 13].

염증반응은 세포에 유해한 박테리아(bacteria), 기생물(parasite), 생체이물(xenobiotics) 등을 제거하는 반응으로 활성산소의 생성을 통해 이들을 제거한다. 이러한 반응이 제대로 이루어지지 않을 경우 패혈증과 같은 문제를 일으킬 수 있다[14]. 염증 과정에서 과도한 활성산소 생성은 오히려 세포 및 조직을 손상시킬 수 있다[15, 16]. 이러한 염증 반응은 원인의 소거와 세포 신호 전달 물질에 의해 종료되어야 하지만 종료되지 않고 지속되는 염증을 비용해성 염증(nonresolving inflammation)이라 하며, 비만, 암, 천식 등의 원인으로 알려져 있다[17].

과도한 염증 또는 비용해성 염증을 막기 위해 다양한 항염 물질이 연구되고 있다. 일반적으로 연구되는 식물 유래 추출물에는 폴리페놀(polyphenol)과 플라보노이드(flavonoid), 엽록소(chlorophyll)의 범주에 속하는 물질들이 공통적으로 들어있으나, 이들의 구조는 식물에 따라 차이를 지니며, 효과 역시 다양하다. 이러한 식물이 지닌 다양한 성분들을 파이토케미컬(phytochemical)이라고 하며 이들이 세포에 미치는 영향에 대해 다양하게 연구되고 있다[18].

이끼는 관속조직이 발달하지 않은 육상식물로 선태식물문(Bryophyta, Mosses), 우산이끼문(Marchantiophyta, Liverworts), 각태식물문(Anthocerotophyta, Hornworts) 등 3개의 문으로 나뉜다[19].

양털이끼(Brachythecium populeum)는 윤기가 나는 녹색을 띠는 이끼이며 암수 한 그루인 특징을 지닌다. 이끼의 포자낭 또는 포자실인 삭은 길이 1.0∼1.8 mm이고 장타원형이며 적갈색이다. 산야의 바위, 땅 위 또는 나무뿌리 부근에 모여 자란다. 우리나라 전역에 나며, 세계적으로는 북반구, 뉴질랜드 등에 분포한다[20]. 특히 국내에서는 태백산에서 자생하고 있음이 확인되었다[21]. 한편 동일한 속인 Brachythecium buchananii의 경우 항균 작용과 항염 활성을 가진 플라보노이드를 함유하고 있음이 알려져 있으며[22, 23], Brachythecium rutabulum의 경우 항균작용이 있음이 알려져 있다[24].

본 연구에서는 B. populeum 추출물을 이용하여 항염 활성에 대한 연구를 수행하였다. 이를 통해 B. populeum가 항염 소재로서 활용 가능한지 탐색하였다. 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)로 자극된 RAW 264.7에 B. populeum 추출물 시료를 처리하여 염증성 매개인자인 일산화 질소(nitric oxide, NO) 생성 억제 효과와 이와 관련된 염증성 사이토카인(cytokine)의 생성억제효과를 확인하였다.

1. 추출 방법

실험에는 강원도 원주시의 농가에서 재배된 B. populeum를 증류수로 세척한 뒤 저온 하 직사광선을 피해 건조하여 사용하였다. 추출용매로는 증류수와 주정, 삼염화에틸렌, 염화메틸렌, 메탄올, 핵산 등을 사용할 수 있으나, 식품, 화장품 등 다양한 산업에서 사용할 수 있는 용매는 제한적이며, 대부분의 용매가 유해성에 의해 용매제거과정이 필수적이다. 이에 ｢식품위생법｣ 제7조제1항에 따른 ｢식품첨가물의 기준 및 규격｣에 고시된 용매 중 식품, 화장품에 사용할 수 있으며 용매 제거 과정이 필요 없는 증류수와 70% 에탄올(ethanol)을 실험 용매로서 선정하였다. 추출은 건조 B. populeum 1 g에 각각 두 용매 50 mL를 첨가하여 24시간 27℃에서 진탕하여 추출과정을 진행하였다. 추출액은 Whatman qualitative filter paper, Grade 2 (Whatman)로 걸러내어 잔여물을 제거한 뒤 동결건조를 이용하여 용매를 제거하였다. 두 용매를 이용한 추출에는 동일 온도인 27℃를 이용하였으며 이는 천연추출물의 유효성분이 40℃ 이상의 온도에서 다른 물질과 반응하여 활성이 낮아질 수 있다[25, 26]. 한편 가열을 통한 추출의 경우 생산 단가의 증가 및 화석연료 사용에 의한 이산화탄소 배출을 야기하며, 이에 온도를 높이지 않고 추출하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있으며[27, 28] 본 실험 역시 온도를 높이지 않은 상태에서 물 추출물을 기준점으로 사용하였다.

2. 폴리페놀 함유량 측정

폴리페놀 함유량 측정은 Folin-Ciocalteu 시약(Sigma-Aldrich)을 이용하여 실시하였다[29]. B. populeum 추출물 1.0 mL와 Folin-Ciocalteu 시약 1.0 mL를 5분 동안 반응시켰다. 그 후 7% CaCO₃ 용액(w/v) 1.0 mL를 첨가한 다음 다시 증류수 0.4 mL를 첨가하여 혼합 후 30분간 대기하였다. 그 후 765 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

한편 폴리페놀 농도는 갈산(gallic acid)의 표준곡선(standard curve)을 기반으로 환산하였다.

3. 플라보노이드 함유량 측정

플라보노이드와 알루미늄이 반응하는 것을 이용하여 플라보노이드측정을 실시하였다[29]. B. populeum 추출물 1.0 mL와 5% NaNO₂ 용액(w/v) 0.3 mL를 5분 동안 반응시켰다. 그 후 2% AlCl₃ 용액(w/v) 0.5 mL를 시료에 첨가하여 6분간 대기하였다. 마지막으로 1 M NaOH 0.5 mL를 혼합하였다. 그 후 10분 동안 반응 후 510 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

한편 플라보노이드 농도는 퀘르세틴(quercetin)의 표준곡선을 기반으로 환산하였다.

4. DPPH 라디컬 소거능 측정

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay는 Blois [30]의 방법을 이용하였다. DPPH 용액은 70% 에탄올에 녹여 사용하였다. 사용 전 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디컬 용액의 기준치로서 흡광도가 1.00이 되도록 70% 에탄올로 추가 희석하여 본 실험에 사용하였다. 일정한 농도로 희석한 B. populeum 추출물 0.1 mL를 DPPH 용액 1.0 mL와 혼합하였다. 30분 후 517 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 각각의 샘플과 아스코르브산(ascorbic acid)의 Half maximal effective concentration (EC₅₀)을 측정하여 이를 기준으로 샘플의 항산화능을 아스코르브산 기준으로 환산하였다.

5. ABTS 라디컬 소거능 측정

2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assay는 Re 등[31]의 방법을 이용하였다. ABTS 용액은 발색 전 7 mM ABTS 용액을 제조한 뒤, 해당 용액에 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 녹여 초록색으로 발색되도록 하였다. 혼합 후 반응이 충분히 일어나도록 24시간 이상 반응시킨 뒤 734 nm에서의 흡광도를 측정하여 흡광도가 1.0이 되도록 희석하여 사용하였다. 일정한 농도로 희석한 B. populeum 추출물 0.5 mL와 ABTS 용액 1.0 mL를 혼합 후 30분간 반응시켰다. 그 후 734 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 각각의 샘플과 아스코르브산의 EC₅₀을 측정하여 이를 기준으로 샘플의 항산화능을 아스코르브산 기준으로 환산하였다.

6. 세포 독성 측정

세포 독성 실험에는 RAW 264.7을 사용하였다. 세포의 배양에는 DMEM broth (GE healthcare) 445 mL를 사용하였으며, fatal bovine serum (Sigma-Aldrich) 50 mL와 antibiotics (100×) (Sigma-Aldrich) 5 mL를 첨가하여 세포가 생장할 수 있는 조건을 만들어 사용하였다.

세포 독성 측정 방법으로는 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) assay를 사용하였다. 먼저 RAW 264.7를 96 well plate에 well 당 1×10⁴ cell을 주입한 뒤, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 세포가 well plate에 부착되도록 24시간 대기하였다. 부착이 끝난 후 200 μg/mL B. populeum 추출물을 다단희석으로 다양한 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 제거하고 MTT 용액(5 mg/mL)을 처리하였다. 그 후 4시간 동안 배양 조건과 동일한 조건에서 MTT의 결정이 생성되도록 하였다. 각 well에 생성된 결정은 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 100 μL로 녹여 570 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.

7. NO 생성 억제능 측정

염증에 의한 NO 생성을 측정에는 RAW 264.7을 사용하였다. 염증의 유도에는 LPS를 이용하였다.

염증에 의한 NO 농도 측정에는 griess reagent (Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 먼저 RAW 264.7 세포주를 96 well plate에 well당 배양액 200 μL, 세포 1×10⁴ cell을 주입한 뒤, 37℃, 5% CO₂ 환경에서 24시간 동안 세포가 well plate에 부착되도록 배양하였다. 부착이 끝난 후 LPS 1 μg/mL 및 B. populeum 추출물 200 μg/mL을 다단희석으로 다양한 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 그 후 각 well에서 배양액 100 μL과 그리스 시약(griess reagent) 100 μL를 반응시켜 NO의 농도에 비례하여 발색됨을 확인한 뒤 540 nm 파장에서의 흡광도를 확인하였다. 이때 LPS 처리군과 B. populeum 추출물 처리군의 NO 생성량을 비교하여, 염증 억제능을 측정하였다.

8. 염증성 사이토카인 측정

염증성 사이토카인의 측정을 통해 염증 반응의 일부 기전을 확인하였다. 염증에 의한 사이토카인 생성을 측정하는 데에는 RAW 264.7을 사용하였다.

염증성 사이토카인 측정은 interleukin (IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자 α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Koma biotech)를 이용하여 측정하였다. 세포의 배양 및 염증 유도는 ‘NO 생성 억제능 측정’에서 사용된 방법과 동일한 방법을 사용하였으며, 최종 세포 배양액을 ELISA kit의 사용법에 맞추어 실험을 진행하였다. 실험 결과는 해당 kit에 포함된 표준물질을 통해 정량하였다.

9. 결과 처리

본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 진행하였다. 평균과 표준편차의 계산에는 Minitab 18.1 (Minitab)를 이용하였다. EC₅₀의 계산에는 Chen 등[32]의 방법을 사용하였다.

1. 추출 수율

B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물을 건조하여 건조 중량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 증류수 추출물의 경우 2.5 mg/mL로 나타났으며, 70% 에탄올 추출물의 경우 4.1 mg/mL로 나타났다. 추출 수율은 각각 증류수 추출은 12.5%, 70% 에탄올 추출은 20.5%로, 증류수 추출은 125 mg/g, 70% 에탄올 추출은 205 mg/g의 수율을 나타낼 수 있으며, 70% 에탄올 추출의 실험 결과가 높게 나타났다.

Table 1

Dry weight and yield of Brachythecium populeum extract

	Extract method
	WE	EE
Extract dry weight (mg/mL)	2.5±0.5	4.1±0.8
Yield (%)	12.5±2.5	20.5±4.0

Mean±SD.

Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum.

일반적으로 추출물에서 추출 수율은 50% 에탄올 수용액(aqueous ethanol), 75% 에탄올 수용액, 역삼투압 정제수(reverse osmosis water), 100% 에탄올 순으로 낮다고 알려져 있다[33]. 다만 이러한 경향은 추출 원료의 종류와 상태에 따라 다를 수 있으며, 수율이 높다고 해서 유효성분이 높다고 할 수는 없다. 해당 선행논문은 본 연구의 결과와 동일하게 증류수보다 70% 에탄올로 추출한 경우 추출 수율이 더 높게 나타났다.

2. 총 폴리페놀 함량

B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량을 계산한 결과는 Figure 1과 같다. 증류수 추출물의 경우 폴리페놀 함량을 갈산으로 환산하였을 때 12.09±1.81 mg/g로 나타났다. 한편 70% 에탄올 추출물의 경우 폴리페놀 함량을 갈산으로 환산하였을 때 50.05±2.05 mg/g로 나타났다. 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물을 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 0.001 이하로 유의적인 차이를 나타냈다.

Fig. 1. Total phenolic contents of Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum; GAE, gallic acid equivalents; DW, distilled water. ***P<0.001.

3. 총 플라보노이드 함량

B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 플라보노이드 함량을 계산한 결과는 Figure 2와 같다. 증류수 추출물의 경우 플라보노이드 함량을 퀘르세틴으로 환산하였을 때 4.7±0.11 mg/g으로 나타났다. 한편 70% 에탄올 추출물의 경우 플라보노이드 함량을 퀘르세틴으로 환산하였을 때 21.92±0.15 mg/g으로 나타났다. 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물을 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 0.001 이하로 유의적인 차이를 나타냈다. 이는 70% 에탄올 추출물이 더 높은 폴리페놀 함량을 보인 것과 유사하다. 일반적으로 추출물의 추출 수율과 다르게 폴리페놀과 플라보노이드의 추출 수율은 100% 에탄올, 75% 에탄올 수용액, 50% 에탄올 수용액, 역삼투압 정제수 순으로 낮다고 알려져 있다[33]. 이는 폴리페놀과 플라보노이드의 극성이 낮기 때문으로 유기용매를 이용한 추출에서 더 높은 수율을 나타낸다.

Fig. 2. Total flavonoid contents of Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum; QE, quercetin equivalents; DW, distilled water. ***P<0.001.

4. DPPH 라디컬 소거능

B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Figure 3과 같다. 항산화 물질의 기준 물질로 선택한 아스코르브산의 EC₅₀ 수치는 84.48 μg/mL였다. 한편 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 경우 0.625∼20 mg/mL로 희석하여 실험을 진행하였으며, 증류수 추출물은 0.625 mg/mL에서 2.40%±1.50%, 1.25 mg/mL에서 3.76%±1.10%, 2.5 mg/mL에서 4.28%±1.14%, 5 mg/mL에서 27.72%±1.06%, 10 mg/mL에서 51.20%± 0.99%, 20 mg/mL에서 79.06%±0.75%의 라디컬 소거능을 보였으며, 9.744 mg/mL에서 EC₅₀ 수치가 나타났다. 70% 에탄올 추출물은 0.625 mg/mL에서 10.87%±0.92%, 1.25 mg/mL에서 22.21%±1.27%, 2.5 mg/mL에서 48.75%±0.98%, 5 mg/mL에서 66.82%±1.89%, 10 mg/mL에서 83.48%±1.63%, 20 mg/mL에서 88.56%±1.10%의 라디컬 소거능을 보였으며, 2.673 mg/mL에서 EC₅₀ 수치가 나타났다. EC₅₀에 가까운 2.5 mg/mL 농도에서 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 0.001 이하로 유의적인 차이를 나타냈다. 한편 EC₅₀을 바탕으로 비교했을 때, 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 차이는 3.6배의 항산화능의 차이를 나타내었다.

Fig. 3. DPPH radical scavenging rate of Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum; DPPH, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl; Cont., control group. **P<0.01, ***P<0.001.

5. ABTS 라디컬 소거능

B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 Figure 4와 같다. 항산화 물질의 기준 물질로 선택한 아스코르브산의 EC₅₀ 수치는 82.56 μg/mL였다. 한편 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 경우 0.625∼20 mg/mL로 희석하여 실험을 진행하였으며, 70% 에탄올 추출물은 0.625 mg/mL에서 13.49%±1.57%, 1.25 mg/mL에서 22.38%±1.23%, 2.5 mg/mL에서 39.25%±0.87%, 5 mg/mL에서 58.42%±0.44%, 10 mg/mL에서 79.40%±0.88%, 20 mg/mL에서 84.95%±0.64%의 라디컬 소거능을 보였으며, 3.902 mg/mL에서 EC₅₀ 수치가 나타났다. 증류수 추출물은 0.625 mg/mL에서 6.36%±0.88%, 1.25 mg/mL에서 9.41%±1.25%, 2.5 mg/mL에서 13.82%±1.13%, 5 mg/mL에서 21.25%± 0.82%, 10 mg/mL에서 35.36%±0.56%, 20 mg/mL에서 68.15%±0.44%의 라디컬 소거능을 보였으며, 14.466 mg/mL에서 EC₅₀ 수치가 나타났다.

Fig. 4. ABTS radical scavenging rate of Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum; ABTS, 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); Cont., control group. **P<0.01, ***P<0.001.

EC₅₀에 가까운 5 mg/mL 농도에서 대조군과 발효군의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 0.001 이하로 유의적인 차이를 나타냈다. 한편 EC₅₀을 바탕으로 비교했을 때, 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 차이는 3.7배의 항산화능의 차이를 나타내었다.

6. 세포 독성

B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 세포 독성 측정을 위해 MTT assay를 이용한 세포독성을 측정, 계산한 결과는 Figure 5와 같다.

Fig. 5. Cell survival rate of RAW 264.7 with Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum.

증류수 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 93.43%± 0.56%, 25 μg/mL 농도에서 90.83%±0.81%, 50 μg/mL 농도에서 85.42%±1.44%, 100 μg/mL 농도에서 82.78%±0.68%의 세포 생존율이 나타났으며, 70% 에탄올 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 92.87%±0.94%, 25 μg/mL 농도에서 89.90%± 0.57%, 50 μg/mL 농도에서 84.86%±1.31%, 100 μg/mL 농도에서 82.74%±1.07%의 세포 생존율이 나타났다.

세포 독성의 기준으로는 국제 표준화 기구(International Standards Organization) 10993-5를 이용하며 80% 이상의 세포 생존율을 기준으로 독성이 없다고 판단할 수 있다. 본 실험 결과에 이러한 기준을 적용하였을 경우 B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물 모두 모든 실험 농도에서 세포독성이 나타나지 않은 것으로 판단할 수 있다.

7. NO 생성 억제능

B. populeum의 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 염증 억제능 측정을 위해 NO 생성량을 측정한 결과는 Figure 6과 같다.

Fig. 6. Nitric oxide production rate of RAW 264.7 with Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum; Cont. -, control group without lipopolysaccharide (LPS); Cont. +, control group with LPS. Compared with water extracts; *P<0.05, **P<0.01.

증류수 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 97.53%± 1.18%, 25 μg/mL 농도에서 97.16%±1.79%, 50 μg/mL 농도에서 90.16%±1.02%, 100 μg/mL 농도에서 84.85%±0.40%의 NO 생성률이 나타났으며, 70% 에탄올 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 96.34%±0.90%, 25 μg/mL 농도에서 91.21%± 1.39%, 50 μg/mL 농도에서 83.98%±1.09%, 100 μg/mL 농도에서 69.43%±0.91%의 NO 생성률이 나타났다. 100 μg/mL 농도에서 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 <0.01로 유의적인 차이를 나타냈다.

8. 염증성 사이토카인 억제능

각 샘플의 염증성 사이토카인 생성량 억제 효과를 측정한 결과는 Figures 7-9와 같다.

Fig. 7. IL-1β production rate of RAW 264.7 with Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum; IL-1β, interleukin-1β; Cont. -, control group without LPS; Cont. +, control group with lipopolysaccharide (LPS). Compared with water extracts; *P<0.05.

Fig. 8. IL-6 production rate of RAW 264.7 with Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum; IL-6, interleukin-6; Cont. -, control group without lipopolysaccharide (LPS); Cont. +, control group with LPS. Compared with water extracts; *P<0.05, **P<0.01.

Fig. 9. TNF-α production rate of RAW 264.7 with Brachythecium populeum extract. Abbreviations: WE, water extract of B. populeum; EE, 70% ethanol extract of B. populeum. Compared with water extracts; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

IL-1β 측정에서 증류수 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 101.24%±1.26%, 25 μg/mL 농도에서 97.28%±2.13%, 50 μg/mL 농도에서 93.82%±1.26%, 100 μg/mL 농도에서 83.68%±3.44%의 IL-1β 생성률이 나타났으며, 70% 에탄올 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 91.35%±2.99%, 25 μg/mL 농도에서 87.39%±3.94%, 50 μg/mL 농도에서 81.46%±3.55%, 100 μg/mL 농도에서 74.29%±3.68%의 IL-1β 생성률이 나타났다. 100 μg/mL 농도에서 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 <0.05로 유의적인 차이를 나타냈다.

IL-6 측정에서 증류수 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 99.50%±1.32%, 25 μg/mL 농도에서 98.92%±1.44%, 50 μg/mL 농도에서 91.80%±1.27%, 100 μg/mL 농도에서 86.41%±1.51%의 IL-6 생성 억제율이 나타났으며, 70% 에탄올 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 94.46%±1.03%, 25 μg/mL 농도에서 92.38%±1.66%, 50 μg/mL 농도에서 84.03%±1.68%, 100 μg/mL 농도에서 74.54%±0.93%의 IL-6 생성 억제율이 나타났다. 100 μg/mL 농도에서 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 <0.01로 유의적인 차이를 나타냈다.

TNF-α 측정에서 증류수 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 99.57%±0.87%, 25 μg/mL 농도에서 97.17%±0.92%, 50 μg/mL 농도에서 92.75%±1.57%, 100 μg/mL 농도에서 86.61%±0.78%의 IL-6 생성률이 나타났으며, 70% 에탄올 추출물의 경우 12.5 μg/mL 농도에서 96.69%±0.87%, 25 μg/mL 농도에서 91.31%±1.57%, 50 μg/mL 농도에서 83.73%± 1.20%, 100 μg/mL 농도에서 72.12%±1.31%의 TNF-α 생성률이 나타났다. 100 μg/mL 농도에서 증류수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P-value는 0.001 이하로 유의적인 차이를 나타냈다.

추출 수율의 경우 70% 에탄올로 추출한 경우 더 높은 추출 수율을 나타냈다. 추출 수율에 영향을 주는 요소로는 추출 원료에 포함되어있는 물질의 비율, 추출 방법, 원료의 표면적, 추출 용매 등이 있으며, 온도와 pH, 추출 시간 등도 영향을 준다[33, 34]. 본 실험에서는 추출 용매에서 차이를 주었으며, 그 결과 70% 에탄올이 더 높은 수율을 나타낸 것으로 나타났다. 이는 단백질과 당류의 경우 물과 메탄올로 추출했을 때 더 높은 추출율을 보이는 한편 폴리페놀이나 플라보노이드의 경우 에탄올과 아세톤으로 추출했을 때 더 높은 추출율을 보인다[35]. 한편 물과 유기용매를 혼합함으로써 더욱 다양한 물질을 추출할 수 있어 폴리페놀과 플라보노이드 70% 에탄올 추출물에서 더 높은 추출 수율을 나타낸 것으로 보인다. 이는 전술한 극성에 의한 추출차이가 주된 이유로 생각된다. 한편 추출물 전체에 대한 추출 수율의 경우 약 1.64배 정도의 차이를 보였지만, 폴리페놀과 플라보노이드의 경우 약 4배 이상의 추출 수율 차이를 보였으며, 이는 추출 증가분이 대부분 폴리페놀과 플라보노이드에 의한 것으로 생각할 수 있다.

한편 이끼 5종의 항산화능 및 항산화 물질에 대해 분석한 논문에서, 97% 에탄올 추출물을 비교한 결과 같은 속의 이끼인 B. rutabulum 추출물이 ABTS, 폴리페놀, 플라보노이드, 플라보놀(flavonol)의 농도가 가장 높게 나타났다[36]. 이러한 결과는 B. populeum 추출물이 항염물질로서 사용 가능성이 높음을 뒷받침한다. 한편 이끼의 대표적인 유효성분으로는 테르페노이드(terpenoid), 비벤질(bibenzyl), 플라보노이드, 지질 등이 있으며, 단일 성분으로는 riccardin, germacranolide, lunularin, dicranin, ohioensin 등을 포함하고 있다[37].

본 연구에서 진행한 DPPH와 ABTS는 항산화능의 측정에 주로 사용되는 방법으로, DPPH는 유기 화합물 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl의 질소 원자가 가지고 있는 라디컬 활성에 따라 흡광도가 바뀌는 것을 이용한 방법이며, ABTS 역시 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)의 질소 원자가 가지고 있는 라디컬 활성에 따라 흡광도가 바뀌는 것을 이용한 방법이나 DPPH의 경우 유기용매, ABTS는 광범위한 용매에 녹을 수 있어 측정 가능한 항산화 성분 및 활성에 차이가 있다[30, 31].

이렇게 측정된 항산화능은 염증과 매우 밀접한 연관성을 가지고 있다. 염증의 발생 및 진행에 있어 세포 내의 산화 스트레스가 중요한 역할을 하며, 폴리페놀 및 플라보노이드 같은 항산화 물질은 페놀구조를 통해 라디칼을 제거하여 산화 스트레스를 억제함으로써 염증 반응의 발생을 막을 수 있다[38]. 본 연구에서도 폴리페놀 및 플라보노이드의 농도가 높았던 에탄올 추출물의 항염능이 높게 나타났다. 한편 이러한 항산화 성분은 미토겐 활성화 단백질 인산화효소(mitogen activated protein kinase)와 핵인자 카파비(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)와 같은 염증관련 세포 신호 전달 경로에 영향을 주어 염증을 억제하며, 그 결과 본 연구와 같이 염증성 사이토카인의 감소에 영향을 줄 수 있다[38, 39].

이끼의 항염 효과에 대한 연구에 따르면 우산이끼(Marchantia polymorpha L.)와 모래이끼(Racomitrium canescens (Hedw.) Brid.)는 HaCaT cell에 대해서 항염효과를 가지고 있다고 나타났으며, 두 이끼 모두 IL-1β, IL-6, TNF-α의 감소를 나타내었다[40]. 고산나무꼬리이끼(Dicranum majus Turner)의 경우 RAW 264.7의 NO 생성량 측정 결과를 바탕으로 항염효과를 확인하였다[41]. 본 연구의 결과에서도 NO를 비롯한 IL-1β, IL-6, TNF-α의 감소를 나타내어 기존 연구와 동일한 경향을 보였다.

결론적으로 B. populeum의 추출에서 물에 비해 70% 에탄올로 추출하는 것이 적합한 것으로 확인되었으며, 항산화 및 항염효과를 확인할 수 있었다. 이에 플라보노이드의 정량 실험을 통해 단일 성분의 변화를 추가로 분석한 뒤 발효를 통한 염증 효과 개선에 대한 연구가 가능할 것으로 생각된다.

Brachythecium populeum 의 상업적 사용 가능성을 확인하기 위하여 항산화능 실험과 세포 독성, 항염능 실험을 실시하였다. 폴리페놀과 플라보노이드 농도 측정에서는 70% 에탄올 추출이 증류수 추출에 비해 높은 농도를 나타내어, 70% 에탄올이 추출물의 유효성분 및 추출 수율의 측면에서 가장 적합한 추출 용매란 것을 확인하였다. DPPH, ABTS에서는 증류수 추출물에 비해 70% 에탄올 추출물의 항산화능이 높은 것을 확인하였다. 이는 B. populeum 유효성분의 극성에 따른 것으로 생각된다.

항염능 실험에서는 세포 독성과 항염능을 알아보았다. 세포독성의 경우 양 추출물 모두 낮은 세포독성을 보였으며, 염증 전달 물질인 NO 생성 억제능의 경우 70% 에탄올 추출물이 증류수 추출물에 비해 통계적으로 유의한 수준의 항염능 증가를 보였다. 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 농도를 측정한 결과 100 μg/mL 농도에서 각각 9.39%, 11.87%, 14.49%의 억제효과를 나타내었다. 이를 통해 B. populeum의 70% 에탄올이 염증 억제를 위한 물질로서 사용 가능함을 보였다.

None

None

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Park SN¹, Professor; Lee OH², Professor.

- Conceptualization: Park SN, Lee OH.

- Data curation: Park SN.

- Formal analysis: Park SN.

- Methodology: Lee OH.

- Validation: Lee OH.

- Investigation: Park SN, Lee OH.

- Writing - original draft: Lee OH.

- Writing - review & editing: Lee OH.

This article does not require IRB/IACUC approval because there are no human and animal participants.