Dardarin과 PARK8로도 알려진 leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2)는 단백질-단백질 상호작용, serine-threonine kinase, GTPase 활성을 지닌 거대한 다중성 도메인으로 구성되어 있다. LRRK2 변이는 소포 trafficking, 세포골격의 변화, 자가포식(autophagy), 리소좀 분해, 신경전달, 미토콘드리아 기능 및 미세신경교질반응 등에 영향을 미쳐 병원성을 나타낸다[1]. 파킨슨병(Parkinson’s disease, PD)은 흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta)에서 도파민 뉴런이 소실되어 발생하는 치매 다음으로 흔한 신경퇴행성 질병이다[2]. LRRK2 유전자에서 일어나는 돌연변이는 PD와 같은 유전적 원인을 유발시킨다. 최근에 LRRK2는 뇌, 신장, 폐 및 면역 세포에서 고도로 단백질이 발현되는 것으로 알려져 있다[3]. 또한, LRRK2 유전자가 결핍된 생쥐 연구에서는 LRRK2가 생쥐의 신장 및 폐 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 보고되었다[4-6].

폐암은 전 세계적인 암 사망의 주요 원인질환이며 폐암의 대부분은 비소세포성폐암(non-small cell lung cancer)이다. 전체 폐암 가운데 폐 선암(lung adenocarcinoma)과 폐 편평세포암종(lung squamous cell carcinoma, LUSC)은 각각 40%, 30% 전후를 차지하는 흔한 하위 암종유형이다. 특히, LRRK2의 발현 변화는 발암 물질에 의해 유발된 폐 선암을 형성하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 왔다[7, 8]. 하지만, 폐 선암과 폐 편평세포암종은 생물학적, 유전학적 특성이 다르기 때문에 서로 다른 암으로 분류하며 차별화된 치료법이 요구된다[9, 10]. 또한, 폐 선암과 폐 편평세포암종은 면역세포의 분포와 같은 종양면역 환경에서 상당한 차이를 보였다[11]. 폐암과 관련된 항염증성 연구내용 중, 폐 선암과 폐 편평세포암종에 대한 분화 및 발생연구에서 전환성장인자(transforming growth factor-beta)와 같은 항염증성 사이토카인이 다르게 작용할 수 있음이 확인되었다[12]. 폐 편평세포암종 유래 상등액이 제 II형 인터페론(Interferon gamma, IFN-γ)를 분비하는 CD4⁺ T 세포(Th1 세포)의 기능을 억제한다는 사실을 확인하였다[13]. 폐 종양 표본에서 항염증성 사이토카인의 하나인 IL10 유전자의 높은 발현이 있는 비소세포성폐암 환자들은 낮은 발현을 보이는 환자에 비해 나쁜 예후를 보였다[14]. 또한, 비소세포성폐암 환자에서 IL10을 분비하는 큰포식세포의 침윤 비율은 1기 암환자와 비교하여 림프절 전이 2기 이상의 환자에서 유의적으로 높다는 것이 밝혀졌다[15]. 비소세포성폐암 그러나, 폐 편평세포암종에서 LRRK2 유전자의 발현 및 IL-10의 역할 및 관련성에 대해서는 크게 알려지지 않았다. 한편, 면역세포와 연관된 연구내용 중 LRRK2가 결핍된 마우스의 대장염 실험모델에서 T 세포의 분화와 활성에 중요한 전사인자인 nuclear factor of activated T cells 1이 증가되어 핵으로 이동(nuclear localization)한다는 사실이 밝혀졌고[16], IFN-γ로 자극하면 사람의 단핵구에서 LRRK2의 발현이 증가되고 LRRK2의 발현이 억제되면 CD14, CD16, 및 MHC-II 발현이 감소되고, LRRK2의 발현 및 단핵구 성숙과도 관련성이 있다고 보고되었다[17]. LRRK2에 대한 면역학적인 연구는 주로 염증 반응과의 관련성에 초점이 맞추어져 있고 항염증성 반응과의 관련성은 아직 미흡한 상태이다.

본 연구에서는 폐 편평세포암종의 발달에 미치는 LRRK2 유전자 발현의 항염증성 영향과 이와 관련한 면역관련 마커와의 상관성에 대하여 연구를 수행하였다. 이를 위해서 Kaplan-Meier 플로터, gene expression profiling interactive analysis (GEPIA), tumor immune estimation resource (TIMER) 생물정보학 데이터베이스를 사용하여 폐 편평세포암종 환자의 LRRK2 발현과 생존율 및 면역마커(IFN-γ, IL-17, IL-4, 그리고 IL-10) 등과 상관성을 분석하였다. 또한 LRRK2 발현과 큰포식세포 아집단(M1 그리고 M2 타입 큰포식세포)의 침윤과 상관관계를 TIMER프로그램을 사용하여 추가로 조사하였다.

1. 연구대상 및 조사방법

1) Kaplan-Meier 플로터 분석

폐 편평세포암종에서 LRRK2 유전자 발현과 전체 생존율(overall survival, OS)의 연관성을 추적하기 위해서 임상 데이터가 결합된 Kaplan-Meier 플로터(http://kmplot.com)를 이용하여 분석하였다(Table 1) [18]. Kaplan-Meier 플로터에 사용되는 원시 데이터의 출처는 유전자 발현 데이터를 제공하는 대규모 프로젝트인 gene expression omnibus (GEO), European genome-phenome archive (EGA), The cancer genome atlas (TCGA)이다. 암 발생의 위험비(harzard ratio, HR)와 생존율에 대한 log-rank test P값이 계산되었다. Kaplan-Meier 플로터의 이용약관을 숙지하고 인용 문헌 표시 등 저작권과 관련한 사항을 준수하였다.

Table 1

Clinical characteristics of LUSC patients in Kaplan-Meier Plotter datasets

Variable	Patient
Total	495 (100.0)
Gender
Male	366 (73.93)
Female	129 (26.06)
Stage
1	159 (32.85)
2	83 (16.76)
3	242 (48.88)
Mutation burden
Low	242 (50.20)
High	240 (49.79)
Neoantigen load
Low	26 (5.71)
High	429 (94.28)

N (%).

Date from Lánczky and Győrffy (J Med Internet Res 2021;23:1. e27633) [18].

2) GEPIA 데이터 분석

GEPIA 데이터베이스(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)는 종양 검체에서 유전자 발현 프로파일을 검출하기 위한 생물정보학 데이터베이스이다[19]. GEPIA에서 사용되는 원시 데이터의 출처는 TCGA이다. 총 486명의 LUSC 환자를 대상으로 한, 암조직의 RNA-seq 발현분석을 통한 유전자 발현 데이터이다. 본 연구에서 GEPIA를 통해서 LRRK2 발현과 사이토카인 관련 유전자 발현의 상관성 분석을 수행하였다. GEPIA의 이용약관을 숙지하고 인용 문헌 표시등 저작권과 관련한 사항을 준수하였다.

3) TIMER 데이터 분석

TIMER는 다양한 암 유형에 대한 면역 침윤성을 체계적으로 분석할 수 있는 포괄적인 데이터베이스(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)이다[20, 21]. TIMER의 원시 데이터 출처는 TCGA 공개적인 데이터 세트이며 총 501명의 LUSC 환자를 대상으로 한, 암조직의 RNA-seq 발현분석을 통한 유전자 발현 데이터이다. 유전자 모듈을 통해 폐 편평세포암종의 LRRK2 발현과 큰포식세포 침윤과의 상관관계를 분석하였다. TIMER의 이용약관을 숙지하고 인용 문헌 표시등 저작권과 관련한 사항을 준수하였다.

4) Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) 데이터 분석

GEPIA 데이터베이스에서 확인된 LRRK2와 유의적인 상관성이 있는 IL-10관련 유전자들과 LRRK2와의 단백질-단백질 상호 작용(protein-protein interaction) 네트워크를 평가하기 위해 STRING 데이터베이스(https://string-db.org/)를 활용하였다[22]. 신뢰값(confidence score)은 0.15 이상으로 설정하였다.

1. LRRK2 유전자의 폐 편평세포암종에서의 예후와의 연관성

LRRK2은 PD와 같은 퇴행성 뇌질환의 발생과 높은 관련성이 있으며 뇌와 같은 장기에서 높게 발현하고 있다[1]. 하지만 LRRK2는 폐에서도 뇌와 비슷하게 높게 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에[3], 폐암 중 하나인 폐 편평세포암종에서 LRRK2 유전자가 미치는 영향에 대해서 관찰하였다. 이를 위해, 본 연구에서는 우선 Kaplan-Meier 플로터를 이용하여 암종에서의 예후를 조사하였다. Figure 1A에서 확인할 수 있듯이 폐 편평세포암종 내 암의 진행 단계에서 LRRK2 단백질 발현이 높을수록 생존율이 유의적으로 감소한다는 사실을 확인할 수 있었다(HR 1.47, logrank P=0.0076). 또한, 성별, 종양 돌연변이 부하(tumor mutation burden), 그리고 신생항원(neoantigen)도 LRRK2 발현에 의한 생존율 감소에 유의적인 영향을 미치는 것으로 나타났다(Figure 1B∼1D). 이러한 결과는 LRRK2가 폐 편평세포암종의 치료표적 후보인자가 될 수 있음을 시사한다.

Fig. 1. Correlation of LRRK2 gene to prognosis in LUSC. Using Kaplan-Meier plotter (http://kmplot.com) analysis, mortality rate of LUSC patients with high LRRK2 expression in accordance with (A) progressive stage of tumor, (B) tumor mutation burden, (C) gender, and (D) neoantigen load.
Abbreviations: LUSC, lung squamous cell carcinoma; HR, hazard ratio; LRRK2, leucine-rich repeat kinase 2.

2. LRRK2의 친종양 효과(protumor effect)와 항염증성 사이토카인 발현과의 연관성

LRRK2는 면역세포에서도 발현되는 것으로 알려져 있으며[3]. 특히, 제 II형 인터페론와 같은 염증성 사이토카인 자극에 의해서 사람의 단핵구에서 LRRK2의 발현을 증가시킨다[17]. 폐 편평세포암종에서 LRRK2 발현과 면역반응과의 상관성을 밝히기 위해서 GEPIA 분석을 이용하였다. 염증성 사이토카인 암조직 내 LRRK2와 염증성 사이토카인(예, IFN-γ, IL-17) 그리고 항염증성 사이토카인(예, IL-4, IL-10) 발현과의 관련성을 분석하였다. 그 결과, LRRK2과 IFN-γ와 IL-17 발현 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(IFN-γ: P=0.48, IL-17: P=0.62). 그러나, LRRK2과 IL-4와 IL-10 발현 사이에는 통계적으로 유의적인 양의 상관관계가 있음을 확인하였다(IL-4: P=0.041, IL-10: P=8.6e‒08) (Figure 2). 이러한 결과는 사람의 폐 편평세포암종에서 LRRK2의 발현이 높을수록 항염증성 사이토카인 발현이 증가하고 있음을 시사한다고 하겠다.

Fig. 2. Correlation analyses of LRRK2 and anti-inflammatory cytokines in LUSC tumors. Pearson correlation analysis of LRRK2 and inflammatory cytokines gene (IFN-γ, IL-17 ), anti-inflammatory cytokines genes (IL-4, IL-10). In this study, GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html) database was used for analysis.
Abbreviations: TPM, transcripts per million reads; LRRK2, leucine-rich repeat kinase 2; LUSC, lung squamous cell carcinoma; IL, interleukin; IFN-γ, interferon gamma; GEPIA, gene expression profiling interactive analysis.

3. LRRK2의 친종양 효과와 IL10 관련 유전자 발현과의 연관성

Figure 2에서 폐 편평세포암종에서 LRRK2의 친종양 효과가 대표적인 항염증성 사이토카인의 하나인 IL-10 사이토카인 발현과 관련이 있다는 사실을 확인하였기 때문에 IL-10 관련 유전자들과의 상관성도 추가로 조사하였다. 이를 규명하기 위해서 GEPIA 분석을 이용하여 LRRK2 발현과 IL-10 관련 유전자들(예, NFIL3, NFAT5, NOTCH1, STAT6, MRC1, PPARG, MAF, BATF, ARG1, TGFB1, PRDM1, AHR, IRF4, CD36, VEGFA, JUNB, HIF1A ILRL1, CD163, 그리고 PPARGC1A)과 연관성을 분석하였다. Figure 3은 LRRK2와 NFIL3, NFAT5,STAT6, MRC1, PPARG, BATF, AHR, IRF4, CD36, JUNB, ILRL1, 그리고 CD163과의 유의적으로 양의 상관관계가 있음을 나타낸 것이다(P<0.05) (Figure 3A, 3B). 이러한 유전자들과 LRRK2 발현이 IL-10 분비에 영향을 미칠 수 있다는 가능성을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Correlation analyses of LRRK2 and IL10-related gene expression in LUSC tumors. (A) Pearson correlation analysis of LRRK2 and IL10-related gene (NFIL3, NFAT5, NOTCH1, STAT6, MRC1, PPARG, MAF, BATF, ARG1, TGFB1, PRDM1, AHR, IRF4, CD36, VEGFA, JUNB, HIF1A ILRL1, CD163, and PPARGC1A) was conducted in LUSC tumors using the GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html) tool. (B) Summary of correlation coefficient (R) value from the significant data shown in Figure 3A.
Abbreviations: TPM, transcripts per million reads; LRRK2, leucine-rich repeat kinase 2; LUSC, lung squamous cell carcinoma; GEPIA, gene expression profiling inter-active analysis.

4. 폐 편평세포암종 내 LRRK2와 관련 있는 IL-10 관련 유전자 발현과의 연관성

Figure 2에서 폐 편평세포암종에서 LRRK2와 IL-10 관련 유전자의 발현 간에 유의적인 양의 상관관계가 있음을 확인하였다. 추가로 이러한 사이토카인 유전자가 LRRK2와 직접적으로 또는 간접적으로 상관관계가 있는지 밝히기 위해서 STRING 분석을 이용하여 LRRK2 발현과 IL-10 관련 유전자의 단백질-단백질 상호작용 데이터를 조사하였다. 그 결과, LRRK2와 NFAT5, STAT6, MRC1, PPARG, 그리고 BATF와는 직접적인 상호작용의 가능성이 있었으며 LRRK2와 AHR, IRF4, CD36, JUNB, ILRL1, 그리고 CD163은 간접적으로 상호작용 가능성이 있음을 확인할 수 있었다(Figure 4A, 4B). 이러한 결과는 폐 편평세포암종에서 LRRK2와 IL-10의 발현을 조절함으로써 IL-10 관련 유전자 및 전사인자들이 상승적인 상호작용을 할 것으로 기대된다.

Fig. 4. Protein-protein interactive net-works of LRRK2 involving IL-10 related gene expression in LUSC using STRING software. Protein-protein interactive net-works of genes (LRRK2, NFIL3, NFAT5, STAT6, MRC1, PPARG, BATF, AHR, IRF4, CD36, JUNB, ILRL1, and CD16) from the significant data shown in Figure 3A was analyzed using STRING software (https://string-db.org/). (A) Confidence networks, (B) evidence networks.
Abbreviations: LRRK2, leucine-rich repeat kinase 2; IL, interleukin; LUSC, lung squamous cell carcinoma; STRING, Search Tool for the Retrieval of Inter-acting Genes/Proteins.

5. 폐 편평세포암종 내 LRRK2 유전자 발현 증가에 따른 IL-10 분비와 M2 타입 큰포식세포의 침윤과의 연관성

항염증성 사이토카인 IL10은 T 세포, B 세포, 수지상세포, 그리고 큰포식세포 등 여러 면역세포에서 분비하는 것으로 보고되었다[23]. 활성화된 큰포식세포는 일반적으로 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF)와 같은 염증성 사이토카인을 분비하는 M1 유사 큰포식세포와 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인을 분비하는 M2 유사 큰포식세포의 두 가지 범주로 나눈다[24]. 폐 편평세포암종에서 LRRK2의 친종양 효과와 관련이 있는 IL-10 사이토카인의 세포성 유래(cellular source)를 확인하기 위해서 TIMER 프로그램을 이용하여 M1 큰포식세포와 M2 큰포식세포의 침윤과 LRRK2의 상관성을 확인하였다. LRRK2는 M1 대 큰포식세포와 높은 음의 상관관계를 보였으며(P=2.43e‒01), M2 큰포식세포와는 높은 양의 상관관계를 보였다(P=2.33e‒07) (Figure 5). 이러한 결과는 M2 큰포식세포가 LRRK2의 친종양 효과에 기여할 가능성을 시사한다.

Fig. 5. A positive correlation of LRRK2 gene expression with infiltration of M2 macrophage in LUSC tumors. The correlation of LRRK2 levels with the infiltration of M1 and M2 macrophages in LUSC tumors was analyzed using TIMER software (https://cistrome.shinyapps.io/timer/).
Abbreviations: LRRK2, leucine-rich repeat kinase 2; LUSC, lung squamous cell carcinoma; TIMER, tumor immune estimation resource.

LRRK2는 PD와 같은 퇴행성 뇌질환의 발생과 높은 관련성이 있으며 뇌와 같은 장기에서 높게 발현한다[1]. 하지만, LRRK2는 폐에서도 높게 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에[3], 폐암의 한 종류인 폐 편평세포암종에서 LRRK2 유전자가 미치는 영향에 대해서 관찰하였다. 이러한 연관성을 확인하기 위해서, 우선 Kaplan-Meier 플로터 생물정보학 프로그램을 이용하여 암종에서 LRRK2가 예후 마커 가능성 여부를 조사하였다. 비록 LRRK2는 퇴행성 신경뇌질환인 PD에서 많은 연구가 수행되어 왔지만, 폐와 같은 조직에서는 상대적으로 연구가 활발하게 진행되지는 않았다. 본 연구에서는 LRRK2 유전자가 폐 편평세포암종내에서 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. Kaplan-Meier 플로터, GEPIA, 그리고 TIMER 생물정보학 프로그램을 함께 운영한 결과, LRRK2 발현의 증가는 폐 편평세포암종의 생존율을 낮춰주었으며(Figure 1) 이러한 암촉진 효과(protumor effect)는 항염증성 사이토카인인 IL-10 발현 증가 및 IL-10을 분비하는 M2 큰포식세포의 조직침윤과도 밀접한 상관성이 있음을 확인하였다(Figure 2, 5).

LRRK2 mRNA와 단백질 발현이 CD19를 발현하는 B 세포와 CD14⁺ 단핵세포에서 높게 발현하고 있지만 CD4⁺ T 세포와 CD8⁺ T 세포에서는 거의 발현되지 않는다는 것을 규명하였다[17]. 이러한 결과는 T 세포와 같은 림프구보다 B 세포와 단핵세포와 같은 항원제시세포에게 LRRK2 유전자가 높은 영향을 미칠 수 있음을 시사하고 있다. 이러한 이유로 폐 편평세포암종에서 M2 큰포식세포와 같은 항원제시세포의 침윤과 LRRK2 발현이 유의적으로 상관성이 있다는 기존 결과와 일치한다는 것을 확인할 수 있었다(Figure 5).

Figure 3에서는 폐 편평세포암종에서 LRRK2 유전자 발현 증가와 MRC1 유전자 발현과의 유의적인 연관성을 확인하였다. MRC1 유전자는 IL-10을 분비하는 M2 큰포식세포의 대표적인 마커이며 IL-4 자극에 의한 M2 큰포식세포 분화 시 발현이 높게 증가된다[25]. 유전자 발현 연구에서 MRC1과 LRRK2는 Mycobacterium leprae 감염 큰포식세포에서 함께 발현되는 것으로 보고되었다[26]. 또한, 자가포식 관련 유전자인 LC3의 발현이 MRC1⁺ 큰포식세포에서 선택적으로 높아져 있는 것이 확인되었다[27]. LRRK2 mutant 생쥐에서 유래한 큰포식세포는 감소된 LC3II에 의해서 자가포식작용(autophagy)의 형성이 안된다는 것이 보고되었다[28]. 세포사멸 종양세포에 의해서 큰포식세포에서 IL-10을 분비하는 기존의 논문을 바탕으로 폐 편평세포암종 내 세포사멸 종양세포의 제거과정에서 큰포식세포의 포식소체 형성과 IL-10 분비에서 LRRK2와 MRC1의 관련성에 대한 연구는 흥미로운 연구가 될 것으로 생각한다[29].

GEPIA 분석에서도 폐 편평세포암종에서 LRRK2와 염증성 항염증성 사이토카인 유전자 IL-4와 IL-10 발현 모두에서 유의적인 양의 상관성을 확인하였다(Figure 2). 큰포식세포에서는 IL-10을 분비하는 M2 큰포식세포로 분화하기 위해서는 인터루킨(interleukin, IL)과 같은 Th2 타입의 사이토카인 자극이 필요하다[30]. 또한, 비만세포, 호염구, 그리고 호산구는 IL-4 사이토카인을 분비하는 데, 이러한 면역세포는 암 발생과 밀접한 관련이 있다[31, 32]. 이러한 선행 연구 결과를 바탕으로 향후에 폐 편평세포암종에서 LRRK2 발현이 IL-4/IL-10을 분비하도록 발병기전에 미치는 영향 및 IL4 분비 면역세포와의 상호작용에 대한 추가 연구가 필요하겠다. 결론적으로, LRRK2발현이 폐 편평세포암종으로의 발달 가능성을 보여줌으로써 질병예후 진단마커로서의 가능성을 나타내었으며, IL-10 사이토카인에 대한 억제 약물 및 LRRK2 억제제의 동시 투여는 효과적인 암 억제에 기여할 것으로 예상된다.

Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2)는 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환의 병태생리학적인 측면에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 주로 뇌뿐만 아니라 폐에서도 발현된다. 그러나 LRRK2 발현이 폐 편평세포암(lung squamous cell carcinoma, LUSC)과 같은 일반적인 폐암의 아형과 병인성이 있는지는 불분명하다. 본 연구에서는 Kaplan Meier 플로터 생물정보학 온라인 도구를 사용하여 폐 편평세포암종 내에서LRRK2와의 예후 진단가치를 분석하였다. 폐 편평세포암종 환자는 LRRK2의 발현이 높아지면 더 나쁜 예후를 나타낸다고 알려져 왔다. LRRK2 발현이 높은 환자의 경우 종양 돌연변이 부담, 높은 신항원부하, 더 나쁜 생존율, 성별과 상관관계를 보였다. 더욱이, gene expression profiling interactive analysis 데이터분석에서 높은 LRRK2 발현을 가진 환자에서의 심각한 증상은 항염증성 사이토카인(예, IL-4, IL-10)의 높은 발현에 양의 상관관계를 보였지만 염증성 사이토카인은 상관성이 없었다. 이러한 결과에서 IL-10관련 유전자의 높은 발현은 더 나쁜 예후를 보이는 LRRK2-high 환자들에서 유의미하게 연관성을 보였다. 또한, tumor immunity estimation resource 데이터는 큰포식세포가 LRRK2-high LUSC환자에서 IL-10의 기원세포 중 하나임을 보여주었다. 본 연구를 통해 결과적으로 LRRK2-IL10 축의 가설이 LUSC 환자의 잠재적이 치료 표적과 예후 바이오 마커일 수 있음을 보여주었다.

None

None

None

Lee SW, Professor; Park S, Professor.

- Conceptualization: Lee SW, Park S.

- Data curation: Lee SW, Park S.

- Formal analysis: Lee SW.

- Methodology: Lee SW.

- Software: Lee SW.

- Validation: Lee SW, Park S.

- Investigation: Lee SW.

- Writing - original draft: Lee SW, Park S.

- Writing - review & editing: Lee SW, Park S.

This article does not require IRB approval because there are no human participants by author’s clarification.