Bacteroides fragilis (B. fragilis) 는 그람음성, 절대혐기성 세균으로 사람의 장내세균총으로 존재한다[1]. B. fragilis의 subtype인 enterotoxigenic B. fragilis (ETBF)는 가축과 사람에게 설사와 대장염을 유발하는 장내 병원균으로 알려져 있다[2]. ETBF의 주요 발병기전은 Bacteroides fragilis toxin (BFT)라 불리는 20 kDa의 금속단백질분해효소(metalloprotease)에 의해 일어나며, colonic epithelial cell에서 접합단백질(junctional protein)인 E-cadherin의 ectodomain을 분절한다[3]. BFT에 의한 E-cadherin 분절은 장상피세포에서 nuclear factor kappa B (NF-κB), mitogen-activated protein kinase (MAPK), β-catenin 신호전달체계를 통해 염증 반응을 유도한다[4]. 또한 BFT는 대장암의 발병에서 잠재적인 발암물질로 작용하여 장 상피세포의 후생학적 변화와 DNA 손상을 유발한다[5, 6].

최근 암 발생과 관련하여 E-cadherin 분절의 하위 효과가 조사되었다[7]. E-cadherin은 모든 상피세포 표면의 측면에 위치한 120 kDa 당단백질이며, 동종성 상호작용(homophilic interaction)에 의해 인접한 세포의 부착을 매개하는 단백질이다[8]. E-cadherin의 intracellular domain은 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 결합하는 E-cadherin-catenin 복합체를 형성하여 세포의 모양, 극성과 이동 및 분화와 같은 세포의 생리적인 기능을 유지한다[9]. E-cadherin의 분절은 세포의 병태생리학적 상태를 유발하며, E-cadherin의 분절에 의한 소실은 암의 전이에서 epithelial-mesenchymal transition (EMT)를 유도할 수 있다는 측면에서 tumor suppressor protein으로 여겨진다[10]. 따라서, E-cadherin 분절 기작을 이해하는 것은 E-cadherin이 매개하는 세포생리를 밝히는데 중요하다. E-cadherin의 분절은 유방암 세포에서 처음 발견되었다[11]. 비특이적 protein kinase 저해제인 staurosporine은 인간 유방암 세포주 T47D, MCF7 세포에서 γ-secretase 의존성 E-cadherin intracellular domain의 분절을 유도하는 것으로 알려져 있다[12]. Staurosporine은 인간 유방암 세포주 PMC42-LA 세포에서 matrix metalloproteinase (MMP)-2의 상향조절을 통해 EMT를 촉진한다[13].

BFT에 의해 유도된 E-cadherin 분절 기작은 주로 인간 대장암 세포주 HT29/C1 세포를 사용하여 연구되었다[14]. 활성이 있는 BFT는 120 kDa full-length E-cadherin을 분절하여 80 kDa E-cadherin ectodomain과 33 kDa E-cadherin intracellular domain을 생성한다. BFT가 E-cadherin에 직접 결합하는지 또는 E-cadherin을 분절하는 protease를 활성화시키는지 알려지지 않았다. MMP-7 및 a disintegrin and metalloproteinase 10 과 같은 protease의 siRNA에도 BFT 유도 E-cadherin 분절이 유도되었다. 이는 protease가 BFT 매개 E-cadherin 분절에 필수적이지 않음을 의미한다. E-cadherin ectodomain의 분절 이후, 세포막의 γ-secretase는 intracellular domain을 분절하여 5 kDa juxtamembrane domain 및 28 kDa intracellular fragment을 생성한다. Calpain, caspase-3 및 proteasome과 같은 세포 내 pro-tease가 E-cadherin cytoplasmic domain 분해에 관여하는 것으로 알려져 있다[7, 15, 16]. 그러나 BFT에 의해 유도된 28 kDa intracellular fragment의 분해 기작은 아직 밝혀지지 않았다(Figure 1).

Fig. 1. Schematic diagram of E-cad-herin cleavage by BFT. In HT29/C1 colonic epithelial cells, BFT induces ectodomain cleavage of the full-length E-cadherin (120 kDa) by an unknown mechanism. The resulting E-cadherin ectodomain (80 kDa) is shed into the cell culture media. The membrane tethered E-cadherin fragment (33 kDa) is then cleaved by γ-secretase resulting in the release of the E-cadherin intracellular fragment (28 kDa) into the cytoplasm. We hypothesize that the degradation of the 28 kDa fragment is due to the proteasome complex. Whether BFT binds to a putative BFT receptor or directly cleaves E-cadherin is also unknown. Abbreviation: BFT, Bacteroidesfragilis toxin.

Proteasome은 전사(transcription), 세포 주기, 세포자멸사, 세포 대사 및 산화 스트레스를 포함하는 생리적 활동에 관여하는 단백질 복합체이다[17, 18]. Proteasome의 주요 기능은 세포의 항상성 유지에 필요하지 않은 손상되거나 잘못 접힌 단백질을 분해하는 것이다[17]. 특히, 접합단백질(junctional protein) 및 막관통 수용체(integral receptor)와 같은 막횡단 단백질(transmembrane protein)은 ubiquitin-proteasome system에 의해 조절된다[19]. Proteasome은 E-cadherin 발현을 조절하여 tumor metastasis의 EMT에 관여하는 것으로 보고되어 있다[20]. Cytoplasmic E-cadherin은 MDM2 (E3 ubiquitin ligase) 결합부위를 가지고 있으며, 이는 proteasome의 기질이 될 수 있음을 시사한다[21]. 본 연구에서는 proteasome을 저해하기 위해 dipeptide boronate계열의 저해제인 borte-zomib과 carfilzomib을 사용하였다. Bortezomib은 pro-teasome의 β5 subunit의 chymotrypsin-like 및 caspase-like 부위와 다양한 serine protease에 결합하는 가역적인 저해제이며, carfilzomib은 β5 subunit의 chymotrypsin-like 부위에 결합하는 비가역적인 저해제이다[22, 23].

이에 본 연구에서는 BFT에 의해 생성된 28 kDa E-cadherin fragment가 proteasome에 의해 분해되는 것을 확인하였다. 대장암 세포에서 일어나는 BFT 유도 E-cadherin 분절을 유방암 세포에서도 일어나는지 인간 유방암 세포주 BT-474 세포를 사용하여 확인하고자 하였다. 또한 staurosporine과 BFT에 의해 매개되는 E-cadherin 분절을 비교하고자 한다.

1. 세포 배양

본 연구에 사용된 인간의 유방암 세포주(BT-474, MCF7)와 대장암 세포주(HT29/C1)는 Dulbecco’s modified Eagle’s 배지(Corning Inc, Corning, NY, USA)에 5% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)과 10 mM HEPES (Gibco, Carlsbad, CA, USA), penicillin (100 U/mL)/streptomycin (100 μg/mL) (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2. 균주 및 세균 배양

Active BFT (rETBF; bft-2)를 과발현하는 nontoxigenic wild-type B. fragilis (WT-NTBF)와 inactive mutant BFT (rNTBF; bft-2 H352Y)를 과발현하는 WT-NTBF는 Cynthia Sears와 Augusto Franco (Johns Hopkins University, Baltimore, MA, USA)로부터 제공받았다. 본 연구에 사용된 모든 bacteroides strain은 gentamicin에 자연적으로 내성이 있으며 clindamycin 내성을 부여하는 pFD340으로 형질전환하였다. 두 재조합 bacteroides strain (rETBF, rNTBF)은 hemin, vitamin K₁, cysteine과 두 가지 항생제(clindamycin과 gentamicin)이 첨가된 brain heart infusion agar에 접종한 후 anaerobic chamber에 넣어 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후, 단일 집락을 선별하여 brain heart infusion broth (BHIB)에 접종한 후 anaerobic chamber에서 37℃, 48시간 배양하였다. 세균 상층액을 원심분리하여 0.45 μm syringe필터(Satorius, Goettingen, Germany)를 사용하여 여과하고 ‒80℃에 보관하였다.

3. 저해제 처리

본 연구에 사용된 세포들은 1.5 μM γ-secretase 저해제(L-685.458; Calbiochem, San Diego, CA, USA) 또는 2 μM proteasome 저해제(bortezomib 또는 carfilzomib; Foucus Biomolecules, Plymouth Meeting, PA, USA)로 30분간 전처리하였다. 비특이적 protein kinase 저해제인 staurosporine (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 250 μM로 처리하였다. 모든 저해제는 serum-free media에 첨가되었으며, 1:20으로 희석된 BHIB, rNTBF (rNT) 또는 rETBF (rET) 상층액과 함께 제시된 시간 동안 처리되었다.

4. Western blot analysis

BFT와 staurosporine에 의해 유도된 E-cadherin cleavage를 조사하기 위해 western blot을 수행하였다. 세포를 PBS로 세척 후 protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)과 phosphatase inhibitor cocktail (Sigma Aldrich)가 첨가된 radioimmunoprecipitation (RIPA; Sigma Aldrich) buffer에 4℃, 10분간 용해하였다. 세포 용해물과 상층액은 4℃, 10분간 원심분리(12,000 RCF)하여 상층액을 사용하였다. 단백질을 sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel에 전기영동 한 후, nitrocellulose membrane (Pall, Washington, NY, USA)에 transfer하였다. Membrane을 double blocker (T&I, Chuncheon, Korea)로 실온에서 10분간 blocking하였다. 1차 항체로 E-cadherin 단일 클론 항체 (C36, 1:2000; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)와 glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase (GAPDH; 6C5, 1:2,000, Sigma Aldrich)는 4℃에서 overnight하였다. Tris-buffered saline with tween 20 (TBST)로 5번 세척 후 2차 항체 horseradish peroxidase (HRP) labeled anti-mouse immunoglobulin G (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)로 실온에서 1시간 반응하였다. TBST로 세척 후 enhanced chemilu-minescence (ECL) kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.

1. Proteasome에 의한 28 kDa E-cadherin fragment 분해

Proteasome이 28 kDa E-cadherin intracellular fragment를 분해하는지 알아보기 위해 인간 장상피 세포주인 HT29/C1 세포에 proteasome 저해제인 bortezomib과 carfilzomib으로 30분간 전처리하였다. 활성이 없는 BFT를 분비하는 rNTBF supernatant (rNT)와 활성이 있는 BFT를 분비하는 rETBF supernatant (rET)를 proteasome 저해제를 함께 처리하였다. BHIB 또는 rNT에 의해 120 kDa full-length E-cadherin은 분절되지 않았으며, rET 10분부터 120 kDa full-length E-cadherin의 분절이 관찰되었다. BFT만 처리하였을 때, rET는 33 kDa, 28 kDa E-cadherin fragment를 생성하였으나 시간이 지남에 따라 E-cadherin의 양이 감소하였다. 반면 bortezomib을 처리하였을 때, γ-secretase에 의해 33 kDa E-cadherin intracellular domain은 분절되어 감소하였으나, proteasome이 저해되어 28 kDa E-cadherin intracellular fragment가 축적되었다(Figure 2A). Carfilzomib 또한 borte-zomib과 유사하게 시간에 따라 28 kDa E-cadherin cytoplasmic fragment의 분해를 저해하였다(Figure 2B). 이러한 결과는 BFT에 의해 생성된 28 kDa E-cadherin fragment가 proteasome에 의해 분해되었음을 시사한다.

Fig. 2. Bacteroides fragilis toxin-induced 28 kDa E-cadherin intracellular fragment is degraded by the proteasome complex in HT29/C1 cells. Colonic epithelial HT29/C1 cells were pre-treated with proteasome inhibitors, (A) bortezomib (2 μM) or (B) carfilzomib (2 μM) for 30 minutes and incubated with BHIB, rNT or rET for indicated time period (10, 30, 60, and 180 minutes). Cell lysates were examined by Western blot analysis using C-terminal specific E-cadherin antibodies. GAPDH was used as internal control. Abbreviations: BHIB, brain heart infusion broth; rNT, rNTBF supernatant; rET, rETBF supernatant; E-cad, E-cadherin; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

2. 유방암 세포주 BT-474 cell line에서 E-cadherin 분절

BFT가 대장암 세포뿐만 아니라 유방암 세포에서도 E-cadherin 분절을 유도하는지 알아보기 위해 유방암 세포주인 BT-474 세포에 BFT와 γ-secretase 저해제(L-685, 458)와 proteasome 저해제(bortezomib, carfilzomib)로 처리하였다. BT-474 세포에 γ-secretase 저해제와 proteasome 저해제를 30분간 전처리 한 후, BFT를 저해제와 함께 처리하였다. BT-474 세포에서 BFT는 E-cadherin의 분절을 유도하여 30분 이내에 120 kDa full-length E-cadherin를 현저하게 감소시켰으며, γ-secretase 저해제에 의해 33 kDa E-cadherin intra-cellular domain가 축적되는 것을 확인하였다(Figure 3A). 또한 proteasome 저해제 bortezomib과 carfilzomib를 처리했을 때 33 kDa intracellular domain은 감소하나, 28 kDa E-cadherin intracellular fragment는 증가하였다(Figure 3B, 3C).

Fig. 3. Bacteroides fragilis toxin induces sequential cleavage of E-cad-herin and degradation of the 28-kDa E-cadherin intracellular fragment in BT-474 cells. Human breast epithelial BT-474 cells were pre-treated with (A) γ-secretase inhibitor (L-685,458; 1.5 μM) or proteasome inhibitor, (B) borte-zomib (2 μM) or (C) carfilzomib (2 μM) for 30 min and incubated with BHIB, rNT or rET for indicated time period (10, 30, 60, and 180 minutes). Cell lysates were examined by Western blot analysis using C-terminal specific E-cadherin antibodies. GAPDH was used as internal control. Abbreviations: See Figure 2.

3. Staurosporine과 BFT가 유도하는 E-cadherin 분절의 비교

BFT가 유도하는 E-cadherin의 분절과 staurosporine이 유도하는 E-cadherin의 분절을 비교하기 위해 인간 유방암 세포주 MCF7 세포에 staurosporine, BFT, γ-secretase 저해제와 proteasome 저해제를 처리하였다. γ-secretase 저해제와 proteasome 저해제는 MCF7 세포에 30분간 전처리 후 staurosporine 또는 BFT를 저해제와 함께 처리하였다. MCF7 세포의 형태는 극성(cell polarity)을 가진 부착 세포이며, BFT를 처리해도 극성을 잃지 않으며, 인접한 세포와의 연접이 끊어지지 않는 것처럼 보인다. 반면 staurosporine을 처리하면 MCF7 세포는 극성을 잃고 동그란 형태로 변화한다(Figure 4A). staurosporine과 BFT를 3, 6시간 동안 처리하였을 때 BFT는 E-cadherin의 현저한 감소를 유도했으나 staurosporine은 큰 감소를 유도하지 않았으며, staurosporine에 의한 E-cadherin 분절에서 γ-secretase와 proteasome 저해제 처리에도 33 kDa 또는 28 kDa E-cadherin의 증가가 나타나지 않았다. 반면 BFT는 γ-secretase와 proteasome 저해제를 처리했을 때 33 kDa과 28 kDa E-cadherin가 증가하였다(Figure 4B, 4C). staurosporine과 BFT를 9시간 동안 처리하였을 때, staurosporine은 E-cadherin 분절을 유도하였으나 BFT에 비해 적은 양의 E-cadherin을 분절하였다. 또한 γ-secretase 저해제에 의해 33 kDa intracellular domain의 축적을 보였으나 proteasome 저해제에 의한 28 kDa intracellular fragment생성은 staurosporine에서는 일어나지 않았다(Figure 4D).

Fig. 4. Cell morphology changes and E-cadherin cleavage kinetics are different in staurosporine and Bacteroides fragilis toxin-treated MCF7 cells. (A) Human breast MCF7 cells were treated with rET, 250 μM STS, SFM, BHIB, or rNT for 9 hours and cellular images were taken by using an inverted microscope (×40). MCF7 cells were pre-treated with 1.5 μM γ-secretase inhibitor (L-685,458) or 2 μM proteasome inhibitor (carfilzomib) for 30 min and incubated with 250 μM STS or rET for the indicated time period 3 hours (B), 6 hours (C), or 9 hours (D). Cell lysates were examined by Western blot analysis using C-terminal specific E-cadherin antibodies. GAPDH was used as internal control. Abbreviations: See Figure 2; STS, staurosporine; SFM: serum-free media.

ETBF는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease) 또는 염증성 대장암(colitis-associated cancer)과 관련이 있다[24]. ETBF가 분비하는 BFT는 E-cadherin 분절을 통해 β-catenin/NF-κB와 MAPK 신호 경로를 활성화하여 급성과 만성 염증에서 증가하는 cytokine인 IL-8비를 유도한다[4, 25]. ETBF는 장내세균으로, 일반적으로 대장에 서식하기 때문에 ETBF의 기전을 밝히기 위한 연구는 주로 장 상피세포나 염증성 대장암 동물 모델에서 연구되었다[26, 27]. 하지만 간, 유방 또는 비장 같은 기관에서 몇몇의 장내세균이 발견되었으며, 이를 통해 병태생리학적 반응을 유도할 수 있다[28, 29]. 최근의 연구는 마우스의 유두에 ETBF를 관내 주사했을 때 유선의 상피세포 증식과 함께 ETBF 집락이 형성되고, 국소 염증과 조직 섬유화가 발생함이 보고되었다[30]. 또한 인간 유방암 세포주 MCF7 세포에서 short hairpin RNAs (shRNA)에 의한 E-cadherin knockdown은 세포 운동성이 8배 증가하고 침윤성이 3배 증가함을 나타냈다[31]. 따라서 본 연구에서는 E-cadherin이 BT-474 세포에서 BFT에 의해 분절되는지 확인하였다. HT29/C1 세포와 유사하게 BF-474 세포에서 BFT에 의한 E-cadherin의 분절이 유도되었고 순차적으로 γ-secretase와 proteasome에 의해 분해되었다. 이러한 결과는 ETBF 감염이 장뿐만 아니라 다른 기관에도 병리학적 영향을 미칠 수 있음을 의미한다.

Ubiquitin-proteasome system은 주로 가용성이나 수명이 짧은 단백질, 잘못 접힌 단백질(misfolded protein)을 분해하는 반면, lysosome은 주로 수명이 긴 단백질과 응집된 단백질(protein aggregate), 손상된 세포 소기관을 분해한다[32, 33]. 기존 연구에서 E-cadherin이 proteasome과 lysosome에 의해 분해될 수 있다고 제안되었기 때문에[34, 35] 본 연구자들은 proteasome을 저해하기 위해 선행 연구로서 가장 보편적인 proteasome 저해제인 MG132를 사용하였다. MG132는 bortezomib, carfilzomib과 유사하게 proteasome β5 subunit의 chymotrypsin-like 부위와 결합하여 proteasome을 저해하는 것으로 알려져 있다[36]. 선행 연구 결과, MG132는 인간 유방암 세포주(MCF-7)에서 4 μM 이상의 농도에서 proteasome과 γ-secretase를 함께 저해하였다(data not shown). 이러한 맥락에서 MG132는 γ-secretase와 proteasome을 포함하는 기전 연구에 적합하지 않다. 본 연구에서는 HT29/C1 세포에서 proteasome 저해제 bortezomib과 carfilzomib를 사용하여 proteasome을 특이적으로 저해하였을 때 28 kDa intra-cellular fragment의 분해가 억제되는 것을 확인하였다. 그러나 본 연구는 proteasome이 관여하는 E-cadherin 분해만을 확인하였으며, 향후 E-cadherin 분절 기작에 lysosome이 관여하는지 연구할 필요가 있다.

기존 연구에 의하면, staurosporine은 인간 유방암 세포주(H184A1, MCF7, T47D)와 개 신장 상피세포주(Madin- Darby canine kidney, MDCK)에서 E-cadherin의 분절을 유도하였으며[12, 34] BFT는 HT29/C1 세포에서 30분 안에 E-cadherin을 분절하여 형태학적 변화를 유도했다[37]. 본 연구에서는 staurosporine 유도 E-cadherin 분절과 BFT 유도 E-cadherin 분절을 비교하였다. Staurosporine은 3시간 처리 후 MCF7 세포의 형태를 변화시켰으나 9시간 처리에도 120 kDa E-cadherin이 존재하였다. 대조적으로 BFT는 9시간 처리에도 세포 형태의 변화 없이 극성을 유지하였다. 반면 BFT 3시간 처리 후 E-cadherin은 대부분 감소하였으나 staurosporine은 9시간 처리에도 E-cadherin이 존재하였다. staurosporine 유도 E-cadherin 분절에 γ-secretase가 E-cadherin intracellular domain을 분절하지만 proteasome은 분해에 관여하지 않았다. 이러한 상충된 결과는 stauros-porine 유도 E-cadherin 분절과 BFT 유도 E-cadherin 분절이 다른 기작을 가지고 있음을 시사한다. 향후 staurosporine이 E-cadherin 이외 연접 단백질(junction protein)의 분절 여부와 생성된 intracellular fragment의 분해 기작을 연구할 필요가 있다.

E-cadherin의 소실은 EMT에 필수적이며 전이성 세포(metastastic cell)의 중요한 특징이다. BFT는 상피세포의 접착 결합(adherens junction)을 파괴하여 부착세포를 분리시켜 다른 곳으로 자유롭게 이동할 수 있도록 한다[38]. 이러한 맥락에서 E-cadherin 분절 기작의 연구는 세균에 의해 유발된 EMT뿐만 아니라 일반적인 암 전이(metastasis)를 이해하는데 기여할 것으로 사료된다.

Enterotoxigenic Bacteroides fragilis (ETBF)는 염증성 장 질환과 대장암을 유발하며 아연 의존성 metalloprotease인 B. fragilis toxin (BFT)를 분비한다. BFT는 epithelial cell의 E-cadherin을 80 kDa ectodomain과 33 kDa intracellular domain으로 분절을 유도한다. 생성된 E-cadherin intra-cellular domain은 순차적으로 γ-secretase에 의해 분절되어 28 kDa E-cadherin intracellular fragment은 아직까지 밝혀지지 않는 기작으로 분해된다. 본 연구에서는 BFT 유도 E-cadherin 분절로 인해 생성된 28 kDa E-cadherin intracellular fragment는 proteasome에 의해서 분해된다는 것을 확인하였다. 또한 BFT 유도 E-cadherin 분절 기작이 대장암 세포가 아닌 인간 유방암 세포주 BT-474 세포에서도 동일한 기작으로 일어남을 확인하였다. 마지막으로 staurosporine은 인간 유방암 세포주 MCF7 세포에서 E-cadherin의 분절을 유도하고 γ-secretase에 의한 E-cadherin intracellular domain의 분절이 일어났으나 proteasome에 의한 분해는 일어나지 않았다. 이러한 결과는 ETBF가 서식하는 대장이 아닌 유방에서도 BFT에 의한 E-cadherin 분절이 일어날 수 있으며 ETBF가 대장암 이외의 다른 암에도 관여할 수 있음을 시사한다.

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Kang DH, Graduate student; Yoo SH, Graduate student; Hong JE, Graduate student; Rhee KJ, Professor.