
냉장 보관 기술이 발달하기 오래 전, 식량을 저장하기 위한 방법으로 발효 기법을 사용하였다. 발효식품은 유기산, 젖산균이 풍부하므로 유해균을 억제시킬 수 있으며, 비타민, 식이섬유가 풍부하여 각종 질병 예방의 효과가 있다고 알려져 있다. 당류를 분해하여 젖산을 생산하는
프로바이오틱스는 소장의 정상세균총을 군집시키고 병을 유발할 수 있는 유해한 미생물은 제거하는 역할을 하여 장내 세균총이 적절한 균형상태를 유지하도록 한다. 뿐만 아니라 유산, 초산 등의 유기산과 nisin과 같은 단백질성 항균물질인 박테리오신을 생성함으로써 유해세균의 증식을 억제할 뿐만 아니라 장내세균총의 안정화, 과민성 대장 증후군, 유당불내증 및 비특이적 면역증강의 완화, 항암 및 항종양 등의 다양한 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다[3].
이러한 유산균은 주로 김치류, 된장, 요거트, 치즈와 같은 유제품 및 발효식품에서 풍부하게 생성되며 특히 유럽의 프로바이오틱 시장은 약 7조원 규모로 전 세계적으로 가장 방대한 시장을 이루고 있지만 최근에는 중국, 인도, 베트남, 인도네시아 등의 아시아 시장이 급성장을 하고 있는 추세이다[4]. 이러한 식, 음료 및 건강기능식품은 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산과 담즙산에 살아 남아 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며, 장관 내에서 유효한 효과를 나타내어야 한다.
더불어 각종 열매, 과일, 버섯 등과 같은 다양한 식재료를 기반으로 한 발효식초의 항산화효과와 항염효과 등이 입증됨에 따라 발효식초에 대한 관심과 활용도가 높아지고 있다[5-7]. 본 연구에서는 무화과발효식초의 대장균, 포도알균, 녹농균에 대한 항균 효과를 바탕으로[8] 이를 활용한 다양한 형태의 유제품과 드레싱 소스를 개발하여 인체의 소장 상피세포와 흡사하게 증식되는 인체 유래 대장세포를 대상으로 세포생존율, 항산화능, 장내세포의 부착능을 분석하여 대장세포에 미치는 영향을 분석하고자 한다.
유제품 제조에 사용된 주재료인 일반우유(original milk, Samyang Co., Seoul, Korea)와 멸균우유(Jeju premium milk, Samyang Co., Seoul, Korea)는 삼양식품에서 제공받아 사용하였다. 무화과식초(
일반우유와 멸균우유에 각각 무화과식초를 1%, 3%, 5% 농도가 되도록 첨가하고 소금(Salt, CJ Cheiljedang, Incheon, Korea) 1%와 설탕(Sucrose, CJ Cheiljedang, Incheon, Korea) 1%를 추가하여 37°C 30시간 발효하였다.
일반우유와 멸균우유 멸균우유를 60°C에서 10분간 가열 후 각각 무화과식초를 1%, 3%, 5% 농도가 되도록 첨가하고 소금 1%와 설탕 1%를 추가하여 37°C에서 30시간 발효하였다. 그 후, 면보를 2겹으로 하여 9시간 동안 유청과 분리하여 리코타 치즈를 제조하였다.
5% 무화과식초를 일반우유 또는 멸균우유에 첨가하여 만든 유제품에서 리코타 치즈를 제조한 뒤 분리된 각각의 유청에 동량의 무화과 발효소를 첨가한 후, 10%, 20% 무화과 식초를 추가로 첨가하였다.
일반우유와 멸균우유에 각각 무화과 식초를 1%, 3%, 5% 농도로 첨가한 마시는 요거트 5 mL, 무화과 식초를 1%, 3%, 5% 농도로 첨가한 리코타 치즈 5 g, 그리고 리코타 치즈 제조시 분리된 유청에 무화과 식초를 10%와 20% 농도로 첨가하여 만든 드레싱 소스 5 mL를 채취하여 한 플레이트에 집락의 수가 최소 30개에서 최대 300개를 넘지 않도록 멸균생리식염수에 희석한 후 Lactobacilli MRS (deMan, Rogosa and Sharpe) agar 배지(BD Difco, Fraklin Lakes, NJ, USA)와 plate count agar (BD Difco, Fraklin Lakes, NJ, USA)에 bromcresol purple (BCP, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 첨가한 배지에 100 μL를 도말하여 평판 배양법으로 37°C에서 48시간 배양하였다. 배양 후, 노란색 집락(colony) 수를 3회 반복하여 측정하여 log CFU (colony forming unit)/mL로 평균값을 나타내었다.
개발한 유제품에서 분리된 균주의 정확한 동정을 위하여 분리균주를 Lactobacilli MRS 액체배지에서 20시간 배양하고 genomic DNA를 추출(AccuPrep, Bioneer, Daejeon, Korea)하였다. 16S rRNA 증폭을 위해 각각 0.4 μM로 최종농도가 되도록 forward primer 27F (5'-aga gtt tga tcc ctc ag-3')와 reverse primer 1492R (5'-ggt tac ctt gtt acg act t-3') [9]를 2X EzWay Direct Master Mix (Komabiotech, Seoul, Korea)와 혼합하여 total volume이 20 μL가 되도록 하였다. 처음 사이클은 95°C에서 10분 반응 후, 30 사이클을 95°C에서 30초, 50°C에서 40초, 72°C에서 30초씩 반복하였다. 최종 연장 사이클은 72°C에서 15분 조건으로 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. PCR 반응산물을 0.8% agarose gel에서 100V로 35분간 전기영동을 실시하고 GreenStar™ Nucleic Acid Staining Solution (Bioneer Co, Daejeon, Korea)으로 염색하여 Gel document system (Kodak Gel Logic 100 image system, Easrman Kodak Co, NY, USA)으로 확인하였다. 염기서열분석은 Bioneer사에 sequencing을 의뢰하였으며, 염기서열 분석과 상동성 비교는 GenBank (NIH, MD, USA)를 이용하였다.
5% 무화과식초를 일반우유에 첨가하여 제조한 리코타치즈에서 흡광도 측정을 용이하게 하기 위해 맑은 유청만을 분리하여 대장세포(Caco-2 cell)에 미치는 영향을 측정하였다. Caco-2 human colon cell line은 한국세포주은행에서 구매하였다. 10% fetal bovine serum (FBS, Thermo Fisher Scientific Inc, MA, USA), 1% streptomycin/penicillin (10,000 IU/mL, Thermo Fisher Scientific Inc), 1% non-essential amino acid, 10 mM HEPES, 1 mM L-glutamate, 1 mM sodium pyruvate가 첨가된 minimum essential medium (MEM, Gibco, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2, 95% O2 (MCO-18AC, Panasonic Healthcare Co., Ltd, Japan) 조건에서 배양하여 32번째 분열기의 세포를 사용하였다. 1×104개의 세포를 flat-bottom 96-well plate에 분주하고 5% CO2가 공급되는 37°C의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 유청을 1%, 5%, 10% 농도로 새로운 배지에 첨가하여 24시간 동안 다시 배양하였다. 각각의 well에 있는 배지를 제거한 후 10 μL cell counting kit-8 시약(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan)과 100 μL 배지를 첨가하여 2시간 동안 5% CO2, 37°C에서 배양하였다. 450 nm에서 microplate reader (SynergyTM HT Multidetection Microplate Reader, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 흡광도 측정을 통해 농도별 유청 시료를 첨가한 세포와 첨가하지 않은 세포의 세포생존율을 계산하였다.
32번째 분열기의 Caco-2 세포를 1×104개의 농도로 black 96-well plate에 분주한 후 superoxide dismutase (SOD) assay kit-WST (WST-1; (2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitro-phenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt)) (Dojindo Molecular Technologies, Inc)에서 제시하는 방법으로 WST working solution, enzyme working solution, sample solution을 준비하여 20분 동안 5% CO2, 37°C에서 반응시켰다[10]. 그 후 450 nm에서 microplate로 흡광도 측정을 하여 농도별 유청 1%, 5%, 10%의 농도로 첨가한 세포의 SOD 효소 활성능을 arbutin 100 µg/mL에서의 항산화 활성과 비교하였다.
동일 분열기의 세포를 사용하되 5×104/mL 농도로 12-well plate 에 분주하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하여 단일세포층을 형성하게 하였다.
실험결과는 SPSS 20.0 (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균값과 표준편차를 계산하고, one-way ANOVA를 이용하여
일반우유 또는 멸균우유에 무화과 식초를 1,3,5%의 농도별로 혼합하여 제조한 마시는 요거트, 리코타 치즈, 드레싱소스의 생균수는 MRS배지와 BCP가 포함된 PCA 배지에서 1.0×107∼1.0×108 CFU/mL 이상으로 건강기능식품의 기준 및 규격의 기준치[13]를 만족하였다(Tables 1-3).
Viable cells (log CFU/mL) counts on drink yogurt from regular milk or sterilized milk with concentration of FV
Media | Viable cells (log CFU/mL) | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
DYM | DYSM | ||||||
1% FV | 3% FV | 5% FV | 1% FV | 3% FV | 5% FV | ||
PCA with BCP | 7.10±0.09 |
7.23±0.09 | 8.31±0.05 | 7.23±0.07 | 7.27±0.03 | 8.16±0.03 | |
MRS | 7.78±0.03 | 7.14±0.12 | 8.4±0.07 | 7.29±0.04 | 7.39±0.04 | 8.26±0.08 |
*Mean±SD (N=3).
Abbreviations: DYM, drink yogurt from milk; DYSM, drink yogurt from sterilized milk; FV,
Viable cells (log CFU/mL) counts on ricotta cheese from regular milk or sterilized milk with concentration of FV
Media | Viable cells (log CFU/mL) | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
RCM | RCSM | ||||||
1% FV | 3% FV | 5% FV | 1% FV | 3% FV | 5% FV | ||
PCA with BCP | 7.31±0.11 |
7.36±0.09 | 7.92±0.14 | 7.45±0.07 | 7.61±0.06 | 7.64±0.01 | |
MRS | 7.75±0.03 | 8.02±0.05 | 8.38±0.05 | 7.55±0.18 | 7.64±0.03 | 8.22±0.01 |
*Mean±SD (N=3).
Abbreviations: RCM, ricotta cheese from milk; RCSM, ricotta cheese from sterilized milk; See Table 1.
Viable cells (log CFU/mL) counts on dressing sauce with concentration of FV
Media | Viable cells (log CFU/mL) | ||||
---|---|---|---|---|---|
Whey from RCM with 5% FV | Whey from RCSM with 5% FV | ||||
10% FV | 20% FV | 10% FV | 20% FV | ||
PCA with BCP | 7.53±0.04 |
7.35±0.03 | 6.82±0.07 | 6.49±0.05 | |
MRS | 7.35±0.10 | 7.12±0.09 | 6.61±0.01 | 6.38±0.08 |
*Mean±SD (N=3).
Abbreviation: See Table 1.
분리된 유산균의 16S rRNA 유전자 염기서열 정보를 미국국립생물정보센터(NCBI) GenBank 데이터베이스에 등록되어있는 염기서열과 비교하여 제조된 유제품에서 분리된 유산균의 종을 동정한 결과,
Sequence similarity of bacteria from drink yogurt from regular milk with 5% FV
Identity GenBank | Accession No. |
---|---|
NZ_CP042387.1 |
인간 대장세포주인 Caco-2 cell에 아무런 처리를 하지 않았을 때의 세포수를 기준으로 하여 일반우유에 5% 무화과식초를 혼합하여 만든 리코타치즈에서 흡광도 측정을 용이하게 하기 위해 맑은 유청을 분리하여 농도별로 처리한 후 세포수를 비교하였다. 유청을 첨가하였을 때 생존율이 증가하는 경향을 보였고, 특히 10% 농도로 처리하였을 때 19% 가량 세포생존율이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이는 유청이 세포에 독성으로 작용하지 않는다는 의미로도 볼 수 있다(
농도별 유청이 SOD 효소 활성에 미치는 영향을 평가한 결과 Figure 2에 나타내었다. 항산화 활성능의 양성대조군으로 100 µg/mL arbutin을 처리한 경우, 약 93%의 항산화능을 보였으며, 유청을 1%, 5%, 10% 농도로 처리한 경우, 각각 25%, 30%, 58%의 항산화능을 가지는것으로 분석되었다(Figure 2).
프로바이오틱스는 위와 십이지장을 지나 장에 안정적으로 부착해야만 그 기능을 발휘할 수 있는 것으로 판정한다. 그러므로 이를 확인하기 위해 인체의 소장 상피세포와 흡사하게 증식되는 Caco-2 cell line을 사용하였고, 일반적으로 사용되는 상업균주로서
사람의 장관은 수백 종 이상의 매우 다양한 미생물이 서식하고 있는 복잡한 환경이다. 연구결과들에 따르면 염증성 장염(inflammatory bowel disease, IBD), 과민성장증후군(irritable bowel byndrome, IBS) 등과 같은 장관 질환을 자주 겪는 사람의 장내 미생물은 건강한 사람의 장내세균총과 상당히 다름을 알 수 있다[13, 14]. 유산균이 대표적으로 장내세균총을 건강하게 변화시킬 수 있는 것으로 많은 보고가 있으며,
각 제품에서 생균수를 측정한 결과 1.0×107∼1.0×108 CFU/mL 이상으로 식품의 기준 및 규격의 기준치를 만족하였으며, 분리된 유산균은
또한 프로바이오틱스는 위와 십이지장을 지나 장에 안정적으로 부착해야만 그 기능을 발휘할 수 있는 것으로 판정한다. 그러므로 이를 확인하기 위해 인체의 소장 상피세포와 흡사하게 증식되는 Caco-2 세포주를 사용하여 세포생존율을 관찰한 결과, 유청을 10% 농도로 처리하였을 때 19% 가량 세포생존율이 증가함에 따라 유청이 대장세포에 유해하지 않으며, 세포증식을 돕는다고 볼 수 있다. 더불어 유청을 1%, 5%, 10% 농도로 처리한 경우, 각각 약 25%, 30%, 58%의 항산화능을 보였다. 대장세포로의 부착능을 분석한 결과, 유청에서 분리된
다양한 건강기능식품 중 프로바이오틱스는 전 세계적으로 가장 방대한 시장을 이루고 있으며, 장 건강이 우리 몸의 전반적인 면역작용을 조절하며 질병을 예방하고, 나아가 치료에 도움을 줄 수 있다는 연구결과에 따라 지속적으로 프로바이오틱스에 대한 관심이 증가하고 있다. 본 연구에서는 무화과식초가 가진 항균능을 이용하여 유제품과 드레싱 소스를 개발하여 그 선호도를 조사하고 대장세포에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 일반우유에 5% 무화과식초를 첨가하였을 때 마시는 요거트와 리코타치즈에 대한 가장 만족도가 높았다. 제조된 유제품에서 분리한 균은
This work was supported by the Samyang Igeon Scholarship Foundation Research Grant in 2021.
None
Heo JH, Professor.