위염은 위 점막에 다양한 원인으로 인해 염증 상태가 나타난 것으로 소화성 궤양이라고도 하며 위궤양 및 십이지장 궤양으로 나눠진다. 위와 십이지장의 내벽이 더 이상 위산과 세균에 대해 충분한 보호를 할 수 없게 되어 염증 또는 상처가 생길 때 발생한다. 대표적인 원인으로 Helicobacter pylori 감염으로 인한 질환으로 알려져 있다[1].

위암은 전 세계 기준 5대 암 중 하나이며 그중 3번째로 사망률이 높으며 발병률은 가장 높은 암으로 알려져 있다. 연령이 증가할수록 그리고 서구 국가보다는 아시아, 라틴 아메리카, 동유럽 등에서 발병률이 더 높게 나타나고 있다. 위암뿐만 아니라 위 림프종의 70%∼80%의 사례에서 H. pylori가 관찰되었고, 이는 주로 60세 이후 많이 나타나며 내시경 검사로 지속적으로 발견되고 있다[2-6].

이러한 위내시경 검사에서 위염 발병의 주원인인 H. pylori 및 위염 진단을 위한 조직학적 평가 구성요소 등에 대해 자세히 알아보고자 한다. 1990년 세계소화기병학회에서 처음 위염의 분류를 위해 만든 Sydney system은 1994년 위염에 대한 용어를 확립하고 몇 가지 세부 문제를 해결하여 The updated Sydney system이 확립되었다. 만성위염의 가장 큰 원인이 H. pylori로 가장 잘 알려져 있으며, The updated Sydney system 중 특히 만성염증의 분류에 H. pylori 유무, 만성염증, 호중구 다형활성, 선 위축 및 장상피화생(intestinal metaplasia; IM) 등을 정확하게 기록하도록 권장하고 있다[7, 8].

그중 대표적으로 호중구는 급성염증을 나타내는 대표적인 세포이며 H. pylori 혹은 그 외 요인에 의한 급성위염 발병 시 수치가 증가할 수 있다. 혈액 검사 시 정상인보다 위암 환자의 말초혈액에서 높은 호중구 비율을 보였고, 종양 조직 부위에서도 상당히 높은 비율을 보인다. 또한 암의 진행에 따라 그 비율은 지속적으로 증가하였다. 그 결과 호중구 증가율은 종양의 크기 증가 및 림프관 침투와 관련이 있어 급성위염 발생의 판단 지표로 볼 수 있다[9].

다음으로 IM은 위암의 위험인자로 H. pylori 감염부터 만성위염으로의 진행 중인 상태라고 할 수 있다. 자세히 말하면 위축성 위염에서 화생이 진행되어 위에서 소장의 세포구조가 관찰되는 경우를 말한다. 위 점막의 상피가 소장의 상피 형태로 화생하면서 뮤신(mucins)이 소실되고 소장의 세포들이 관찰되기 시작한다. 내시경 검사에서 우연히 발견되는 경우가 대부분이며 이러한 경우 지속적인 내시경 검사로 추적관찰 하는 것이 좋다. 위암의 예방 및 치료에 가장 중점을 두는 것이 내시경 검사를 통한 종양 제거이기 때문이다[10, 11].

감염 경로는 사람 간에 전염되는 것으로 알려져 있으며, 주로 아동기에 가족 내에서 감염이 일어나는 것으로 보고 있다. 사람의 위 점막 외 타액, 대변에서 H. pylori가 검출되었다. H. pylori는 전 세계 인구 50% 이상이 감염되어 가장 많이 감염되어 있고, 16세 이상에서 60%가 감염된 것으로 알려진 세계에서 가장 널리 분포된 균으로 알려져 있다. 또한 연령이 증가할수록 항체 양성률이 감소하는 경향이 있어 40세 이후 80% 정도 H. pylori 감염률이 나타나고 점차 줄어드는 경향을 보인다. 이는 선진국보다 개발도상국에서 더 높은 감염률을 보인다. 한국에서는 약 80%가 H. pylori에 감염되어 있다. 위축위염이나 십이지장궤양이 있는 환자 중에서는 거의 100% 확률로 H. pylori가 검출된다. 이 모든 감염 현황은 위염의 감염 현황과 거의 일치한다. 이는 H. pylori 감염이 위염 발병의 대표적인 원인이라는 방증이라고 할 수 있다[12, 13].

이렇게 H. pylori에 감염된 환자들은 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위 선암, 위림프종 등을 유발할 수 있다고 알려져 있다. 대부분의 경우 특별한 증상이나 합병증을 나타내지 않는다. 하지만 소화기 및 간 질환에 대한 연구에 따르면 소화성 궤양의 거의 60%∼100%가 H. pylori와 관련이 있다[14, 15].

이러한 위염 및 소화성 궤양 질환 등의 주요 원인인 H. pylori의 검출을 위한 진단방법에는 비침습적인 방법과 침습적인 방법이 있다. 비침습적인 방법에는 가장 쉽고 빠르게 혈액으로 검사하는 혈청검사, 95% 이상의 높은 민감도와 특이도를 보이는 요소호기검사법과 대변 항원검사 등이 있으며, 침습적인 방법으로는 내시경을 통한 검사를 말하며 급속요소분해 효소검사법, 균 배양검사, 중합효소연쇄반응(PCR) 그리고 조직검사법이 있다[16].

그중 가장 정확하고 민감한 검사법이 바로 조직검사법이다. 또한 현재 대부분의 의료기관에서는 위내시경 조직을 이용해 hematoxylin and eosin (H&E) 염색과 Wright-Giemsa (W-G) 염색을 병행하여 일차적으로 H. pylori 밀도를 진단하고 염색법으로 확인이 불가능한 경우 분자진단검사를 이용하고 있다[17, 18].

특히 W-G 염색은 현재 알려진 바로 가장 편리한 염색법인 동시에 H. pylori의 검출에 있어서 높은 예민도와 특이도를 나타내는 검사이다. 하지만 W-G 염색은 모든 검체에서 실시하는 검사가 아니라 일부 의심되는 환자에서만 실시하고 있다. 그래서 모든 환자를 대상으로 실시하는 H&E 염색으로 먼저 판독하는 것이 중요하다. 그리고 만약 H&E 염색에서 W-G 염색만큼의 민감도와 예민도를 나타낼 수 있다면 W-G 염색을 하지 않아 비용의 절감 및 진단 시간의 단축 등 위염의 진단에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 보인다[19].

이후 조직학적으로 여러 가지 다른 H&E 염색법들이 개발되었으나 현재까지는 대부분 Harris의 방식을 사용하고 있다. 그러나 최근 일부 의료기관에서 Mayer hematoxylin을 이용한 진행성 염색법을 사용하고 있다. 두 가지 염색법을 모두 사용해 본 연구자로서 두 염색법의 장단점을 파악하고자 하였다. 이와 더불어 hematoxylin은 염색시간에 따라 조직 혹은 세포의 판독에 영향을 줄 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려해 Tazawa 등의 연구 방법을 참고로 하여 Mayer hematoxylin 시간을 5분으로 연장하여 염색한 결과를 함께 비교하였다[20].

위염 진단을 위한 대표검사인 조직 염색법인 H&E 염색 중 대표 염색 두 가지인 Harris H&E 염색과 Mayer H&E 염색 그리고 본 연구에서 실험한 5’ Mayer H&E를 총 3가지 염색법을 추가하여 서로 비교해 보고 어떤 염색이 더 진단에 용이한 검사인지 구체적으로 알아보기 위해 본 연구를 진행하였다.

1. 재료 및 방법

서울대학교병원 병리과에 2021년 상반기 중 위내시경 검사한 환자 중 W-G 염색 결과 H. pylori 음성 30명, 양성 53명 총 83명 환자의 위 생검 조직을 사용하였다. 이 모집에 있어서는 IRB 승인을 받고 시행하였다(H-1408-007-598). 모든 검체는 10% 포르말린에 고정하였고 자동침투기(Peloris II, Leica)에서 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 후 Embedding center (Histo star, Thermo)에서 파라핀 블록을 만들어 Rotary microtome (Histo core autocut, Leica)으로 4 µm 두께의 연속절편 제작하여 슬라이드를 제작하였다. 자동침투기의 시약은 탈수는 Absolute ethanol (Korean Drug Co), 투명은 Xylene (Samchun chemicals), 침투는 Paraffin (Merck)을 사용하였다.

2. 염색 방법

Mayer H&E 염색과 5’ Mayer H&E 염색은 DAKO Autostainer (Agilent)를 사용하여 진행하였고, Harris H&E 염색과 W-G 염색은 수동으로 진행하였다. 염색에 사용된 시약은 모두 해당 장비회사에서 호환되는 시약을 사용하였다.

1) Harris H&E 염색

탈파라핀 과정을 거친 후 함수하여 Harris hematoxylin에서 5분씩 두 번의 과정을 거쳐 분별 과정으로 탈색을 0.1% hydrochloric acid (HCl) 2초 정도 짧게 처리하고 수세 과정을 5분 동안 진행하여 발색한 후 대조염색으로 eosin에서 30초 동안 염색한 다음 탈수, 투명 과정을 거쳐 봉입한다(Table 1).

Table 1

Detail of staining procedure from each tissue component

	Harris hematoxylin and eosin stain	Mayer hematoxylin and eosin stain	5-min modified Mayer hematoxylin and eosin stain
Hematoxylin	10 min	1 min	5 min
Ammonia water		Bluing buffer 1 min after 1 min wash	Bluing buffer 1 min after 1 min wash
0.1% hydrochloric acid	0.1% hydrochloric acid 2 times dipping after 5 min wash
Eosin	30 s	3 min 20 s	3 min 20 s
Total time	15 min 35 s	6 min 20 s	10 min 20 s

2) Mayer H&E 염색

탈파라핀 과정을 거친 후 함수하여 Mayer hematoxylin에서 1분 염색 후 분별 과정으로 청색화 과정으로 Bluing buffer (ammonia water)에서 1분간 발색시키고 1분 수세로 한 번 더 발색한다. 마지막으로 대조염색으로 eosin에서 3분 20초 동안 염색한 다음 탈수, 투명 과정을 거쳐 봉입한다(Table 1).

3) 5’ Mayer H&E 염색

위의 Mayer H&E와 전부 동일한 방식으로 진행한다. 하지만 그중 Mayer hematoxylin 시간을 1분에서 5분으로 연장하여 염색한다(Table 1). 본 염색 방법은 Tazawa 등의 연구에서 유의미한 결과를 참고하여 실시하였다[20].

4) Wright-Giemsa 염색

탈파라핀 과정을 거친 후 함수하여 W-G hematoxylin에서 5분간 염색한 후 수세하고 탈수, 투명 과정을 거쳐 봉입한다.

3. 염색 결과 판독

위 생검 조직에서 H. pylori 검출은 광학 현미경을 통해 고배율(×400)로 관찰하여 updated Sydney system classification에 따라 H. pylori 밀도를 반정량적 방식을 통해 absent (0), mild (1+), moderate (2+), severe (3+)로 등급화하였다(Figure 1). 염색법별로 판독을 시행하였고 케이스를 무작위 배치하여 각 결과에 영향을 받지 않게 하였다. 그리고 W-G 염색 결과를 모르는 상태에서 2명의 병리의사가 판독하였다.

Fig. 1. The results of Wright-Giemsa staining for each Helicobacter pylori density. (left upper) H. pylori -, H. pylori was not found on the special stain; (right upper) H. pylori 1+, occasionally or less than 1/3 of the total length of the specimen, a small number of H. pylori; (left lower) H. pylori 2+, the distribution of H. pylori is more than 1/3 of the whole sample, but less than 2/3, or continuous, thin and sparse, exists in the full length of the sample; (right lower) H. pylori 3+, H. pylori was distributed in heaps throughout the whole length of the specimen.

각 염색 방법에 따른 염색성 비교를 위해 조직 내 세포의 핵, 혈관 및 위 염증의 정도를 평가하는 항목인 IM과 호중구 세포 존재를 평가항목으로 판독하였다(Figure 2). 각 항목에 대하여 조직 내 염색 강도에 따라 0부터 3점으로 나누어 각 케이스를 평가하였다.

Fig. 2. The results of each staining method. (A) Intestinal metaplasia (arrows). (B) Capillary (arrows). (C) Neutrophil (black circle).
Abbreviation: H&E, hematoxylin and eosin.

4. 통계 처리

염색 방법별 H. pylori 양성률은 퍼센트 수치로 제시하였다. 평가자 간 혹은 H&E 염색법별로 진단의 정확도는 Kappa값을 이용하였다. 이는 서로 다른 평가자 간의 일치 또는 일치도 정도를 측정한 값으로 1에 가까울수록 완전한 일치를 나타내고 0은 우연 수준의 일치 또는 음의 일치를 나타낸다. Kappa값은 0.8 이상을 매우 높은 일치도, 0.6∼0.8을 높은 수준의 일치도, 0.4∼0.6을 중등도의 일치도, 0.4 이하는 낮은 일치도를 의미한다. 염색성 비교를 위해 비교한 평가항목들에 대해서 염색법별 판독 결과는 정규성을 따르지 않아 Krustkal-Wallis test를 시행하였다. 2그룹 간 유의성 비교에는 post-hoc test를 실시하였다. 통계적 유의성은 P<0.05를 기준으로 평가하였다. 자료 분석 및 표기는 통계 프로그램 SPSS version 25 (IBM Co.)와 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software)을 사용하였다.

1. 염색 방법별 H. pylori 밀도 판독 결과

총 83명의 생검 검체를 이용하여 W-G 염색과 3가지 H&E 염색을 시행하였고 H&E 염색은 2명의 평가자들이 각각 H. pylori의 밀도를 판독하였다(Table 2). 평가자는 모두 전문의로 한 명은 10년 이상, 다른 한 명은 10년 미만의 진단 경험을 보유하고 있다.

Table 2

Density score of Helicobacter pylori analyzed by various methods of H&E and W-G stain

Density of H. pylori	Number of specimen (%)
	Harris H&E			Mayer H&E			5’ Mayer H&E		W-G
	Pathologist 1	Pathologist 2		Pathologist 1	Pathologist 2		Pathologist 1	Pathologist 2
Negative	34 (41.0)	39 (47.0)		32 (38.6)	35 (42.2)		30 (36.1)	31 (37.3)	30 (36.1)
Mild	25 (30.1)	10 (12.0)		22 (26.5)	17 (20.5)		19 (22.9)	14 (16.9)	15 (18.1)
Moderate	15 (18.1)	19 (22.9)		17 (20.5)	15 (18.1)		22 (26.5)	22 (26.5)	24 (28.9)
Severe	9 (10.8)	15 (18.1)		12 (14.5)	16 (19.3)		12 (14.5)	16 (19.3)	14 (16.9)
Total	83 (100)	83 (100)		83 (100)	83 (100)		83 (100)	83 (100)	83 (100)

Abbreviations: H&E, hematoxylin and eosin; W-G, Wright-Giemsa.

Harris H&E 염색 결과를 평가자 1이 판독한 결과 H. pylori가 검출되지 않은 경우는 34예(41.0%), 1+ 검출은 25예(30.1%), 2+ 검출은 15예(18.1%), 3+ 검출은 9예(10.8%)였고, 평가자 2가 판독한 결과 H. pylori가 검출되지 않은 경우는 39예(47.0%), 1+ 검출은 10예(30.1%), 2+ 검출은 19예(22.9%), 3+ 검출은 15예(18.1%)였다.

Mayer H&E 염색 결과를 평가자 1이 판독한 결과 H. pylori가 검출되지 않은 경우는 32예(38.6%), 1+ 검출은 22예(26.5%), 2+ 검출은 17예(20.5%), 3+ 검출은 12예(14.5%)였고, 평가자 2가 판독한 결과 H. pylori가 검출되지 않은 경우는 35예(42.2%), 1+ 검출은 17예(20.5%), 2+ 검출은 15예(18.1%), 3+ 검출은 16예(19.3%)였다.

5’ Mayer H&E 염색 결과를 평가자 1이 판독한 결과 H. pylori가 검출되지 않은 경우는 30예(36.1%), 1+ 검출은 19예(22.9%), 2+ 검출은 22예(26.5%), 3+ 검출은 12예(14.5%)였고, 평가자 2가 판독한 결과 H. pylori가 검출되지 않은 경우는 31예(37.3%), 1+ 검출은 14예(16.9%), 2+ 검출은 22예(26.5%), 3+ 검출은 16예(19.3%)였다.

W-G 염색을 통해 H. pylori의 밀도를 조사하여 검출률을 분석한 결과 H. pylori가 검출되지 않은 경우는 30예(36.1%), 1+ 검출은 15예(18.1%), 2+ 검출은 24예(28.9%), 3+ 검출은 14예(16.9%)였다(Figure 3).

Fig. 3. Diagnostic concordance rate and Kappa coefficient of Helicobacter pylori evaluation between two pathologists in different staining methods. (A) Concordance rate. (B) Kappa coefficient.

2. 염색 방법별 두 평가자의 개별 일치율 및 Kappa값

H. pylori 검출 결과를 W-G에서 평가한 결과를 기준으로 하여 positive와 negative (PN)로 나눈 평가 기준과 밀도별로 측정한 평가 기준, 두 가지 기준으로 각 평가자 간 일치율과 Kappa coefficient를 분석하였다(Table 3).

Table 3

Diagnostic concordance rate and Kappa coefficient of Helicobacter pylori evaluation between W-G stain results and each pathologist using different H&E stain methods

Staining methods	Criteria for evaluation	Pathologist 1			Pathologist 2
		Concordance rate (%)	Kappa coefficient		Concordance rate (%)	Kappa coefficient
Harris H&E	(–) or (+)	83.1	0.645		86.7	0.730
	Intensity	57.8	0.420		80.7	0.729
Mayer H&E	(–) or (+)	85.5	0.691		91.5	0.824
	Intensity	69.8	0.587		81.9	0.751
5’Mayer H&E	(–) or (+)	92.7	0.843		96.3	0.922
	Intensity	80.7	0.735		82.7	0.900

Abbreviations: H&E, hematoxylin and eosin; W-G, Wright-Giemsa.

평가자 1의 염색법별 판독 결과 Harris H&E 염색 결과 PN 평가 기준 83.1%의 일치율과 0.645의 Kappa값, intensity 평가 기준 57.8%의 일치율과 0.420의 Kappa값을 나타냈다.

Mayer H&E 염색 결과 PN 평가 기준 85.5%의 일치율과 0.691의 Kappa값, intensity 평가 기준 69.8%의 일치율과 0.587의 Kappa값을 나타냈다.

5’ Mayer H&E 염색 결과 PN 평가 기준 92.7%의 일치율과 0.843의 Kappa값, intensity 평가 기준 80.7%의 일치율과 0.735의 Kappa값을 나타냈다.

평가자 2의 염색법별 판독 결과 Harris H&E 염색 결과 PN 평가 기준 86.7%의 일치율과 0.730의 Kappa값, intensity 평가 기준 80.7%의 일치율과 0.729의 Kappa값을 나타냈다.

Mayer H&E 염색 결과 PN 평가 기준 91.5%의 일치율과 0.824의 Kappa값, intensity 평가 기준 81.9%의 일치율과 0.751의 Kappa값을 나타냈다.

5’ Mayer H&E 염색 결과 PN 평가 기준 96.3%의 일치율과 0.922의 Kappa값, intensity 평가 기준 82.7%의 일치율과 0.900의 Kappa값을 나타냈다.

3. 두 평가자 간 염색 방법별 H. pylori 일치율 및 Kappa값

H. pylori 검출 결과를 PN으로 나눈 평가 기준과 밀도별로 측정한 두 가지 평가 기준으로 두 평가자 간 일치율과 Kappa coefficient를 분석하였다(Table 4).

Table 4

Diagnostic concordance rate and Kappa coefficient of Helicobacter pylori evaluation between two pathologists in different staining methods

Staining methods	Criteria for evaluation	Pathologist 1 – Pathologist 2
		Concordance rate (%)	Kappa coefficient
Harris H&E	(–) or (+)	84.3	0.683
	Intensity	65.0	0.508
Mayer H&E	(–) or (+)	86.7	0.725
	Intensity	68.6	0.564
5’ Mayer H&E	(–) or (+)	93.9	0.870
	Intensity	83.1	0.768

Abbreviation: H&E, hematoxylin and eosin.

Harris H&E 염색 결과 PN 평가 기준 84.3%의 일치율과 0.683의 Kappa값, intensity 평가 기준 65.0%의 일치율과 0.508의 Kappa값을 나타냈다.

Mayer H&E 염색 결과 PN 평가 기준 86.7%의 일치율과 0.725의 Kappa값, intensity 평가 기준 68.6%의 일치율과 0.564의 Kappa값을 나타냈다.

5’ Mayer H&E 염색 결과 PN 평가 기준 93.9%의 일치율과 0.870의 Kappa값, intensity 평가 기준 83.1%의 일치율과 0.768의 Kappa값을 나타냈다.

4. 염색 방법별 위 생검 조직 내 4가지 조직학적 항목의 염색성 비교 분석

각 염색 방법에 따른 염색성 비교를 위해 위 생검 조직 내에서 핵, 혈관, 호중구 그리고 IM에 대해 각각 염색 방법에 따라 intensity를 평가하였다(Table 5).

Table 5

The results of histological findings in the gastro endoscopy sample for each staining method

Findings	Mean±SD range			ANOVA (P)	Post hoc comparisons
	Harris H&E	Mayer H&E	5’ Mayer H&E		Harris vs. Mayer	Mayer vs. 5’ Mayer	Harris vs. 5’ Mayer
Nucleus	2.70±0.46	2.95±0.23	2.93±0.26	0.024	<0.001	0.985	0.008
Capillary	2.01±0.66	2.30±0.55	2.60±0.52	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
Intestinal metaplasia	2.72±0.46	2.56±0.50	2.56±0.50	0.857	0.985	0.674	0.882
Neutrophil	2.26±0.70	2.60±0.50	2.91±0.28	<0.001	0.004	<0.001	<0.001

Abbreviation: H&E, hematoxylin and eosin.

각 항목을 염색 방법별로 비교분석 하였을 때 핵은 두 가지의 Mayer H&E 염색 방식이 Harris H&E 염색보다 intensity가 유의하게 높게 평가되었다(Harris H&E vs. Mayer H&E, P<0.001; Harris H&E vs. Mayer H&E, P=0.004).

혈관 평가에서도 두 가지의 Mayer H&E 염색 방식이 Harris H&E 염색보다 intensity가 유의하게 높게 평가되었다(Harris H&E vs. Mayer H&E, P<0.001; Harris H&E vs. Mayer H&E, P=0.004). 두 가지 Mayer H&E 방식 중에서도 5’ Mayer H&E 염색이 intensity가 유의하게 높게 평가되었다(Mayer H&E vs. 5’ Mayer H&E, P<0.001).

호중구 평가에서도 마찬가지로 두 가지의 Mayer H&E 염색 방식이 Harris H&E 염색보다 intensity가 유의하게 높게 평가되었다(Harris H&E vs. Mayer H&E, P=0.002; Harris H&E vs. Mayer H&E, P<0.001). 두 가지 Mayer H&E 방식 중에서도 5’ Mayer H&E 염색이 intensity가 유의하게 높게 평가되었다(Mayer H&E vs. 5’ Mayer H&E, P<0.001).

IM은 염색 방법별 intensity 평균값이 통계적 유의성을 보이지 않았다(Figure 4).

Fig. 4. Intensity of staining score from each histological findings. (A) Nucleus. (B) Capillary. (C) Intestinal metaplasia. (D) Neutrophil.

현재 위염을 진단하기 위한 검사로 가장 민감하고 정확한 검사 방법은 위내시경을 통한 조직 검사이다. 내시경하 생검 된 조직의 H&E 염색 슬라이드를 통해서 위염 여부를 판단하고 있다. 위내시경 생검 조직의 H. pylori의 검출 검사의 종류로는 H&E 염색, W-G 염색, Warthin-Starry 염색 등의 조직 염색법이 있고, 추가 확진 검사로 면역조직화학염색과 분자진단학적 검사방법이 있다. 그중 모든 조직검사의 기본 염색인 H&E 염색은 진행성(Mayer) 염색과 퇴행성(Harris) 염색이 있는데 이 중 어떤 염색법이 W-G 염색에 가장 가까운 일치도를 나타내는지 알아보기 위해 본 연구를 진행하였다[18].

Rastogi와 Maddheshiya [21]의 결과에 따르면 Hematoxylin 염색법 중 Harris H&E 염색이 여러 방면에서 판독에 있어 가장 우수한 염색이라고 주장한다. 그리고 그 외 많은 연구 및 문서 등에 의하면 Harris의 염색이 H&E 염색의 대표염색으로 사용되어 왔다[22]. 하지만 최근 국내 의료기관에서 많이 사용하고 있는 Mayer H&E 염색과 그 이전에 보편적으로 사용한 Harris H&E 염색을 모두 사용해 본 검사자로서 유해물질 노출 빈도, 시약의 관리 및 총 염색시간 단축 등 Mayer H&E 염색이 장점이 있다고 판단하였다.

또한 Rastogi와 Maddheshiya [21]의 연구 방법을 살펴봤을 때 퇴행성 염색에서 탈색 과정에서 사용한 산 알코올을 그대로 진행성 염색에서 사용하고 있었다. 그러나 진행성 염색에서 강한 산성의 산 알코올로 탈색을 진행하면 약하게 염색된 핵이 흐리게 나올 수 있어 최근 사용하는 진행성 염색에서는 사용하지 않고 있다. 그리고 Meloan과 Puchtler의 연구[23]에 따르면 Harris는 실제 분별을 언급하지 않았고 진행성 염색을 강하게 권고했다고 하는 주장도 존재한다.

위와 같은 자료들을 근거로 본 연구를 진행하였다. 염색 방법에서는 퇴행성 염색인 Harris H&E 염색에서는 산 알코올로 탈색 과정을 거쳤고, 진행성 염색인 Mayer H&E 염색에서는 Ammonia water로 청색화 과정을 각각 사용하였다. 대조염색의 시간 또한 서로 다르게 설정하였다. 그 결과 총 염색시간은 Harris H&E 염색은 약 15분 35초, Mayer H&E 염색은 약 6분 20초로 총 염색시간에서 Mayer H&E 염색이 Harris H&E 염색보다 약 9분 정도의 염색시간을 절약할 수 있었다. 추가 비교 염색한 5’ Mayer H&E 염색은 Tazawa 등의 연구를 참고하여 Mayer hematoxylin 시간을 5분으로 연장하여 염색한 후 결과를 비교하였다[20].

위와 같이 염색을 진행한 결과 5’ Mayer H&E 염색이 Harris H&E 염색과 Mayer H&E 염색과 비교하여 H. pylori 검출률에 있어 W-G 염색과 비교한 결과 가장 가까운 일치율과 Kappa값을 나타냈다. 평가자별 일치율과 Kappa값이 Positive 또는 Negative 기준으로 각 92.7%, 96.3%의 일치율과 0.843, 0.922의 Kappa값을 intensity 기준으로는 80.7%, 82.7%의 일치율과 0.735, 0.900의 Kappa값으로 가장 높은 수치를 나타냈다. 또한 위염 진단의 평가항목인 혈관 및 위염 연관 인자인 호중구 판독 결과에서도 혈관은 2.60±0.52, 호중구는 2.91±0.28로 가장 높은 intensity score를 나타냈다. 핵 염색성 결과 또한 2.93±0.26으로 Mayer H&E 염색 다음으로 우수한 결괏값을 나타냈다. 유일하게 IM에서는 유의미한 결과를 보이지 않았다.

모든 결과를 정리해 보면 Harris H&E 염색이 H. pylori 검출률뿐 아니라 호중구, 혈관, 핵 관찰에서도 가장 낮은 검출률과 Kappa값을 나타내었고, Mayer H&E 염색이 유의하게 높은 검출률과 intensity 결과를 나타냈다. 같은 Mayer H&E 염색 중에서도 Mayer H&E 염색시간을 5분으로 늘린 5’ Mayer H&E 염색의 결과가 그렇지 않은 경우보다 유의하게 높은 검출률 및 intensity 결과를 나타냈다. 이러한 결과는 아마도 H. pylori, 호중구, 혈관 모두 미세한 핵 구조를 가지고 있는데 퇴행성 염색의 산 알코올을 이용한 탈색 과정에서 대부분 탈색되어 나중에 구분이 어려워지는 것으로 판단된다. 한편 IM의 경우는 염색법별로 intensity에 있어 통계적 차이가 없었는데, 그 이유로는 IM은 핵이 없는 점액성 물질이기 때문에 모든 염색법에서 판독 결과의 차이가 거의 없는 것으로 판단된다[24].

두 평가자가 각각 판독한 결과를 비교한 데이터에서도 5’ Mayer H&E 염색이 H. pylori 검출률과 위염의 조직학적 평가항목에서 가장 유의하게 좋은 결과를 나타내었고, 두 평가자 간의 일치율 또한 가장 우수한 Kappa값을 나타냈다. 이러한 결과를 통해 5’ Mayer H&E 염색이 조직구조 판독의 기본 염색으로 가장 적합한 염색법이라고 한 번 더 증명하였다.

하지만 본 연구에서도 몇 가지 한계점은 관찰되고 있다. 염색 방법별로 비교 시에는 5’ Mayer H&E 염색이 불일치율이 가장 낮았다. 하지만 W-G 염색을 기준으로 하여 H&E 염색별로 결과를 비교 분석하였을 때 1+로 읽었던 경우에서 불일치율이 가장 높았다. H. pylori가 적게 존재할 때는 H&E 염색만으로 판단하는 데에는 한계가 존재할 수 있으므로 H&E 염색에서는 mild 하게 H. pylori를 볼 때에는 주의가 필요하다고 생각된다. 기존에 잘 알려진 H. pylori 검출 염색인 W-G를 뛰어넘지는 못하지만 그래도 그에 상응하는 정도의 결과를 얻을 수 있었다.

5분으로 설정한 Mayer hematoxylin 시간은 검사실마다 조건이 다를 수 있다. 본 연구 초반에서 Mayer hematoxylin 시간을 기존 시간 1분과 연장된 5분, 10분으로 두 가지 조건을 추가하여 염색법을 실시하였고, 청색화 과정은 기존 시간 1분 외에 수정된 0분, 2분을 추가하여 실시하였다. 그 결과 Mayer hematoxylin 시간은 1분, 5분, 10분 중 5분의 결과가 가장 유의한 결과를 보였고, 청색화 과정의 차이는 0분, 1분, 2분 중 1분의 결과가 가장 유의한 결과를 보여 그 결과대로 본 연구 염색 방법에 적용하였다.

추가로 본 연구 결과를 위염만이 아니라 전반적인 장기 조직학적 소견을 파악하는 데 도움이 될지 알아보기 위해 위내시경 검체가 아닌 liver, tonsil, pancreas, thyroid, breast, colon, stomach 등 각 장기의 수술 절제 대표조직에도 동일한 염색 방법들을 적용해 보았다. 두 평가자 모두 5’ Mayer H&E 염색법의 염색성이 판독에 더 적합하다고 보았으나 이에 대한 뚜렷한 기준항목을 설정하여 보진 않았기 때문에 향후 추가적인 연구가 필요하다고 보았다.

결론적으로, 본 연구는 위염의 진단에 있어서 중요한 조직학적 검사 중 위내시경적 생검 조직을 이용한 H&E 염색 결과를 다양한 방면으로 분석하였다. 그 결과 5’ Mayer H&E 염색 결과가 판독 시 가장 높은 H. pylori 검출률을 나타냈고, 위염의 정도를 나타내는 호중구의 관찰에도 용이하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구 결과는 5’ Mayer H&E 염색이 위염 진단의 효과적인 기본 염색으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

위염은 전 세계 인구의 50% 이상, 국내에서는 약 80% 이상이 감염되어 있으며, 초기 증상이 없거나 미미해 조기 발견이 어려운 질환이다. 그러나 조기에 발견하면 간단한 치료로 회복이 가능하므로 주기적인 건강검진이 중요하다. 위염 진단에서 가장 정확한 방법은 위내시경을 통한 조직 검사이며, 본 연구는 조직검사의 기본 염색법인 hematoxylin and eosin (H&E) 염색에 초점을 맞추어 진행되었다. H&E 염색은 진행성과 퇴행성 두 가지 염색법이 있는데, 그중 대부분의 기관에서 관습적으로 Harris hematoxylin을 이용한 퇴행성 염색을 사용해 왔다. 그러나 일부 연구에서는 Mayer hematoxylin을 이용한 진행성 염색의 장점을 주장하였다. 이에 두 염색법의 비교를 통해 Mayer hematoxylin의 유용성을 평가하기 위해 본 연구가 진행되었다. 서울대학교 병원에서 위내시경 후 생검으로 얻은 83명의 위장 점막 검체를 대상으로 Harris H&E 염색, Mayer H&E 염색, 그리고 Mayer hematoxylin 시간을 5분으로 늘린 변형 염색법(5’ Mayer H&E 염색)을 시행하였다. 각 슬라이드는 Wright-Giemsa 염색 결과를 기준으로 H. pylori 검출률을 분석하였으며, 두 명의 병리의사가 핵, 혈관, 호중구, 장상피화생 등의 염색성을 평가하였다. 이 결과 세 가지 방법 중 5’ Mayer H&E 염색이 판독 시 H. pylori 검출률을 포함한 위염 진단을 위한 평가에 적합한 결과를 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 5’ Mayer H&E 염색을 조직학적 기본 염색으로 사용하는 것이 위염 진단에 도움이 될 것으로 판단한다.

This article is a condensed form of the first author’s master’s thesis from University.

None

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Cho K, Clinical laboratory technologist.

The article is prepared by a single author.

All procedures were performed in accordance with protocols approved by the Seoul National University Hospital Biomedical Research Institute (Approval numbers H-1408-007-598).