Adefovir dipivoxil (ADV)은 경구투여되는 뉴클레오타이드 유사체 역전사효소 억제제로서, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 만성 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는데 사용된다[1]. ADV는 세포 내 인산화를 거쳐 이인산 형태로 바뀌는 아데노신 일인산의 뉴클레오타이드 유사체이다[2]. ADV는 체내에서 HBV가 증식하는 데 중요한 역전사 효소 및 DNA 중합효소를 억제함으로써 작용한다[3]. 그러나 최근 연구에서 장기간 ADV 치료 시 신독성, 판코니 증후군(fanconi syndrome), 골연화증 등의 부작용을 나타나는 것으로 보고되었다[4-6]. 만성 B형 간염 치료를 위해 저용량의 ADV를 장기간 사용하여 발생한 판코니 증후군은 심각한 저인산혈증으로 인해 결과적으로 골연화증, 골밀도 저하 등을 유발하는 것으로 보고되고 있다[7, 8].

골다공증(osteoporosis)은 골감소와 뼈 구조의 파괴를 특징으로, 뼈 강도가 저하되어 골절 위험이 증가하는 골격계 질환이다[9]. 골다공증 발병에는 폐경 후 에스트로겐 호르몬 수치 감소로 인한 골밀도의 감소, 유전적 장애, 내분비 장애, 영양 요인 등 다양한 요인이 관여한다[10, 11]. 골다공증은 조골세포에 의한 뼈 형성과 파골세포에 의한 뼈 파괴 사이의 적절한 균형이 무너질 때 발생하며, 이를 조절하는 분자의 불균형으로 인해 파골세포 활성의 증가 및 조골세포의 기능이 감소되는 것으로 보고되었다[12]. 이전 연구에서는, ADV 처리에 의해 골모세포와 혈관내피세포에서 세포 핵의 크기와 세포형태의 비대증을 유발하여 세포의 증식 억제 및 골모세포 분화능에 영향을 줌으로서 골다공증을 유발할 수 있는 가능성이 보고되었다[3].

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 면역 조절 능력과 다계통 분화 능력을 보유하고 있는 조직 유래 전구세포이다[13]. 중간엽 줄기세포는 세포분열을 통해 스스로 재생될 수 있지만 미세 환경의 특정 용해성 인자에 노출된 후에는 골아세포, 연골세포, 지방세포, 신경세포 등 다양한 조직으로 분화할 수 있으며, 이들 간의 교차 분화가 가능하다고 보고되었다[14]. 특히 골수강에 중간엽 줄기세포에 의한 골아세포 생산이 감소되고 그 자리에 지방세포의 생산이 증가되면 골다공증이 유발되는 것으로 알려져있다[15]. 따라서, 골밀도를 감소시켜 골다공증을 유발하는 약물이 골대사에 미치는 영향을 파악하기 위해서는 중간엽 줄기세포에서 성숙한 골세포로 분화하는 기전을 연구하는것이 필요하다.

HIV와 만성 HBV 등의 질환을 치료하기 위해서는 ADV의 장기적인 약물 복용이 필수이지만, 장기적 약물복용에 의한 부작용에 대해 중간엽 줄기세포와 골아세포 모델을 이용한 세포학적 수준에서의 생물학적 연구와 메커니즘 연구가 부족한 실정이다. 본 연구에서는, ADV의 복용에 따른 골다공증 유발 원인을 규명하기 위한 연구 모델로서 줄기세포 세포 MSCs와 인체 조골세포 MG63을 이용하여 ADV의 약물 자극에 의한 세포의 형태학적 성질, 세포의 성장능, 골 분화능의 세포학적 영향을 연구하였다.

1. 재료

본 연구에서 사용한 ADV는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였으며, 제품의 정보에 따라 0.1M NaOH에 5 mg/mL로 녹인 후 ‒20℃에 보관하여 이용하였다.

2. 세포배양

MSCs (PCS-500-012)와 MG63 (CRL-1427) 세포는 Dulbecco’s modified eagle medium (Gibco)에 10% fetal bovine serum (Gibco), antibiotics (Gibco)를 첨가한 배지를 이용하여 CO₂ 5%, 37℃ 배양기에서 배양하였다.

3. 세포성장에 대한 분석

MSCs와 MG63 세포를 96 홀 플레이트에 5×10² cells/well이 되게 부착시키고 24시간 동안 배양하였다. ADV는 이전 연구에서 제시된 농도기준에 따라 각 홀 10 μg/mL 와 50 μg/mL 농도로 처리하였다[3]. 세포배양한 후 1일, 2일, 3일째에 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc.)을 이용하여 각각의 세포 성장률을 조사하였다.

4. 세포 형태와 핵 모양 관찰

배양한 세포를 96 홀 플레이트에 5×10² cells/well이 되게 부착시키고 24시간 배양시킨 후 ADV를 각 10 μg/mL 와 50 μg/mL의 농도로 처리하였다. 2일 배양한 후 배양액을 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 세정하였다. 10% 포름알데히드로 10분간 실온에서 고정시키고 PBS로 세정한 뒤 0.1% crystal violet solution (Sigma-Aldrich)을 이용하여 세포를 염색한 뒤 증류수로 잔여 염색약을 세정하고 현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰하였다. 또한 세포의 핵 형태를 관찰하기 위하여 농도별 ADV를 처리한 세포를 2일간 배양 후 PBS로 세척 후 0.1% triton-X 100 (Sigma-Aldrich)을 1분 처리 하였다. 이후 PBS로 세정하고 1 μg/mL Hoechst 33258을 세포에 처리하여 핵을 염색한 뒤 형광현미경(DM IL LED Fluo, Leica Microsystems)으로 이미지를 관찰하였다.

5. Real-time PCR에 의한 TGF-b의 발현율 평가

전환성장인자 베타(transforming growth factor-beta, TGF-β) 유전자 발현 측정을 위하여 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 이를 위해 세포를 6-well 세포 배양 접시에 접종하고 ADV를 처리한 뒤 2일째 RNA 추출 키트(GeneAll Biotechnology)를 이용하여 total RNA를 추출한 뒤 1 μg의 RNA를 이용하여 cDNA를 키트(iNtRON Biotechnology Inc.)를 이용하여 합성하였다. PCR은 TaqMan^TM Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific Inc.)와 TGF-β (Hs00998133_m1)를 특이적으로 표적으로 하는 TaqMan Real-Time PCR assay (Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하였다. 모든 TaqMan PCR 분석은 StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc.)을 이용하였으며, 18S rRNA (Hs99999901_s1)의 내부 표준 유전자를 공동으로 증폭 분석한 다음 대조군 샘플에 대한 상대적인 발현을 나타내었다.

6. 골모세포 분화를 위한 ALP 염색

배양한 MSCs와 MG63 세포를 96 홀 플레이트에 1×10⁴ cells/well 이 되게 부착시키고 24시간 동안 배양하였다. 배양한 배지는 제거하고 PBS로 세정하였다. 이후 골모세포분화 유도물질(osteogenic induction media)을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 그룹으로 나누고, 이들에 ADV를 각 10 μg/mL와 50 μg/mL의 농도로 처리한 다음 7일 후에 알칼리인산분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 염색을 시행하였다. 염색의 시행은 배양액을 제거하고 PBS로 세정 후 10% 포름알데히드로 실온에서 1분 동안 고정하였다. 다음 PBS로 세정 한 뒤, ALP solution (Sigma-Aldrich)을 넣고 CO₂ 5%, 37℃ 배양기에서 20분간 항온 처리한 후 염색된 세포의 분화능을 현미경을 이용하여 확인하였다.

7. 통계분석

통계처리를 위하여 모든 실험은 3회 이상의 독립적 반복실험을 수행하였으며, 결과값은 평균과 표준편차를 계산하여 그래프로 나타내었다. 각 실험의 유의성 검정은 대조군과 비교하여 student t-test 후 P<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 판독하였다.

1. ADV가 MSCs와 MG63 세포 증식에 미치는 영향

ADV가 각 세포의 증식에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위해 각 세포에 ADV 10 μg/mL 와 50 μg/mL의 농도로 처리하고 1, 2, 3일째에 세포의 증식률을 평가하였다. MSCs 세포에 ADV 처리 후 1, 2일 째에서 세포의 증식 및 억제 현상이 관찰되었으나 유의성 있는 감소를 보이지 않았으며 3일째 세포의 성장이 유의성 있는 감소를 보였다(Figure 1A). ADV 약물에 대한 MG63 세포의 성장률 평가에서는 2일째 50 μg/mL 농도와 3일째 10, 50 μg/mL 의 농도에서 통계적으로 유의한 억제현상을 보였다(Figure 1B).

Fig. 1. Effect of adefovir dipivoxil (ADV) on cell proliferation. (A) After ADV treatment of mesenchymal stem cells (MSCs) cells, cell proliferation and inhibition were observed on the 1 and 2 day, but no significant decrease was observed, and cell growth showed a significant decrease on the 3 day. (B) Evaluation of the cell proliferation of MG63 cells in response to ADV drugs showed statistically significant inhibition at a concentration of 50 μg/mL on the 2 day and at concentrations of 10 and 50 μg/mL on the 3 day. Values are expressed as mean±SD. *P<0.05 compared with the control group (0 g/mL of ADV).

2. ADV가 MSCs와 MG63 세포의 형태학적 변화에 미치는 영향

세포 형태에 대한 ADV의 영향을 평가하기 위해 각 세포에 ADV 10 μg/mL 와 50 μg/mL 의 농도를 처리하고 Hoechst와 crystal violet으로 염색하여 세포 형태를 평가하였다. 먼저, Hoechst를 이용한 핵염색을 통해 대조군에 비해 MSCs와 MG63 세포의 핵 크기가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(Figure 2). Crystal violet을 이용한 세포 염색을 통해 MSCs와 MG63 세포의 크기가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(Figure 3A).

Fig. 2. Effect of adefovir dipivoxil (ADV) on changes in the size of cell nuclear. (A) Nuclear staining using Hoechst confirmed that the nuclear size of mesenchymal stem cells (MSCs) and MG63 cells increased in a concentration dependent compared to the control group, respectively. Bar=100 μm. (B) and (C) were measured from the Hoechst stained images using an Image J program.

Fig. 3. Effect of adefovir dipivoxil (ADV) on morphological changes and transforming growth factor-beta (TGF-β) expression in cells. (A) Crystal violet stained was confirmed that the cell size of mesenchymal stem cells (MSCs) and MG63 cells increased in a concentration dependent to ADV treatment, respectively. Bar=100 μm. (B) Confirmed that TGF-β expression in MSCs significantly increased in a concentration dependent due to ADV treatment. (C) In MG63, TGF-β expression slightly increased at 10 μg/mL, but there was no significant effect. Values are expressed as mean±SD. *P<0.05 compared with the control group (0 g/mL of ADV).

3. ADV 처리에 의한 MSCs와 MG63 세포의 TGF-b 발현

ADV에 의한 세포 비대 현상 및 세포 증식 억제에 대한 영향을 평가하기 위해 MSCs와 MG63 세포에 ADV 10 μg/mL 와 50 μg/mL의 농도를 처리하고 2일째에 TGF-β의 발현을 평가하였다. ADV 처리로 인해 MSCs에서 TGF-β 발현이 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하는 것을 확인하였다(Figure 3B). 그러나 ADV 처리로 인해 MG63에서 TGF-β 발현은 10 μg/mL에서 약간 증가하였으나 뚜렷한 영향이 없는 것으로 나타났다(Figure 3C).

4. ADV 처리에 의한 ALP 염색 및 활성

MSCs와 MG63 세포에서의 ADV가 골형성 분화능에 미치는 영향을 평가하였다. MSCs와 MG63 세포에 ADV를 10 μg/mL 와 50 μg/mL의 농도로 처리하고 ALP 염색을 통하여 골 분화 촉진 및 골 분화 억제 능력을 평가하였다. MSCs 세포의 골 분화 평가에서는 ADV 에 의하여 ALP 염색과 활성은 유의성있게 감소하였고 이는 골 분화 억제 효과에 영향이 있는 것으로 확인하였다(Figure 4A, 4B). 반면에 MG63 세포의 골 분화 평가에서는 ADV 에 의하여 ALP 염색과 활성은 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 확인하였다(Figure 4C, 4D).

Fig. 4. ALP staining and activity by ADV treatment. (A, B) In the evaluation of osteogenic differentiation of MSCs cells, ALP staining and activity were significantly reduced by ADV, which was confirmed to have an effect on the inhibitory effect on osteogenic differentiation. (C, D) On the other hand, in the evaluation of osteogenic differentiation of MG63 cells, ALP staining and activity tended to decrease due to ADV, but there was no statistically significant difference. Bar=500 μm. Values are expressed as mean±SD. *P<0.05 compared with the control group (0 μg/mL of ADV).
Abbreviations: ALP, alkaline phosphatase; ADV, adefovir dipivoxil; MSCs, mesenchymal stem cells; OM, osteogenic induction media; ns, not significant difference.

ADV는 만성 HBV와 HIV 감염을 치료하는 초기 치료제로 임상에서 많이 사용되고 있다[16, 17]. 특히 만성 B형 간염의 치료 시 ADV를 장기간 복용했을 때 약효가 지속적으로 유지되며 HBV 역가가 의미 있게 감소하는 것으로 나타났다[18]. 그러나 ADV의 장기복용은 신장 손상, 골연화증, 판코니 증후군 등 다양한 부작용이 나타나는 것으로 보고되고 있다[19, 20]. 장기적인 약물 복용에 의해 발생한 판코니 증후군은 근위세뇨관 수송 기능 장애를 특징으로 하며 신당뇨증, 아미노산뇨증, 인산염뇨증 등과 같은 임상적인 증상으로 저칼륨증, 저인산혈증, 저칼슘혈증으로 인한 골다공증을 유발할 수 있다[21].

골다공증은 골밀도가 정상보다 낮은 골감소증을 특징으로 하는 대사성 뼈 질환이다[22]. ADV 장기복용에 의한 골다공증 부작용 유발이 보고되고 있으나, 이와 관련된 세포학적 연구가 미흡하다. 따라서 본 연구에서는 중간엽 줄기세포와 골아세포 모델을 이용하여 ADV 약물과 골다공증 유발 부작용에 미치는 생물학적 연관성을 조사하였다.

약물에 의한 세포 증식과 형태학적 변화를 관찰하기 위해 MSCs와 MG63 세포에 ADV를 농도 의존적으로 처리하였다. 이에 대한 결과에서는 ADV 처리에 의해 MSCs와 MG63 세포 증식이 유의한 수치로 감소되었음을 확인할 수 있었다(Figure 1). 또한, ADV 처리로 인해 MSCs와 MG63 세포의 세포 크기 비율 및 핵 크기가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(Figures 2A, 3A). 세포 비대 현상은 세포의 분열을 제한하고, 세포사멸을 유도하여 연골 조직 형성 및 골 분화를 억제하는 작용 기전과 연관되어 있다고 보고되고 있다[23, 24].

TGF-β는 뼈 기질에서 가장 풍부한 사이토카인 중 하나로써, 연골세포의 전체 수명주기에 영향을 미치고 세포 생존, 증식, 이동 및 분화를 포함한 일련의 세포 반응을 중재하는 역할을 한다[25, 26]. 또한 연골 분화와 연골 세포 비대 사이의 균형을 유지하는데 관여하므로 이의 조절 역할은 연골 발달에 특히 중요한 것으로 보고되고 있다[27]. 세포 내에서 증가된 TGF-β는 두가지의 역할을 한다. 첫번째로, 건강한 조직에서는 연골세포 생존을 촉진할 수 있다. 두번째로는 골관절염이나 골 손상 시 질병의 진행을 가속화할 수 있다[28]. 이전 연구에 의하면, TGF-β를 과발현하는 형질전환 마우스의 조골세포에서 골 파괴의 증가 및 뼈 재형성의 주요 결함에 기인하는 것으로 나타났으며 이러한 결과는 골다공증, 부갑상선 기능 항진증, 골 대사성 뼈 질환의 국소 발병의 기인할 수 있을 것으로 보고되었다[29]. 본 연구 결과에서는 ADV 처리로 인해 MSCs 세포에서 TGF-β 발현이 유의한 수치로 증가되는 것으로 확인할 수 있었다(Figure 3B). 따라서 ADV 처리에 의한 MSCs 세포의 증식 억제 및 세포 비대 현상은 TGF-β 신호전달 기전과 연관되어 있는 것으로 사료된다. 이전 연구에서 TGF-β가 중간엽 다능성 세포주 C3H10T1/2 세포와 조골세포주 MC3T3-E1 세포에서 MAPK-ERK 경로를 활성화하고, 골형성 마커인 ALP와 Alizarin red S 염색으로 골형성이 억제되는 것을 보고하였다[30]. 본 연구 결과 ADV에 의한 ALP 염색과 활성 감소를 확인함으로써(Figure 4), TGF-β 발현 증가에 따라 골 분화 억제 효과에도 영향이 있는 것으로 사료된다. 그러나 이 연구의 한계는 세포주에 ADV를 처리하여 나타나는 변화를 분석한 것으로 HIV와 HBV의 감염 후 ADV를 복용 시 체내에서의 반응과 차이가 있을 수 있다는 점이다. 또한 이 연구는 생체 외(in vitro) 시험으로 세포주에 ADV를 처리하였기에 실제 ADV의 장기복용 기간과 상이할 수 있다. 따라서 생체 내(in vivo) 시험을 진행하여 ADV의 장기복용에 따른 골다공증의 발생 메커니즘을 파악하는 연구를 추가적으로 진행할 필요가 있다.

결론적으로, 본 연구에서는 ADV 약물이 MSCs와 MG63 세포의 TGF-β 발현을 증가시켜 세포 증식을 억제하고, 세포 형태 및 핵의 비대증을 유발하여 골모세포 분화능에 영향을 줌으로서 골다공증 발병에 기인할 수 있는 가능성을 확인하였다. 이러한 결과는 ADV 장기간 복용에 의한 약물 부작용인 골다공증 발병 원인을 세포학적으로 이해하는 기초 연구이며, 약물 부작용을 예방하기 위한 목적으로 임상에서 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Adefovir dipivoxil (ADV)은 간염 바이러스 및 에이즈 치료제로 사용되고 있으나 장기간 복용 시 부작용으로 골다공증을 유발할 수 있다. 골다공증은 골밀도 감소를 특징으로 하는 질환으로 ADV와 골 분화 억제의 상관성에 대한 연구가 필요하다. 이에 대한 연구를 위해, 미분화 세포인 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells. MSCs)와 골아세포(MG63)를 이용하여 ADV가 미분화 세포 수준에서 골세포 성숙과정에 미치는 영향력을 평가하였다. 먼저, MSCs와 MG63 세포에 ADV를 농도별로 처리한 후 각 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 Cell Counting Kit-8 분석을 시행하였다. 또한 각 세포와 핵의 형태학적 분석을 위해 crystal violet과 Hoechst 염색을 시행하였다. 세포의 비대 현상의 원인을 규명하기 위해 TGF-β 발현을 조사하였고, 이에 따른 MSCs와 MG63 세포의 성숙한 골세포로의 분화도를 확인하고자 ALP 염색과 활성도를 측정하였다. 그 결과, ADV는 MSCs와 MG63 세포에서 핵과 세포질의 비대 현상, 세포의 증식능 억제, 성숙 골세포로의 분화 능력의 감소를 유발 할 수 있음을 확인하였다. 이러한 현상은 ADV가 TGF-β 발현을 증가시키는 것과 관련이 있었고, TGF-β의 증가는 MSCs와 MG63 세포부터 성숙한 골세포로의 분화 억제에 관여하고 있음을 시사하고 있다. 결론적으로, ADV 약물은 MSCs와 MG63 세포의 TGF-β 발현을 증가하여 세포 형태와 핵의 비대증을 유발하며, 세포의 증식억제 및 성숙한 골세포 분화능에 영향을 주어 골다공증을 유발할 수 있음을 확인하였다. 따라서 ADV 복용에 따른 부작용을 규명하기 위해 세포학적 수준에서 골다공증 유발에 미치는 생물학적 상관성과 원인을 이해하기 위한 근거자료로서 기초의학과 임상연구에 이용 될 수 있을 것으로 사료된다.

None

This paper was supported by Wonkwang Health Science University in 2023.

None

Park H, Professor.

The article is prepared by a single author.

This article does not require IRB/IACUC approval because there are no human and animal participants.