사람백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA) deoxyri-bonucleic acid (DNA) 형별(typing)검사는 고가의 시약으로 인해 검사비용 또한 고가의 수가로 진행된다. 한번 검사 시에 DNA를 추출하는 단계부터 polymerase chain reaction (PCR) 증폭, 3시간 이상의 검사자의 검사과정을 거쳐서 Luminex^Ⓡ (Luminex Corp.)라는 검사장비에서 측정, 측정값을 가지고 소프트웨어를 통해 결과분석, 원내 망으로 인터페이스 하여 임상에 환자의 결과를 보고하기까지의 수많은 시간과 노동력이 소모된다. 5∼6시간 이상의 시간과 인력이 소모되어 나온 HLA-DR값이 해당 검사에서 빈번히 발생하는 특이 bead (#087, #051, #006)들의 위양성, 위음성 및 high-background로 인해 모호하게 되어 그 결과를 확인하는 재검사가 들어가게 된다면 불필요한 또 한번의 시간, 인력, 그리고 시약의 소모가 이루어진다. 따라서 HLA-DR typing시에 나타나는 위양성과 위음성, high-background로 인한 특이 bead (#087, #051, #006)의 cut-off 수정을 야기시키는 요인을 규명한다면, 장기이식을 준비하는 수혜자와 기증자의 HLA typing 재검으로 인한 불필요한 소모 없이 결과를 정확하게 산출할 수 있으며, 특히 정확한 기증자의 HLA typing 결과를 가지고 수혜자에 대한 정확한 공여자특이항체(donor specific antibody, DSA) 분석이 가능하여 고형장기이식을 진행하는 임상에 정확한 정보를 제공하여 환자의 치료 및 좋은 예후에 기여할 수 있다. 특히 DR4의 경우 DR4 항원을 표현하는 대립유전자(allele)의 종류가 많기 때문에, DSA 분석을 위한 HLA 형별의 분석결과는 2 digits 보다는 4 digits 수준의 해상도 결과가 더 유용하다고 할 수 있다. 따라서, 이번 연구 즉, 6개월간 LABType^TM HLA-DR typing 사례분석을 통해 검사 시 특이 bead 반응의 cut-off를 야기시키는 요인을 분석하고, 검사 시 주의해야 할 상황을 규명한다면, 정확한 HLA-DR의 중저해상도(intermediate resolution)의 값을 산출할 수 있고, 저해상도 방법의 HLA typing을 시행하는 기관에 정확한 정보 분석에 활용할 수 있는 유용한 경험사례가 될 것이며, 아울러 불필요한 시약소모, 시간, 인력소모를 줄이고, 재검 필요를 줄이기에 임상에 turn around time 안에 정확한 결과를 보고하여 병원의 핵심가치인 환자안전에 기여할 수 있으며, 규명된 정확한 결과를 보고하기에 검사자가 더욱 자신감을 가지고 일할 수 있고, 더 나아가 검사 건수가 적은 중소병원 작업종사자들에게도 유익한 자료로 사용될 수 있을 것이다.

서울대학교병원 진단면역검사실에서는 장기이식과 연관된 주조직적합성검사로서 신장, 간, 심장 그리고 폐 등의 고형장기 이식을 준비하기 위한 수혜자와 기증자의 HLA 검사를 시행하고 있다. HLA는 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 중의 한 부분에 해당하고 이 MHC 시스템은 면역 시스템의 중요한 역할을 하며, 신체의 면역 체계 중 어느 세포가 자기(self)인지, 비자기(non-self)인지를 구별하는 기능을 한다. 따라서 비자기로 인식되는 모든 세포는 항체의 생산을 포함한 면역 반응을 일으킬 수 있기에 장기이식 환자에서 이식 전후 및 예후를 위해 매우 중요한 검사이고, HLA 유전자와 관련된 질병연관성 연구에도 사용되는 검사이다. HLA 검사는 크게 HLA 항원의 형별을 판정하기 위한 HLA typing 검사와 HLA 항체검사로 나누어진다. 이 연구에는 HLA 형별검사로 HLA-A, HLA-B, HLA-C (이상 class I), HLA-DR, HLA-DQ (이상 class II) typing 중 HLA-DR 형별검사에서 나타난 현상에 대하여 논의할 것이다.

HLA-DR 검사는 정확한 형별 판정이 장기이식과 질병연관성 검사연구에서 매우 중요하며[1, 2], HLA-DR을 결정짓기 위한 검사는 혈청학적 검사, 분자유전학적 검사로 크게 나눠서 볼 수 있다. 혈청학적 방법은 B 림프구를 분리하기 어려운 환자, 즉, 혈액 관련 질환환자, 뇌사자, 신생아 등에서는 적용하기 힘들고 항혈청의 교차반응으로 인해 판독에 어려움이 있을 수 있다[3, 4]. 또한 비혈연 개체 간의 장기이식이나 질환 감수성 연구에는 대립유전자 수준의 형별 판정이 필요한 데[5, 6], 혈청학적 방법으로는 이것이 불가능하다. 이러한 단점을 해결하고자, 1990년대 말에는 여러 가지 분자유전학적인 HLA-DR 검사법이 개발되어 널리 적용되었었고[7-10], 국내에서는 PCR sequence specific oligonucleotide (SSO) 기법을 이용하는 키트로서 INNO-LiPA HLA-DRB (Innogenetics)와 Dynal RELITM SSO HLA-DRB Test (Dynal A.S) (이하 Dynal DRB) 가 주로 사용되었었다. 그러나 두 가지 키트를 가지고 검사 시에도 일부 검체에서는 정확한 HLA-DR 형별 판정이 이루어지지 않았고, 추가적인 방법을 이용하여 검사실마다 형별 판정을 하기 위한 재확인 단계를 시행하는 등의 어려움을 겪었다[11-15]. Dynal DRB 키트는 reverse line blot hybridization [16] 방법을 이용하여 PCR 증폭산물을 HLA-DRB1, DRB3, DRB4, 그리고 DRB5 유전자 부위의 특정 대립유전자 염기서열에 특이적인 SSO probe 가 부착된 nylon membrane strip에 반응을 시키도록 제작된 것으로 서울대학교병원에서는 1997년 7월부터 본 키트를 이용하여 2012년까지 HLA-DRB 형별 검사를 시행하였고, 본 키트의 결과 판정시에는 앞서 언급한 바와 같이 많은 경우에 저해상도 수준의 형별 판정에도 모호성(ambiguity)이 있어 추가로 PCR single strand conformation polymorphism을 이용하여 형별 판정에 대한 확인검사를 실시하여 판정에 대한 모호성을 해결하여 왔다. 또한 Dynal DRB을 이용하여 DRB1 형별 판정시에 판정의 모호성 빈도를 ‘한국형 해석 프로그램’을 사용하여 보다 정확한 HLA-DR 형별 판정이 가능하다고 하였으나[12] 대규모의 검사건수를 실행하기에는 한계가 있다. 그 후 계속되는 기술의 발달로 DNA를 기반으로 하는 조직적합성 검사가 행해졌으며, Luminex^Ⓡ기술을 적용하여 SSO 방법의 HLA-DR 검사가 이루어져 왔다. 주요 시약제조사는 LIFECODES HLA-DR SSO typing kit (Immucor) 와 One Lambda의 LABType^TM이 사용되어지고 있다. 2019년 7월부터 본 검사실에서는 HLA-DR 검사시에 시행하는 LABType^TM SSO를 사용하여 왔다. One Lambda의 LABType^TM시약은 sample DNA로부터 대립유전자를 식별하기 위해 형광염색된 microsphere에 붙어있는 SSO probe를 이용한다. PCR로 DNA를 증폭한 후, 교잡(hybridization)과 검출(detection) 과정이 단일 반응 혼합물에서 이루어지므로 소규모 및 대규모 검사 모두 가능하다. 전통적 방법의 혈청학적 방법의 림프구 세포독성검사 수치(1=음성∼8=양성)로 결과를 결정짓는 것과는 대조적으로, LABType^TM test는 각 bead 반응이 정해진 cut-off에 따라 해당 bead의 cut-off 수치보다 크면 양성, 작으면 음성의 결과가 나오고, 이에 따른 해당 결과의 소프트웨어를 통해 분석을 하니 복잡한 해석이 불필요하다는 장점이 있고 또한, 혈청학적 형별검사(serological typing)는 교차반응 그룹(cross-reactive groups)을 구별하는데 어려움이 있지만, single nucleotide의 변화는 PCR-SSO를 통해 구별될 수 있다. 2019년 7월부터 본 검사실에서는 HLA 형별검사로서 One Lambda의 LABType^TM을 가지고 HLA typing을 실시하였다. 2019년 6월 One Lambda의 LABType^TM시약의 유효성 평가 후 2019년 7월부터 12월까지의 고형장기이식 수혜자와 기증자들을 위한 저해상도 방법의 HLA-A, HLA-B, HLA-C (이상 Class I), HLA-DR, HLA-DQ (이상 Class II) typing 중에서 HLA-DR locus에서의 결과 산출 중 검사시행 건수 611건 중 Lot No. 20의 시약에서 빈번히 나타나는 특이 bead (#087, #051, #006)의 위양성 및 위음성, high-background로 의심되는 현상이 나타나 형별 판정에 모호성이 있는 것을 발견하였다. 이 특이 bead들의 반응 cut-off를 수정을 해주어야만 HLA-DR (G1) 값을 산출할 수 있었다. 여기서 G1값이란 the international ImMunoGeneTics information system (http://www.imgt.org)에서 제시하는 common한 두 개의 대립유전자가 매치되어 한 쌍을 이루는 group, G2값은 common한 대립유전자와 rare한 대립유전자로 구성된 group, G3는 rare한 대립유전자 한 쌍으로 구성된 group으로 구성되어 Fusion이라고 하는 시약 제조사의 분석 소프트웨어를 통해 분석되어진다(Figure 1).

Fig. 1. Analysis screen of Fusion software.

본 연구는 이러한 특이 bead 반응들의 위양성, 위음성 및 high-background로 의심되는 사례를 모아서 cut-off 수정이 야기되는 여러 변수를 찾아서 원인을 검토하고자 하였고, 6개월간 bead 반응의 cut-off 수정 없이 정상적으로 산출된 G1값 533건과 특이 bead의 cut-off 수정을 한 78건의 case들을 가지고 cut-off 수정을 야기시키는 공통된 요인을 찾고자 하였는데, 첫 번째는 해당 검사의 DNA 농도의 유사성을 검토하였고, 두 번째는 cut-off 수정을 한 해당 검체의 수혜자나 상대적으로 건강한 기증자의 장기별로 공통적인 특징이 나타나는 것인지를 알아보기 위해 신장 수혜자, 신장 기증자, 간 수혜자, 간 공여자, 조혈 모 이식 공여자 등의 범주 및 나이, 성별로 나누어 조사해 보았다. 다음으로 검사일의 습도에 따라, HLA-DR 검사시에 나타나는 위양성, 위음성, high-background로 의심되어 cut-off 수정 후에 결과값을 보고한 사례 건수를 관찰하였다. 따라서, 2019년 7∼12월까지의 특이 bead의 cut-off 수정 횟수와 해당 검사일에 따른 검사실의 습도를 비교하고자 하였다.

검사일마다 나타나는 cut-off 수정의 빈도가 검사실의 습도에 따라 달라지는 것을 고찰하면서, 검사실의 환경에 대해 언급된 문서들을 찾아보았는데, 여러 나라 중 미국의 경우를 예를 들어보면, 미국 병리학회(College of American Patho-logists)에서는 가입된 해당되는 병원의 관련 검사실마다 적절한 인증기준을 제시하고 인증을 시행한다. 그리고 Clinical and Laboratory Standards Institute에서는 임상검사실에서 갖춰져야 할 상세기준을 권장하고 제시하고 있다[17]. 예를 들면, 검사실의 분석 장비를 운용하기 위해서는 단전에 대비하여 uninterrupted power supply 체계 및 기관 내 자가발전 연결 체계를 갖추고 있는지 등 검사실의 환경 및 구비 목록에 대해서 지침을 제시하고 있으며, “실내 온도 및 습도는 검체나 시약의 증발을 최소화하고, 실온배양이 잘 되며, 장비 가동에 문제가 없도록 유지되어야 한다.”라고 언급하고 있다. 또한, Burtis 등[18]에 따르면. 검사실 내 시료 증발에 영향을 미치는 환경적인 요소로서 온도, 습도, 공기 흐름으로 나누어 낮은 습도상태의 증발로 인한 화학검사의 분석적 오류에 대해 논하였다. 여기에 습도에 따른 증발에 화학 검사상에 오류가 있다는 내용을 관찰하였고, Glenn 등은 여러 가지 상태에 보관하였던 시료를 사용하여 광범위하게 증발의 효과를 연구하였는데, 그중 75℉, 습도 13%인 실온에서는 9.3%가 감량됨으로써 최고로 떨어진 수치를 보여주었다고 하였다[19, 20].

본 검사실에서 HLA typing 검사과정의 경우 준비 단계부터 표적목표 DNA (target DNA)를 얻기 위해 증폭시키기 위한 시약처리과정, 증폭된 DNA를 가지고 변성, 중화까지의 과정, 교잡 후 워싱, 라벨링 후의 처리 과정은 모두 장비가 아닌 검사자의 손으로 검사실의 실온 상태에서 진행이 이루어진다. 이에 따라 이번 연구는 장비의 온도, 습도뿐 아니라, 검사자가 검사자의 손으로 처리하는 과정에 검사실 온도와 습도로도 검사결과에 영향이 있을 것이라는 가설을 가지고 선행논문을 배경으로 하여 연구를 진행하였다.

LABType^TM은 SSO 기반의 HLA 형별 검사방법을 위해 Luminex^Ⓡ기술을 적용한다. 그 과정은 첫째로, 표적목표 DNA는 특정한 그룹의 프라이머를 사용하여 PCR 단계로 증폭된다. PCR 혼합물은 biotinylated되고, R-Phycoerythrin-conjugated Streptavidin (SAPE; PE)를 이용해 검출된다. 단일가닥으로 분리된 PCR 산물은 형광 microspheres에 결합되어 있는 상보적 DNA probe에 다시 붙는다. Luminex^Ⓡ 와 LABScan^TM 100 (Luminex^Ⓡ 100/200) 또는 LABScan3D^TM (Luminex^Ⓡ FLEXMAP 3D) 와 같은 microflowcytometry는 각 미립구에 있는 피코에리스린의 형광 강도를 식별한다. HLA 분석검사의 배정은 HLA유전자 수열와 결합된 패턴과 비교한 반응패턴을 기반으로 한다[21].

1. 검사과정

HLA-DR typing의 검사과정은 각 locus 마다 시약과 검사할 개수에 따라 PCR mixture를 만들고(Table 1), 해당 PCR 트레이의 well에 2 μL의 genomic DNA를 분주하여 PCR을 진행한다(Table 2).

Table 1

Amplification mixture

No. of reactions	D-mix (μL)	Amplification primer (μL)	Taq polymerase (μL)
1	13.8	4	0.2
10	138	40	2
50	690	200	10
96	1,491	432	21.6

Table 2

LABType^TM sequence specific oligonucleotide polymerase chain reaction program

Step	Temperature (℃), incubation time	No. of cycles
Step1	96, 03:00	1
Step2	96, 00:20	5
	60, 00:20
	72, 00:20
Step3	96, 00:10	30
	60, 00:15
	72, 00:20
Step4	72, 10:00	1
Step5	4, forever	1

PCR 진행 후 각 locus 별로 얻어진 증폭된 PCR product 5 μL 와 2.5 μ의 denaturation buffer를 섞어서 변성과정, 10분간 반응 후 5 μL의 neutralization buffer를 섞어서 중화과정, 여기에 1 test당 bead mixture 4 μL와 hybridization buffer 34 μL를 넣고 60℃에서 15분간 교잡반응 후 반응액을 제거하고 세척한다. 60℃에서 5분간 PE 라벨링 후 추가 세척과정을 거친 시료들은 Luminex^Ⓡ bead가 부착된 96-well plate에서 80 μL의 세척액으로 반응 후 Luminex^Ⓡ 장비를 이용하여 데이터를 측정한다. 측정 후 얻게 된 raw data를 시약사에서 제공하는 Fusion 분석 소프트웨어를 통해 분석한다. Luminex^Ⓡ Data Collector software에서 나온 평균형광강도(mean fluorescence intensity 또는 median fluorescence intensity, MFI)는 샘플의 각 비드에 대한 fluorescence intensity를 포함한다. 각 bead에 해당하는 probe 양성예측지수 계산법은 아래와 같다.

양성반응의 여부는 probe마다 미리 정해진 cut-off 값보다 높은 probe의 양성 값의 비율로 결정된다. 음성반응의 여부는 cut-off 값보다 낮은 양성 값의 비율로 결정된다. 조정된 quality control 조건에서, 음성제어 MFI는 대개 0∼100 사이이며, 시약의 lot와 locus-특정 제품에 따라 달라질 수 있고, 범위를 벗어나는 값은 검사 시에 통제되지 않은 DNA의 양이나 질, 검사자의 테크닉, 검사장비, 시약의 상태에 영향을 받을 수 있다[22]. 따라서, 이번 연구는 HLA-DR 시약 Lot No.20 으로 검사한 총 시행 건수를, 6개월 동안의 10년 이상의 HLA 검사 경험을 가진 동일 검사자의 숙련된 테크닉, 같은 장비를 이용하여 최대한 같은 조건으로 검사한 결과로부터 야기된 특이 bead (#087, #051, #006)의 cut-off 값을 조정해 주어야만 HLA-DR (G1) 값을 산출할 수 있었음에 착안하여 이들의 cut-off 보다 값이 크게 나타나는 것을 음성화하여 G1으로 수정한 사례는 위양성, cut-off 보다 값이 적게 나타나는 것은 양성화하여 G1으로 수정한 사례는 위음성으로 사례를 분류하여 cut-off를 조정해주어야만 했던 case 들의 원인을 찾고자 한 것이다.

2. 연구 설계

2019년 7월부터 12월까지 본 검사실에 HLA-DR typing으로 의뢰된 고형장기 이식을 준비하는 수혜자, 기증자의 DNA 결과 611건 중 특이 bead의 cut-off 수정사례가 야기되지 않고 정상적으로 검사결과를 산출한 533 case들과 특이 bead의 cut-off 수정사례가 야기되어 결과를 보고한 HLA-DR 결과 78 case들을 가지고 연구 분석을 하였다. 표본의 인구통계특성과 cut-off 수정 여부를 확인하기 위해 빈도분석을 시행하였고, 습도의 경우 연속형 척도로 기술통계를 통해 평균과 표준편차를 조사하였으며, cut-off 수정 여부에 따른 습도의 차이를 검증하기 위해 독립표본 t검증을 실시, cut-off 수정 여부와 인구통계특성의 연관성을 확인하기 위하여 교차분석을 실시하였다. 마지막으로 습도 수준에 따른 cut-off 수정 비율의 차이를 검증하기 위해 검체 대상자의 연령, 성별, 장기별 구분(신장이식 수혜자, 간이식 수혜자, 장기별 도너를 합하여 정상인그룹으로 범주 명시 등)과 같은 통제변수를 고려하여 로지스틱 회귀분석을 실시하였다. 본 연구에 사용된 검체는 본 검사실에 의뢰된 전혈 검체에서 추출한 DNA 결과이고, DNA 추출 장비로는 Chemagic 360D (Revvity chemagen Technologie GmbH)를 사용했다. HLA-DR SSO 검사 시약으로는 LABType^TM SSO Class II DRB1 Typing Test, Lot No. 20 (One Lambda, Inc.)을 이용하였고, 고해상도방법(SBT) 시약으로는 SeCore DRB1 Locus Sequence Kit, Lot No 008 (One Lambda, Inc.)을 사용하였다. 결과분석 software로서 Fusion 4.3.1 (One Lambda, Inc.), PCR 장비로 AB Applied Biosystems Veriti 96 Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Solutions LLC), SSO 검사장비로는 MILLIPLEX Analyzer (Luminex^Ⓡ)와 xPONENT (Luminex^Ⓡ) 프로그램을 사용하였고, SBT 검사장비로는 Genetic Analyzer ABI 3500xL (Thermo Fisher Scientific Solutions LLC)과 uType 7.1 (Thermo Fisher Scientific Solutions LLC)을 사용하였다.

3. 자료 수집

시약 제조사가 권장하는 사양 내에 있는 정상표본과 분석 및 데이터 수집조건을 사용하는 경우(예를 들면 genomic DNA 농도 20 ng/μL와 순도는 optical density 260/280 1.65와 1.80 사이, hybridization incubation 온도와 washing 조건, 그리고 Luminex^Ⓡ기기 상태) 양성 및 음성 여부는 샘플의 상대적 평균 형광강도를 해당 cut-off 값과 비교하여 결정한다. 이때 cut-off 값은 LABType^TM SSO 제품 Lot의 실험결과에 기반을 두어 정해지며, 이 값은 HLA genotype 샘플을 기준으로 양성과 음성 값을 구분하는 데 쓰인다. 실험결과는 특정 HLA 대립 유전자의 존재 및 부재 여부를 반영하고 이를 통해 확실한 typing 결과를 준다는 전제하에 2019년 7∼12월 사이 서울대학교병원 세포 면역검사실에 HLA-DR typing (저해상도)으로 의뢰된 고형장기 이식을 위한 수혜자, 기증자의 HLA-DR typing 결과 611건 중 특이 bead의 cut-off 수정사례가 야기되지 않고 정상적으로 검사결과를 산출한 533 case들과 특이 bead의 cut-off 수정사례가 야기된 HLA-DR 결과 78 case들을 가지고 연구 분석하였고, cut-off 수정을 야기시키는 여러 가지 변수들을 규명하고자 하였다. 구체적으로 검사시행일별로 cut-off 수정한 건수를 산출하여 해당 검사일에 검사실 온도 및 습도에 영향을 주는지 알아보고자 하였다. 이 연구와 관련된 자료 수집 및 분석은 서울대학교 의과대학/서울대학교병원 의학연구 윤리심의위원회(Institutional Review Board; IRB No. H-2209-075-1358)의 승인 하에 시행되었다.

4. 변수의 측정

독립변수는 습도로 검사실의 습도계는 Sato 온습도계, PC-5000TRH II를 사용하였고, 검사실 내 습도계 위치상 검사실 입구 1, 검사실 중앙 2의 습도계 두 개의 값을 평균하여 HLA-DR 검사일과 비교하였다. 종속변수는 세 개의 특이 bead를 통합하여 cut-off 수정 여부 갯수로 결정하였다. 통제변수는 해당 검체의 나이, 성별, 장기별 수혜자/기증자 여부 등을 고려하고자 하였다.

5. 분석방법

첫째, 표본의 인구통계특성과 cut-off 수정 여부를 확인하기 위해 빈도분석을 진행하였다.

둘째, 습도의 경우 연속형 척도로 기술통계를 통해 평균과 표준편차를 조사하였다.

셋째, cut-off 수정 여부와 인구통계특성의 연관성을 확인하기 위하여 교차분석을 실시하였다.

넷째, cut-off 수정 여부에 따른 습도의 차이를 검증하기 위해 독립표본 t검증을 실시하였다.

마지막으로 습도 수준에 따른 cut-off 수정 비율의 차이를 검증하기 위해 통제변수를 고려하여 로지스틱 회귀분석을 실시하였다.

1. 검체 대상자의 일반적 특성 및 cut-off 수정 여부

Cut-off 수정 여부에 대한 빈도 분석결과는 Table 3과 같다. 총 611개의 검체 중 78개(12.8%)가 cut-off 수정, 533개(87.2%) 가 cut-off 수정 없음이었다. 검체 대상자의 성별은 남자 356명(58.3%), 여자 255명(41.7%)로 나타났다. 장기별 구분은 신장이식 수혜자(kidney recipient, KR)가 289명(47.3%)으로 가장 많았고 신장이식 공여자(kidney donor, KD)가 116명(19.0%), 간이식 수혜자(liver recipient, LR)는 78명(12.8%), 조혈모이식 공여자(bone marrow donor, BMD)는 48명(7.9%), 간이식 공여자(liver donor, LD)는 47명(7.7%), 기타 33명(5.4%)으로 나타났다.

Table 3

Frequency analysis of general characteristics and cut-off corrections status of specimen subjects (N=611)

Characteristic	Frequency
Cut-off correction
No	533 (87.2)
Yes	78 (12.8)
Sex
Male	356 (58.3)
Female	255 (41.7)
Organ
KR	289 (47.3)
KD	116 (19.0)
LR	78 (12.8)
BMD	48 (7.9)
LD	47 (7.7)
Etc.	33 (5.4)

n (%).

Abbreviations: KR, kidney recipient; KD, kidney donor; LR, liver reci-pient; BMD, donor for bone marrow transplantation ; LD, liver donor.

2. 검체 대상자의 연령 및 습도에 대한 기술통계

습도와 cut-off 수정 여부의 관련성 파악에 앞서서 검사실 내부에 두 개의 습도계의 상관관계를 검사한 결과 상관관계가 0.977로 유의미한 정의 관계가 있음을 확인하였다(P<0.001). 따라서 두 습도의 평균값으로 이후 분석에 활용하고자 하였다. 습도의 경우 최소 12.5%에서 62.5% 분포하였으며 평균 37.980, 표준편차는 17.827로 나타났다. 본 분석에 활용된 표본의 평균나이는 52.91세 나이의 표준편차는 14.436으로 최소 4세에서 85세의 표본이 연구에 포함되었다(Table 4).

Table 4

Descriptive statistics of the used variables (N=611)

Characteristic	Minimum	Maximum	Average	Standard deviation
Age (yr)	4	85	52.91	14.436
Humidity (%)	12.50	62.50	37.9808	17.82705

3. Cut-off 수정 여부와 검체 대상자의 일반적 특성의 관계

Cut-off 수정 여부와 인구통계정보 간의 유의미한 연관성을 확인하기 위하여 교차분석을 실시하였다. Cut-off 수정 여부와 성별 및 장기별 구분 사이의 교차분석을 하기 위해 신장이식 수혜자, 간이식 수혜자범주와 신장이식 공여자, 간이식 공여자, 조혈모이식 공여자의 경우는 정상인으로 통합하여 구분하였다. Table 5와 같이 cut-off 수정 여부와 성별에 따른 두 변수 간의 유의미한 연관성이 나타나지 않았다(P=0.722). Cut-off 수정 여부와 장기별 구분 간의 교차분석 결과 또한 두 변수 간의 유의미한 연관성이 나타나지 않았다(P=0.079).

Table 5

Cross-analysis of cut-off corrections status with sex and organ-specific differentiation (N=611)

Characteristic	Cut-off correction		χ2	P
	No (N=533)	Yes (N=78)
Sex			0.127	0.722
Male	312 (58.5)	44 (56.4)
Female	221 (41.5)	34 (43.6)
Organ			6.78	0.079
Donor	176 (33.0)	35 (44.9)
KR	258 (48.4)	31 (39.7)
LR	67 (12.6)	11 (14.1)
Etc.	32 (6.0)	1 (1.3)

n (%).

Abbreviations: KR, kidney recipient; LR, liver recipient; Donor, donors group for kindney, liver, bone marrow transplantation.

4. Cut-off 수정 여부와 습도와의 관계

Cut-off 수정 여부에 따른 습도, 연령의 평균 차이를 검증하기 위해 독립표본 t검정을 실시하였다. Table 6과 같이 분석결과, cut-off 수정 여부에 따른 유의미한 습도 차이가 나타났다(P=0.044). 구체적으로, cut-off 수정 없음(M=38.574, SD=17.601)의 경우보다 cut-off 수정(M=33.926, SD=18.928)일 때의 습도가 유의미하게 낮았다. Cut-off 수정여부에 따른 습도의 분포는 Figure 2와 같다. 반면, cut-off 수정 여부에 따라 유의미한 연령의 평균차인 나타나지 않았다(P=0.161).

Fig. 2. Distribution of the relationship between the humidity and cut-off correction.

Table 6

Independent samples t-test to verify the mean differences in humidity and age according to cut-off corrections status (N=611)

Characteristics		N	Average	Standard deviation	t	P*
Age (yr)	Non cut-off correction	533	38.574	17.601	2.043	0.044
	Cut-off correction	78	33.926	18.928
Humidity (%)	Non cut-off correction	533	53.22	14.605	1.403	0.161
	Cut-off correction	78	50.77	13.115

*P<0.05.

5. 습도가 cut-off 수정 비율에 미치는 영향

습도에 따른 cut-off 수정 발생 비율을 검증하기 위하여 cut-off 수정 발생(0: 수정 없음, 1: cut-off 수정)을 종속변수로 한 로지스틱 회귀분석을 진행하였다. 로지스틱 회귀분석의 경우 유의확률과 함께 오즈비(odd ratio, OR)를 통해 비율의 변화를 확인할 수 있다. 분석에 앞서 교차분석에서 cut-off 수정 여부와 통제변수로 사용된 성별, 연령, 장기별 구분을 통제변수로 활용하였다. 습도에 따라 발생하는 cut-off 수정비율을 구체적으로 검증하기 위하여 두 번의 로지스틱 회귀분석을 진행하였다. Model 1에서는 습도를 연속형 변수로 투입하여 습도가 한 단위 증가할 때 cut-off 수정비율의 유의미한 증감을 확인하였다. Model 2에서는 정상습도 범위 30%∼50%를 기준 그룹으로 20 미만인 그룹, 20%∼30% 이상인 그룹, 50 초과인 그룹의 cut-off 수정비율의 유의미한 증감을 확인하였다.

Model 1의 분석결과는 다음과 같다. Hosmer 및 Lemeshow 검정은 예측결과와 관측결과의 유의미한 관계를 검증하는 것으로 P값이 0.05 이상일 때 예측결과와 관측결과에 유의미한 차이가 없어 분석이 적절함을 이야기한다. Model 1의 Hosmer 및 Lemeshow 검정의 유의확률 값은 0.900으로 나타났다. 따라서 본 데이터는 로지스틱 회귀분석에 적절함을 확인하였다. 또한, Cox 및 Snell R²=0.022, Nagelkerke R²=0.041로 독립변수들은 약 2.2%∼4.1%의 설명력을 가지는 것으로 나타났다. 구체적으로, 습도가 한 단위 증가할 때 cut-off 수정이 0.986배 감소하는 것으로 나타났다(OR=0.986, P=0.035).

Model 2의 분석결과는 다음과 같다. Model 2의 Hosmer 및 Lemeshow 검정의 유의확률 값은 0.201로 나타났다. 따라서 본 데이터는 로지스틱 회귀분석에 적절함을 확인하였다. 또한, Cox 및 Snell R²=0.038, Nagelkerke R²=0.071로 독립변수들은 약 3.8%∼7.1%의 설명력을 가지는 것으로 나타났다. 구체적으로, 습도가 정상범주(30% 이상 50% 이하)일 때 보다 20% 미만이면 cut-off 수정이 3.541배 증가하는 것으로 나타났다(OR=3.541, P=0.003). 습도가 정상범주(30% 이상 50% 이하)일 때 보다 20%∼30% 미만이면 cut-off 수정이 3.892배 증가하는 것으로 나타났다(OR=3.892, P=0.006). 반면, 정상범주(30% 이상 50% 이하)와 50% 초과일 때 cut-off 수정비율의 유의미한 차이가 나타나지 않았다(OR=1.774, P=0.172). 이러한 결과는 습도가 낮아질 때 cut-off 수정의 가능성이 커질 수 있음을 시사하여 구체적으로 30% 이하의 경우부터 cut-off 수정 가능성이 유의미하게 증가함을 확인할 수 있다. 습도에 따른 cut-off 수정 발생 비율을 검증하기 위한 로지스틱 회귀분석은 Table 7과 같다.

Table 7

Logistic regression analysis according to cut-off corrections status

Model 1						Model 2
Variable		OR	P*	95% CI		Variable		OR	P	95% CI
Humidity		0.986	0.035	0.973∼0.999		Humidity (%)	30∼50 (ref) (N=8)	1
							<20 (N=30)	3.541	0.003	1.551∼8.083
							20∼30 (N=12)	3.892	0.006	1.483∼10.21
							>50 (N=28)	1.774	0.172	0.779∼4.037
Sex	Male (ref)	1.000				Sex	Male (ref) (N=44)	1.000
	Female	1.076	0.769	0.660∼1.753			Female (N=34)	1.061	0.813	0.648∼1.739
Age		0.991	0.288	0.975∼1.008		Age		0.990	0.235	0.974∼1.007
Organ	Donor (ref)	1				Organ	Donor (ref) (N=35)	1
	KR	0.636	0.093	0.375∼1.079			KR (N=31)	0.670	0.142	0.393∼1.144
	LR	0.793	0.544	0.375∼1.677			LR (N=11)	0.778	0.517	0.364∼1.662
	Etc.	0.153	0.070	0.02∼1.165			Etc. (N=1)	0.168	0.086	0.022∼1.286
Constant		0.509	0.189			Constant		0.143	0.001

*P<0.05.

Abbreviations: OR, odds ratio; ref, reference; KR, kidney recipient; LR, liver recipient; Donor, donors group for kindney, liver, bone marrow transplantation.

앞서 연구한 결과에 따라 cut-off 수정 여부에 대한 빈도 분석결과는 총 611개의 검체 중 78개(12.8%)가 cut-off 수정, 533개(87.4%)가 cut-off 수정 없음이었다. 연구 대상자의 성별은 남자 356명(58.3%), 여자 255명(41.7%)으로 나타났고, 장기별 구분은 KR이 289명(47.3%)으로 가장 많았고 KD가 116명(19.0%), LR은 78명(12.8%), BMD는 48명(7.9%), LD는 47명(7.7%), 기타 33명(5.4%) 순으로 나타났다. 또한, 기술통계로서 습도와 cut-off 수정 여부의 관련성 파악에 앞서서 검사실 내부에 두 습도계의 상관관계로 검사한 결과 상관관계가 0.977로 유의미한 정의 관계가 있음을 확인하였다(P<0.001). 따라서 두 습도의 평균값으로 이후 분석에 활용하고자 하였다. 습도의 경우 최소 12.5%에서 62.5%에 분포하였으며 평균 37.98%, 표준편차는 17.827로 나타났다. 본 분석에 활용된 표본의 평균나이는 52.91세 나이의 표준편차는 14.436으로 최소 4세에서 85세의 표본이 연구에 포함되었다. Cut-off 수정 여부와 인구통계정보 간의 유의미한 연관성을 확인하기 위하여 교차분석을 하였는데, cut-off 수정 여부와 성별 간의 교차분석, 그리고 cut-off 수정 여부와 장기별 구분에 따른 교차분석(P=0.079) 결과 모두 두 변수 간의 유의미한 연관성이 나타나지 않았다(성별 간 P=0.722, 장기별 구분 P=0.079). Cut-off 수정 여부에 따른 습도, 연령의 평균 차이를 검증하기 위해 독립표본 t검정을 실시하였는데, cut-off 수정 여부에 따른 유의미한 습도 차이가 나타났다(P=0.044). 반면, cut-off 수정 여부에 따라 유의미한 연령의 평균차인 나타나지 않았다(P=0.161). 습도에 따른 cut-off 수정 발생 비율을 검증하기 위하여 cut-off 수정 발생(0: 수정 없음, 1: cut-off 수정)을 종속변수로 한 로지스틱 회귀분석을 진행하였고, 이러한 결과는 습도가 낮아질 때 cut-off 수정의 가능성이 커질 수 있음을 시사하여 구체적으로 30% 이하의 경우부터 cut-off 수정 가능성이 유의미하게 증가함을 확인할 수 있다. 상기 기술한 연구방법 외에 HLA-DR typing 검사 시 나타나는 cut-off 수정을 야기하게 되는 원인으로 해당 검체의 DNA 농도사이의 연관성을 검토하기 위해 78개의 cut-off 수정사례의 DNA 농도를 조사하였으나 농도차이의 연관성은 규명하지 못하였다. 또한 실험결과의 신뢰도를 위한 시약 lot 간의 동등성검사(comparability test between reagent lots) 결과는 Figure 3 과 같다.

Fig. 3. HLA-DR comparability test between reagent lots.
Abbreviations: PC, positive control; SD, standard deviation; CV, coefficient of variation.

HLA-DR typing을 시행할 때 나타나는 여러 cut-off 수정사례를 야기시키는 원인을 찾고자 했던 이번 연구를 통해, HLA typing을 시행하는 검사실 내 검사 과정 안에서 주의해야 할 여러 가지 요소들이 있지만, 검사를 실내에서 진행하게 되는 단계에서도 실내의 습도가 검사결과에 영향을 미칠 수 있는 요인 중 하나임을 알게 되었다. 검사결과에 영향을 미치는 검사실의 온도, 습도 및 여러 환경적인 요인에 관련된 선행논문은 주로 화학검사결과에 연관되어있는 선행논문이 주를 이루고 있다. 본 연구자는 면역학에 관련된 선행논문을 찾아보았으나, HLA에 연관된 선행논문은 주로 장기이식이나 질병 연관성 검사에 기인한 질병과 연관 지어 연구하는 선행논문이 주를 이룸을 알게 되었다. 또한, 많은 경우에 있어서 HLA 관련 논문의 주체가 주로 의료기관 안에서 HLA와 연관된 질병에 관해서 연구하는 의료진이다. 그리고 그 의료진들은 검사실에서 보고된 HLA 결과만을 가지고 질병과 연관 지어 연구를 진행하는 것이 주를 이루다 보니, 본 연구자처럼 검사 과정 안에서 일어나는 여러 이슈에 대한 선행논문은 부족한 상태이다. HLA typing 검사는 고가의 시약으로 진행되는 고가의 검사이다. 그리고 HLA 검사는 대부분 환자가 병원에 왔을 때 시행하는 일반혈액검사나 일반화학검사와 같이 보편적으로 시행하는 검사가 아닌 장기이식 및 질병 연관성이 있는 환자에게만 처방되는 검사인 고가의 검사이다 보니 검사 과정상에 나타나는 여러 이슈에 대한 연구결과 및 검사실의 환경적인 요인이 검사결과에 미치는 요인에 대한 선행논문은 찾기 어려웠다. HLA 검사는 고가의 시약으로 의료기관에서 장기이식 및 질병 연관성 검사의 경우에만 보험 혜택이 주어지고 있는 고로 추론할 수 있는 analytical error를 연구하기에는 아마도 시약의 단가나 환경적 요인을 달리하여 동시에 검사하기가 어려움으로 기인한 상황으로 생각된다. 따라서 향후 동일 검체를 이용하여 습도 변화에 따른 검사결과를 도출하기 위한 후속 연구를 제안하는 바이다. 또한 본 연구에서는 검사실 입구에 있는 습도계와 DNA 작업공간을 포함한 검사실 중앙에 있는 습도계의 평균값을 가지고 연구를 수행하였으나, 검사실의 단위 면적 및 온도, 습도 차이가 많은 환경적 요인이 달라진다는 점을 고려하여 향후에는 작업장소에 따른 습도의 변화를 반영한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 따라서 저해상도 HLA typing 시에 빈번히 나타난 cut-off 수정을 필요로 하는 원인을 규명하고자 한 이번 연구를 통해서 검사실의 습도 또한 검사결과에 영향을 미치는 요인 중 하나임을 인지하고 검사실의 환경 즉 적절한 온, 습도로 유지되도록 관리되어져야 할 것이다. 이번 연구결과를 통해 중소병원이나 상대적으로 검사 건수가 적은 기관에서는 실온으로 진행하는 단계의 저해상도 HLA typing 검사 시 검사결과에 영향을 미치는 요소 중 습도 또한 영향을 미치는 인자임을 이해하고 검사를 진행하여 불필요한 시약 소모, 인건비 소모를 줄이고 이식을 준비하는 모든 수혜자와 기증자들을 위해 신속하고 질 좋은 결과를 산출하는데 늘 수고하는 검사자들에게 도움이 되기를 바라는 바이다.

서울대학교병원 진단면역검사실에서 HLA 형별 검사를 위한 결과 산출하는 과정에서 HLA-DR 검사 시행 건수 총 611건 중 Lot No.20의 시약에서 빈번히 나타나는 위양성과 위음성으로 의심되는 특이 bead 들의 반응을 발견하게 되었다. 따라서 정확한 결과 산출과정을 모색하기 위하여 특이 bead들의 cut-off 수정을 하지 않은 검사결과 533건과 특이 bead의 cut-off 수정을 한 뒤 결과 산출을 한 78건의 사례들을 가지고 cut-off 수정을 야기시키는 요인을 여러 변수로서 규명하고자 하였다. 검체 대상의 인구통계특성과 cut-off 수정 여부를 확인하기 위해 빈도분석, 검사실의 습도를 변수로 넣어 기술통계를 진행하였고, cut-off 수정 여부와 인구통계특성의 연관성을 확인하기 위하여 교차분석을 시행, cut-off 수정 여부에 따른 습도의 차이를 검증하기 위해 독립표본 t검증을 실시하였다. 마지막으로 습도 수준에 따른 cut-off 수정비율의 관계를 검증하기 위해 로지스틱 회귀분석을 실시하였다. 결과적으로 검사실의 습도 수준이 증가함에 따라 cut-off 수정사례는 0.986배 감소하는 것으로 나타났다. 이는 습도가 낮아질수록 cut-off 수정률이 증가한다는 것을 의미한다. 따라서 검사실의 습도 또한 HLA typing 결과에 영향을 미치는 요인임을 시사한다.

This article is based on a part of the first author’s master’s thesis.

None

None

An HS¹, M.T.; Sohn M², MPH, PhD, Professor.

- Conceptualization: An HS, Sohn M.

- Data curation: An HS, Sohn M.

- Formal analysis: An HS, Sohn M.

- Methodology: An HS, Sohn M.

- Software: An HS, Sohn M.

- Validation: An HS, Sohn M.

- Investigation: An HS, Sohn M.

- Writing - original draft: An HS, Sohn M.

- Writing - review & editing: An HS, Sohn M.

All procedures were performed in accordance with approved by Seoul National University College of Medicine/Seoul National University Hospital Institutional Review Board (IRB) (No. H-2209-075-1358).