소변검사는 검체의 채취가 쉽고 환자에게 주는 부담이 적으며, 비교적 간단한 검사장비와 방법으로 검사가 이루어지며, 검사 시간도 비교적 짧다. 콩팥을 포함한 비뇨계통의 질환 진단을 위한 유용한 검사로, 치료 및 예후 결정에 중요한 정보를 제공하므로 보편화된 기본 검사 가운데 하나로 널리 이용되고 있다[1-3]. 소변검사는 시험지봉(dipstick)을 이용하여 소변 중에 존재하는 단백질, 포도당 등을 검출하는 화학적 성상검사와 원심분리한 침사물을 현미경으로 각종 세포성분, 결정체(crystals) 및 원주(casts) 등을 관찰하는 요침사 현미경검사(manual microscopy) 영역으로 크게 나눌 수 있다.

화학적 성상검사는 현재는 거의 모든 검사실에서 요시험지봉을 이용한 비색반응을 반자동 또는 자동으로 판독해 주는 분석기를 이용하여 여러 항목을 동시에 측정하고 있으며, 간편하기에 널리 사용하고 있다[4]. 시험지봉 검사는 화학반응에 의존하는 간편하고 신속한 검사이지만 소변에 존재하는 다양한 산화·환원물질, 약물과 식품 등 다양한 원인에 의한 간섭으로 시약의 발색반응에 영향을 주어 위양성(false positive) 또는 위음성(false negative) 반응이 발생할 수 있어 결과의 해석에 주의해야 한다[5]. 요침사 현미경검사는 원심분리한 요에서 얻은 침사물을 현미경으로 관찰하여 세포의 유무와 결정체 및 원주 등을 확인 감별하고 그 양을 계수하여 신장과 요로계통의 질환 진단 및 치료 효과 판정뿐만 아니라, 각종 대사이상 질환, 전신성 질환의 조기 발견을 위한 목적으로 검사실에서 일상적인 요검사의 한 부분으로 시행되는 기본 검사이다[1, 2].

요침사 현미경검사는 수작업이 많이 요구되고 현미경의 사용법에 대한 능숙함이 필요할 뿐만 아니라, 침사물을 정확히 감별할 수 있는 전문적인 지식이 요구된다[6]. 또한 요침사 현미경검사를 위한 표본제작 과정의 표준화가 이루어져 있지 않아 검사자 간, 검사실 간 재현성이 많이 떨어진다. 요침사 현미경검사는 검사과정에 주의를 기울여야 할 점들이 많을 뿐만 아니라 검사자 간 차이가 발생할 수 있고 검사의 질 관리(quality control)가 쉽지 않고 오류가 발생할 가능성이 높으며, 검사실 간 표준화가 어렵다[7, 8].

요침사 검사의 정확도와 표준화 향상을 위해 최근에는 유세포 분석원리(flow cytometry)와 이미지 분석기술(image based analysis system)을 바탕으로 하는 여러 자동화 장비들이 개발되고 있다. 규모가 큰 검사실에 도입되어 운용되고 있으며, 점점 확대되고 있다. 요침사 자동분석기는 수기법에 의한 요침사 현미경검사에 비해 수작업의 감소와 검사 시간을 단축할 수 있고 정확도와 정밀도가 우수하며, 짧은 시간에 많은 검체를 처리할 수 있다[7].

요침사 현미경검사를 위한 표본제작 과정에 대한 각국 기관의 가이드라인은 서로 조금씩 다르게 명시하고 있어서 표준화된 지침은 없는 상태이다. 중·소형 의료기관 검사실뿐만 아니라 대형 의료기관 검사실의 표본제작 방법이 서로 다르다. 또한 여러 임상병리학 서적들의 내용도 서로 다른 부분이 많았다. 현재까지 여전히 요침사 현미경검사를 위한 표본제작 과정에 대한 표준화가 이루어지지 않고 있어서, 이에 연구자들은 표준화 방법인 혈구계산판법과 비교하여 신뢰도 있는 검사 결과를 도출할 수 있는 새로운 조건을 찾고자 하였다.

1.재료

2023년 8월부터 2024년 3월까지 전남 순천시 소재 H 병원 병동 및 외래 각 과에서 진단검사의학과로 의뢰된 결과 보고가 완료된 환자들의 폐기 예정인 요를 연구에 사용하였다. 의뢰된 요 검체 중 시험지검사에서 잠혈반응(occult blood)과 백혈구 에스터분해효소(leukocyte esterase) 검사에서 양성반응을 보이고 cobas u 701 microscopy analyzer (Roche Diagnostics International)에서 적혈구가 계수된 201개 검체와 백혈구가 계수된 201개 검체로, 잔여량이 충분한 요를 선별하였다. 다양한 농도 범위에서 검사법을 평가하기 위해 결과를 참고하여 검체를 선정하였고 너무 세포 수가 많은 경우는 계수의 정확성을 위해 배제하였다. 검사실에 접수된 보존제 처리 없는 신선한 요를 사용하여 요침사 현미경검사를 실시하였고, 모든 검사는 2시간 이내에 완료하였다. 본 연구는 연구기관의 부서장 승인을 얻은 후 진행되었다.

2.방법

새로운 프로토콜, 중·소형 의료기관 및 대한진단검사정도관리협회(Korean Association of External Quality Assessment Service, KAEQAS) 요검경 가이드라인에서 제시한 방법으로, 각각 표본을 제작하여 계수한 적혈구와 백혈구 수치를 cells/HPF로 산출하여, 표준화 방법인 Neubauer improved cell counting chamber (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG)로 계수한 결과와 서로 비교하였다. 표본제작을 위한 원심분리에는 swing type의 rotor 구조의 반경이 160 mm인 Hanil FLETA 5 (Hanil Science Co., Ltd.) 원심분리기를 사용하였으며, OLYMPUS CX23 (Olympus Corp.) 현미경으로 강확대(high power field, HPF) 10개 시야를 계수한 평균치를 cells/HPF로 나타내었다. 검경에 사용된 400배 대물렌즈의 시야수(field number, FN)는 20이다.

1) Neubauer Improved Cell Counting Chamber를 이용한 혈구계산판법

눈금이 있는 원추형 시험관(Sewoon medical Co., Ltd.)에 요 10 mL를 넣고 400 ×g로 5분간 원심분리 후 혈청분리관과 피펫을 이용하여 상청액(supernatant fluid)을 제거하고 침사량 1.0 mL (10배 농축)를 남겼다. 침사물을 부유시킨 후, disposable dropper로 chamber에 한 방울 떨어뜨린 후 현미경 400배로 4개의 대구획에 존재하는 적혈구 및 백혈구를 계수하였다. 계수된 4 mm²를 4로 나눈 평균 수치에 농축배수와 보정계수 10을 곱하여 μL 단위의 세포 수로 산출하였다.

2) Novel Protocol

눈금이 있는 원추형 시험관에 요 10 mL를 넣고 400 ×g로 5분간 원심분리 후 혈청분리관과 피펫을 이용하여 상청액을 제거하고 침사량 0.35 mL (농축배수 28.6배)를 남겼다. 침사물을 부유시킨 후, 피펫을 이용하여 슬라이드에 0.015 mL를 분주하고 18 mm×18 mm 커버글라스를 덮은 후 검경하였다.

3) 중·소형 의료기관 검사실의 요 현미경검사

눈금이 있는 원추형 시험관에 요 10 mL를 넣고 400 ×g로 5분간 원심분리 후, 시험관을 순간적으로 약 1초간 거꾸로 하여 상청액을 버린 후, 바로 세워 여분의 상청액을 모으고 침사물과 잘 혼합시켜 슬라이드에 1 방울을 떨어뜨리고 18 mm×18 mm 커버글라스를 덮고 검경하였다. 또한 피펫을 이용하여 침사물 0.015 mL를 슬라이드에 분주 후 커버글라스를 덮고 검경하였다.

4) 대한진단검사정도관리협회 요검경 가이드라인

눈금이 있는 원추형 시험관에 요 10 mL를 넣고 400 ×g로 5분간 원심분리 후, 상청액을 제거하고 남은 침사량이 0.33 mL가 되도록 한 후, 침사물을 요와 균등히 혼합 후 피펫을 이용하여 슬라이드에 0.02 mL를 옮긴 후 18 mm×18 mm 커버글라스를 덮은 후 검경하였다.

5) 세포 수 변환

혈구계산판에서 계수된 세포 수 cells/μL를 cells/HPF로 변환하기 위해 Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) GP16-A3 가이드라인과 Ottiger와 Huber [9]가 제시한 식을 이용하였다.

3.검사방법 간 비교

1) 상관성 비교

데이터의 정규성 검정을 위해 Kolmogorov-Smirnov test를 시행한 결과 분석 데이터는 정규분포를 이루지 않았다. 따라서 비모수적 데이터에 대한 상관성 분석을 위해 Spearman’s correlation 분석을 사용하였다. 혈구계산판 방법과 새로운 프로토콜 및 두 가지 현미경검사 방법 간 상관관계를 평가하기 위해 Spearman’s correlation과 선형회귀분석(linear regression analysis)을 실시하였다. Microsoft Excel 2013 (Microsoft)을 이용하여 회귀방정식과 결정계수를 구하였다. 상관계수(correlation coefficient, r) 값이 0.9 이상이면 매우 높은(very high) 상관성을, 0.7∼0.9일 경우 높은(high) 상관성을, 0.5∼0.7일 경우 중등도(moderate)의 상관성, 0.3∼0.5의 경우 낮은(low) 상관성, 0.0∼0.3을 매우 낮은(무시할 수준, negligible) 상관성을 보이는 것으로 판정하였다[10].

2) 일치도 비교

새로운 프로토콜, 중·소형 의료기관 및 대한진단검사정도관리협회에서 제시한 방법으로 계수한 적혈구와 백혈구 수치를 표준화 방법인 혈구계산판에서 계수된 cells/HPF와 대한진단검사의학회에서 2014년도에 발행한 진단검사의학 제5판에 제시된 cell grading system의 등급(grade)으로 변환하여 방법 간의 동일 등급 및 ±1 등급 차 이내의 일치도를 분석하였다. 검사자 간 비교 및 검사법 비교를 위해 급내상관계수(intraclass correlation coefficient, ICC)를 사용하였고, ICC가 0.40 미만은 좋지 않음(poor), 0.4∼0.6은 보통(fair), 0.6∼0.75는 좋음(good), 0.75∼1.00은 매우 좋음(excellent)으로 분류하였다[11]. 측정값들의 평균과 차이를 이용한 Bland-Altman 분석법을 이용하여 두 검사법에 간의 일치도를 확인하였다.

3) 통계

통계 분석에는 SPSS ver.18.0 (IBM Corp.) 소프트웨어와 Microsoft Excel 2013을 사용하였고 P값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

1. 상관관계 및 선형회귀 분석

Neubauer improved cell counting chamber를 이용한 혈구계산판법과 세 가지 수동 현미경검사 방법을 비교한 상관분석 결과는 Table 1과 같으며, 선형회귀분석 결과는 Figures 1, 2에 나타내었다. 적혈구에 대한 혈구계산판법과의 상관관계 분석에서 새로운 프로토콜 방법의 r값이 0.98 (P<0.001)로 가장 높은 상관성을 나타냈고, 중·소형 검사실 방법 간의 r값은 0.88 (P<0.001)로 가장 낮은 상관성을 보였다. 백혈구에 대한 혈구계산판법과의 상관관계 분석에서는 r값이 0.99 (P<0.001)인 대한임상검사정도관리협회 방법이 가장 높은 상관성을 나타냈고, 중·소형 검사실 방법의 r값은 0.88 (P<0.001)로 가장 낮은 상관성을 보였다.

Table 1

Spearman correlation, agreement and ICC analysis between the Neubauer chamber and three manual microscopic examinations for RBC and WBC

Method	Neubauer cell counting chamber
	r	Agreement rate (N=201), N (%)			ICC
		Same grade	Within ±1 grade		ICC (3.1)	95% CI
Novel protocol
RBC	0.982*	173 (86.1)	200 (99.5)		0.990*	0.986∼0.993
WBC	0.982*	178 (88.6)	200 (99.5)		0.989*	0.985∼0.992
S & M labs (1 drop)
RBC	0.876*	24 (11.9)	135 (67.2)		0.561*	‒0.216∼0.820
WBC	0.876*	27 (13.4)	149 (74.1)		0.492*	‒0.218∼0.777
S & M labs (0.015 mL)
RBC	0.966*	139 (69.2)	201 (100)		0.939*	0.710∼0.976
WBC	0.969*	144 (71.6)	201 (100)		0.914*	0.555∼0.967
KAEQAS
RBC	0.980*	161 (80.1)	201 (100)		0.973*	0.872∼0.989
WBC	0.986*	171 (85.1)	201 (100)		0.968*	0.839∼0.987

*P<0.001.

Abbreviations: ICC, intraclass correlation coefficient; RBC, red blood cell; WBC, white blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service; r, Spearman correlation coefficient; 95% CI, 95% confidence interval.

Fig. 1. Comparison of the Neubauer chamber and three manual microscopy methods for RBCs. Correlation between the Neubauer chamber and (A) novel protocol were r²=0.98, (B) S & M labs (1 drop) r²=0.79, (C) KAEQAS r²=0.98, (D) S & M labs (0.015 mL) r²=0.95.
Abbreviations: RBC, red blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service; r, Spearman correlation coefficient.

Fig. 2. Comparison of the Neubauer chamber and three manual microscopy methods for WBCs. Correlation between the Neubauer chamber and (A) novel protocol were r²=0.97, (B) S & M Labs r²=0.73, (C) KAEQAS r²=0.97, (D) S & M labs (0.015 mL) r²=0.93.
Abbreviations: WBC, white blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service; r, Spearman correlation coefficient.

2. Cell Grading System 등급을 이용한 반정량적 일치도 분석

혈구계산판법으로 적혈구 및 백혈구를 계수한 cells/μL 단위의 세포 수를 cells/HPF 단위로 변환한 결과를 수동현미경 검사방법에서 계수한 결과와 비교하였다. 동일 등급 및 한 등급 차이 내에서의 일치도 결과를 Table 1과 Figure 3에 나타냈다. 새로운 프로토콜에서 제안한 방법으로 적혈구 및 백혈구를 검경한 결과에서 동일 등급 일치율이 86.1% (N=173)와 88.6% (N=178)로 가장 일치도를 보였고, ±1 등급 차 이내의 일치율에서는 모두 100% (N=201)를 보인 대한임상검사정도관리협회 방법에서 혈구계산판법과 가장 좋은 일치 수준을 보였다. 중·소형 검사실에서 실시하는 방법으로 검경했을 때 동일 등급 일치율은 각각 11.9% (N=24)와 13.4% (N=27)를 보였고, ±1 등급 차 이내에서도 67.2% (N=135)와 74.1% (N=149)를 보였다.

Fig. 3. Comparison of agreement between the Neubauer chamber and three manual microscopy methods. The gray-shaded areas represent the number of cases within the same grade and the orange-shaded areas represent the number of cases within one grade difference and blue-shaded areas represent the number of cases within two grade difference.
Abbreviations: RBC, red blood cell; WBC, white blood cell; HPF, high power field; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service; ≥1/2, ≥1/2 field of view.

3. ICC (3.2)를 이용한 일치도 분석

두 명의 검사자가 새로운 프로토콜에서 제시한 방법으로 표본을 각각 제작하여 검경한 적혈구 및 백혈구에 대해 ICC를 이용하여 일치도를 Table 2에 나타냈다. 또한 검사방법 간 비교를 위해 혈구계산판법으로 계수된 적혈구 및 백혈구를 cells/HPF 단위로 변환한 결과와 세 가지 방법에서 제시한 방식으로 표본을 제작하여 검경한 일치도 분석 결과를 Table 1에 나타냈다. 새로운 프로토콜에서 제안한 방법으로 두 검사자가 각각 적혈구와 백혈구를 검경한 결과에서 0.96 (P<0.001)과 0.95 (P<0.001)로 매우 좋음으로 나타났고, 검사방법 간 비교를 위한 ICC에서는 새로운 프로토콜에서 적혈구, 백혈구 모두 0.99 (P<0.001)로, 매우 좋음으로 나타났다.

Table 2

Intraclass correlation coefficient for the results of manual microscopy performed by two examiners

Method	Novel protocol
	ICC (3.2)	95% CI	P-value
RBC (cells/HPF)	0.963	0.951∼0.972	<0.001
WBC (cells/HPF)	0.953	0.939∼0.965	<0.001

Abbreviations: ICC, intraclass correlation coefficient; 95% CI, 95% confidence interval; RBC, red blood cell; WBC, white blood cell; HPF, high power field.

4. Bland-Altman Plot을 이용한 일치도 분석

동일 대상에 대한 두 세트의 측정값에서 각 측정값의 짝마다 평균과 차이를 계산한 다음 평균을 x축으로 하고, 차이를 y축으로 하는 산점도(scatter plot)를 작성하여 혈구계산판법과 비교하여 방법 간 측정값들의 바이어스(bias) 추정치 및 일치 양상을 Table 3과 Figures 4, 5에 나타냈다. 새로운 프로토콜 방법에서 제안한 방법으로 적혈구 및 백혈구를 검경한 결과를 혈구계산판법으로 측정한 값의 짝 간 차이의 평균이 0.59와 0.34로 차이가 가장 작음을 확인할 수 있었다. 반면 중·소형 검사실 방법에서는 21.74와 18.89로 나타나 상당한 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 표준검사법에 해당하는 혈구계산판법의 결과를 x축과 y축에 두 측정치의 차이로 하여 바이어스 정도를 Figures 6, 7에 나타내었다.

Table 3

Comparison of Bland-Altman plot between the Neubauer chamber and three manual microscopy methods

Method	Neubauer counting chamber
	Mean	Mean of difference	SD	95% LOA
Novel protocol
RBC (cells/HPF)	14.40	0.59	2.38	‒4.07∼5.25
WBC (cells/HPF)	12.87	0.34	1.72	‒3.02∼3.71
S & M labs (1 drop)
RBC (cells/HPF)	24.97	21.74	15.65	‒8.94∼52.42
WBC (cells/HPF)	22.14	18.89	12.60	‒5.80∼43.58
S & M labs (0.015 mL)
RBC (cells/HPF)	15.59	3.98	4.52	‒4.88∼12.83
WBC (cells/HPF)	14.63	3.87	4.09	‒4.14∼11.89
KAEQAS
RBC (cells/HPF)	14.83	2.45	2.93	‒3.29∼8.20
WBC (cells/HPF)	13.74	2.08	2.40	‒2.62∼6.78

Abbreviations: SD, standard deviation; LOA, limit of agreement; RBC, red blood cell; WBC, white blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service.

Fig. 4. Comparison of Bland-Altman plot between the Neubauer chamber and three manual microscopy methods for RBCs. Between Neubauer chamber and (A) novel protocol, (B) S & M labs (1 drop), (C) KAEQAS, (D) S & M labs (0.015 mL).
Abbreviations: RBC, red blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service; SD, standard deviation.

Fig. 5. Comparison of Bland-Altman plot between the Neubauer chamber and three manual microscopy methods for WBCs. Between Neubauer chamber and (A) novel protocol, (B) S & M labs (1 drop), (C) KAEQAS, (D) S & M labs (0.015 mL).
Abbreviations: WBC, white blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service; SD, standard deviation.

Fig. 6. Comparison of bias for RBCs between Neubauer chamber and three manual microscopy methods. (A) Novel protocol, (B) S & M labs (1 drop), (C) KAEQAS, (D) S & M labs (0.015 mL).
Abbreviations: RBC, red blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service.

Fig. 7. Comparison of bias for WBCs between Neubauer chamber and three manual microscopy methods. (A) Novel protocol, (B) S & M labs (1 drop), (C) KAEQAS, (D) S & M labs (0.015 mL).
Abbreviations: WBC, white blood cell; S & M labs, smaller or medium-sized laboratory; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service.

지난 수십 년 동안 첨단과학의 성장으로 진단검사 분야에서도 자동화가 급속히 이루어졌다. 요검사 영역에서도 자동화가 상당히 이루어져 검사자 간 가변성을 제거하여 검사의 질 향상 및 업무의 효율성 등 여러 가지 측면에 많은 도움이 되었다[12]. 근래에는 신뢰도를 담보할 수 있는 유세포 분석법이나 이미지 분석법이 적용된 자동 요침사 분석기가 개발되어 보급됨에 따라 정확성과 재현성이 높은 신뢰도 있는 결과를 제공할 뿐만 아니라, 처리 능력이 높아 생산성 향상을 기대할 수 있다[13, 14]. 자동 요침사 분석기는 표준화 및 정도관리 등의 필요성 등으로 도입이 점점 증가할 것으로 기대되나, 여러 현실적인 문제로 상급의료기관이나 대형 의료기관 검사실을 제외한 많은 검사실에서는 여전히 검사자가 표본을 제작하여 현미경검사를 실시하고 있다. 요침사를 포함한 소변검사의 현황을 평가하고, 요침사 검사의 질 향상을 위해 대한임상검사정도관리협회 임상경검학분과위원회에서 실시된 조사에서 알 수 있듯이 요침사 검사의 정도관리와 표준화는 해결해야 할 어려운 문제 중의 하나라고 하였다[15].

전통적인 요침사 현미경검사는 유익한 정보를 획득하여 요로계 질환을 진단함에 필수적이지만, 요침사 판독에 검사자의 주관적인 견해가 개입될 수 있고 검사자의 숙련도에 따라서 결과 차이가 발생할 수도 있다. 또한 표본제작 방식이 달라서 검사실 간, 검사자 간 요침사 결과에 차이가 발생할 수 있어, 동일 환자라도 결과가 각각 다를 수 있다[16-18]. 따라서 정확도와 재현성을 높이기 위해서 숙련된 검사자가 요구되지만, 우선적으로 표본제작 시 원심분리 속도 및 시간, 상청액을 버리고 남기는 침사량 등 검사 결과에 영향을 주는 여러 요소의 표준화가 이루어져야 한다.

일반적으로 중·소형 의료기관 검사실에서는 교과서에 제시되어 있거나 다른 검사실에서 사용하는 표본제작 방법을 그대로 인용하여 요침사 현미경검사를 실시하고 있다. 현미경검사를 위한 표본제작 과정에서의 원심분리 조건, 상청액을 제거하고 남는 침사량, 슬라이드에 옮기는 침사물의 양 등의 차이로 결과의 부정확성이 유발되고 재현성이 떨어진다. 이러한 문제들을 해결하기 위하여 CLSI나 European Confederation of Laboratory Medicine (ECLM) 등의 국제 지침은 표준화된 혈구계산판을 이용하여 계수하거나 자동화 검사장비 사용을 권고하고 있다[19]. 혈구계산판이나 요침사 자동화 장비를 중·소형 검사실에서 사용하기 어려운 여건임을 감안하여 볼 때, 대안으로 표준화 방법인 혈구계산판 검사 결과와 견줄 수 있는 정확도와 재현성을 갖춘 표본제작 방법의 지침이 마련되어야 할 것이다. 일반적으로 검사에 이용되는 원심관의 눈금은 0.25부터 0.5, 1, 2, 2.5, 4, 5, 6, 10, 12 mL까지 표시되어 있다. 이러한 눈금 표시 문제로 상청액을 제거하고 제시된 침사량을 정확히 맞추기가 사실상 어렵다. 중·소형 검사실의 표본제작 과정에서 서로 다른 검사자 간에 시험관을 거꾸로 하여 상청액을 제거하고 남는 침사량을 측정했더니 약 0.2∼0.3 mL 정도였으며, 같은 검사자가 반복 시행했을 때 각기 다름을 확인할 수 있었다. 소변검사는 시험지검사 결과와 상관없이 현미경검사로 침사물에 존재하는 적혈구와 백혈구의 존재와 양을 보고하고 있어서 새로운 조건을 찾아 혈구계산판법 및 기존에 제안되었던 방식과 비교하여 시행하였다. 저자의 이전 연구에서 요침사 자동분석기와 비교했을 때 전반적으로 낮은 편향을 보였으나, 다른 방법보다 가장 높은 일치도를 나타낸 대한임상검사정도관리협회 요검경 가이드라인을 참고하여 원심분리 후 상청액을 제거하고 남은 침사량을 0.35 mL, 재부유시켜 슬라이드에 옮기는 침사량을 0.015 mL와 0.02 mL로 설정하여 실험을 진행하였다. 또한 부가적으로 중·소형 검사실에서 새로운 프로토콜의 대안으로 사용할 수 있는 또 다른 조건을 모색하기 위해 현행 방법으로 원심분리 후, 시험관을 약 1초간 거꾸로 하여 상청액을 버린 후, 모은 침사물 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨리고 계수하는 방법과 침사량 0.015 mL 슬라이드에 옮기고 계수한 방법 결과를 혈구계산판법 결과와 비교하였다. 이렇게 함으로써 침사량의 농축률과 슬라이드에 옮긴 양의 차이로 나타날 수 있는 결과를 확인할 수 있다.

검사법 평가를 위해 혈구계산판법으로 계수한 결과와의 다른 수동 현미경검사법 간의 일치도를 확인하였다. 평가자들이 동일 대상을 측정함에 있어 동일한 조건에서 서로 다른 검사법이나 서로 다른 장비로 측정했을 때 측정값들의 비교가 필요하여, 평가한 결과를 일치하는 정도인 일치도로 나타내어 두 검사법이나 분석 장비를 평가하게 된다. 검사법의 일치도를 평가하는 통계기법으로 상관분석, ICC, Bland-Altman plot, t 검정, Passing-Bablok regression, Cohen’s Kappa coefficient 등 다양하다.

상관분석과 선형회귀분석에서 적혈구 및 백혈구에 대한 혈구계산판법과 새로운 프로토콜에서 제시한 방법 간의 상관계수는 모두 0.98이었고, 대한임상검사정도관리협회에서 제시한 방법 간의 상관계수는 0.98과 0.99로 나타나, 검사법 간의 선형적 상관성의 강도가 높음을 확인할 수 있었다. 이에 비해 중소형 검사실의 방법과는 모두 0.88로 분석되어 다소 상관성이 낮게 나타났다. Park와 Oh [20]는 상관분석은 두 방법 간 선형적 연관성의 강도를 평가하는 것으로, 일치하는 정도를 평가하는 것은 부적절하다고 하였다. 대부분의 측정치들이 선형 추세선에 근접하여 분포하고 있기에 상관계수는 높게 나타나게 되지만, 측정 방법 간의 차이의 정도를 구분하기 쉽지 않아서 일치성이 높다고는 할 수 없을 것이다.

혈구계산판법에서 계수된 cells/μL를 cells/HPF로 변환하여 새로운 프로토콜 방법 및 대한임상검사정도관리협회에서 제시한 방법 간의 일치도를 보기 위해 cell grading system의 등급으로 변환하여 검사방법 간 일치도를 확인하였다. 평균 cells/HPF를 각각 정의된 등급의 cells/HPF 범위 내에 들면 해당 등급으로 산정하였다. 혈구계산판법과의 일치도 비교에서 새로운 프로토콜에서 제안한 방법으로 검경한 결과에서 동일 등급 일치율이 86.1% (N=173)와 88.6% (N=179)로 가장 좋았다. 대한임상검사정도관리협회에서 제안한 방법으로 표본을 제작하여 검경한 결과에서는 동일 등급 일치율이 80.1% (N=161)와 85.1% (N=171)를 보였고, ±1 등급 차 이내의 일치율에서는 모두 100% (N=201)를 보였다. 중·소형 검사실에서 일반적으로 시행되는 방법으로 검경한 적혈구 및 백혈구의 동일 등급 일치율은 11.9% (N=24)와 13.4% (N=27)였으며, ±1 등급 차 이내의 일치율에서도 67.2% (N=135)와 74.1% (N=27)로 확인되었다. Choi 등[21]의 연구에 사용된 더 세분된 등급 체계를 적용한 일치율 분석에서 새로운 프로토콜에서 동일 등급 일치율은 77.1% (N=155), 79.1% (N=159)를 보였고, ±1 등급 차 이내의 일치율에서는 99.5% (N=200)와 99.0% (N=199)로 확인되었다. 대한임상검사정도관리협회 방법에서는 동일 등급 일치율은 65.7% (N=132), 66.2% (N=133)를 보였고, ±1 등급 차 이내의 일치율에서는 모두 99.5% (N=200)로 확인되었다. 중·소형 검사실에서 시행되는 방법으로 검경했을 때 동일 등급 일치율은 4.5% (N=9), 1.5% (N=3)였고, ±1등급 차 이내의 일치율에서는 모두 18.4% (N=37)로 확인되었다. 더 세분화된 등급 체계를 적용했을 때 동일 등급 일치율에서 차이가 더 나타나, 방법 간 비교에 적용된 등급 체계에 따라 일치율에 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 중·소형 검사실에서 시행되는 방법으로는 슬라이드에 떨어뜨리는 침사량을 일정하게 할 수 없었으며, 떨어뜨리는 침사량이 증가할수록 계수되는 세포 수도 같이 증가함을 알 수 있었고 일정량을 떨어뜨리는 것도 매우 어려웠다. 같은 검체를 같은 검사자가 연속하여 떨어뜨렸을 때도 매번 용량이 달라졌다.

반복성(repeatability)과 평가자 간 재현성(reproducibility)과 같은 신뢰도 평가는 새로운 검사방법이 기존의 방법과 어느 정도 일치하는지 혹은 연구 대상을 반복 측정했을 때 일관된 결과를 제공하는지 알아보는 등의 경우에 유용하게 사용된다[22]. 두 방법에 의한 측정 결과가 연속적인 값인 경우, 일치도 지표로서 상관계수가 종종 사용되기도 하지만, 상관계수보다 더 좋은 지표는 ICC로, 이는 상관관계와 측정값 간 바이어스의 정보를 모두 포함하고 있어, 두 검사법이나 두 검사자에 의해 측정 결과의 일치도를 분석하며[23], 0.40 미만은 일치도가 좋지 않음을 의미하고 0.75 이상은 매우 좋은 것으로 판단한다. 단일측도(측정자 간에 얼마나 차이가 있는지 보는 것), 평균측도(평균값과 얼마나 차이가 있는지 보는 것) 값이 있으나, 보통은 평균측도로 해석한다. 새로운 프로토콜 방법으로 두 검사자가 각각 검사했을 때 ICC의 단일측도는 0.97 (P<0.001), 평균측도는 0.98 (P<0.001)로 나타나, 두 검사자가 계수한 값이 1에 가까워 일치 정도가 높다고 해석할 수 있다. ICC를 이용한 검사방법 간 비교에서 중·소형 검사실에서 시행하고 있는 방법으로 한 방울을 떨어뜨리고 적혈구와 백혈구를 검경한 결과를 혈구계산판법과 비교했을 때 0.56 (P<0.001)과 0.49 (P<0.001)로 일치도가 보통으로 나타났으나, 0.015 mL를 피펫으로 슬라이드에 분주하고 검경한 결과에서는 각각 0.94 (P<0.001)와 0.91 (P<0.001)로 매우 좋음으로 확인되었다.

Bland-Altman plot은 동일한 대상을 두 가지 서로 다른 방법으로 각각 측정하고 짝지은 측정치(A, B) 간의 차이(difference, d=A‒B)를 y축에, 평균[(A+B)/2]을 x축으로 하는 산점도를 나타내는 방법으로, 반복성과 재현성 평가뿐만 아니라, 서로 다른 두 검사법으로 측정한 값들의 일치 양상을 확인하는 좋은 도구로, 검사법 비교 연구에 많이 사용되고 권고된다[24, 25]. 평균을 중심으로 차이 값들이 모여서 있으면, 두 방법 간 측정값의 일치도가 크다고 할 수 있다. Bland-Altman plot에서 가운데 가로 실선은 두 검사법으로 측정된 값들의 짝 간 차이의 평균(mean of difference)을 나타내는데, 0으로부터 이 값까지의 거리는 두 검사법 간의 바이어스의 추정치라고 할 수 있으며, 한 방법이 다른 방법에 비해 평균적으로 과다 혹은 과소 추정하는 경향이 있다고 할 수 있다[24]. 혈구계산판법의 결과와 새로운 프로토콜 방법으로 계수된 값의 짝 간의 차이의 평균이 적혈구에서는 0.59, 백혈구에서는 0.34로 나타났는데, 이는 두 검사법 간의 바이어스의 추정치라고 할 수 있으며, 실제로 혈구계산판법에 비해 적혈구는 0.59개, 백혈구는 0.34개 정도 과다 측정되었음을 의미하며, 다른 검사법에 비해 바이어스가 아주 작음을 알 수 있다. 대한임상검사정도관리협회에서 제시한 방법과 비교했을 때 차이의 평균은 2.45와 2.08로 나타나, 실제로 혈구계산판법에 비해 적혈구는 2.45개, 백혈구는 2.08개 정도 과다 측정되었음을 의미한다. 슬라이드에 침사물을 1 방울 떨어뜨리는 중·소형 검사실 방법에서는 차이의 평균이 21.74와 18.89로, 혈구계산판법에 비해 적혈구는 21.74개, 백혈구는 18.89개 정도 과다 측정되었으나, 침사물을 피펫으로 0.015 mL 분주하여 검경한 방법에서는 3.98과 3.87로 나타나, 두 방법 간 현저한 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 차이의 평균이 0에 가까울수록 두 가지 검사법 간 바이어스는 적다고 할 수 있고, 평균적으로 과다 또는 과소 추정하는 경향은 작아서 일치도가 높다고 할 수 있을 것이다. x축 값의 크기에 따른 불일치의 분포 양상을 살펴보면, 값이 클수록 짝지어진 두 측정값 간의 차이가 일반적으로 양의 방향으로 커지고, 짝지어진 두 측정값 간 차이의 변동도 커지는 추세를 확인할 수 있다. 또한 두 측정치 중 표준검사법 결과를 x축으로 하고 y축을 두 측정치의 차이로 하여 산점도를 작성하면, 표준검사법에 대하여 다른 검사법의 결과가 어느 정도 바이어스가 있는지와 그 크기를 Figures 6, 7에서 확인할 수 있었다. 새로운 프로토콜 방법에서는 0을 기준으로 측정치들의 차이가 위와 아래와 무작위적으로 고르게 분포 양상을 보이고 비교적 바이어스도 적은 반면, 다른 검사법들에서는 대부분 측정값들이 커질수록 차이도 양의 방향으로 커지고, 바이어스의 크기도 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. Bland-Altman plot에서 x축과 평행한 세 개의 가로선을 표시하는데, 가운데 가로 실선과 평행한 위, 아래 가로선은 95% 상한 일치 한계(upper limit of agreement)와 95% 하한 일치 한계(lower limit of agreement)를 나타내며, 차이의 평균±1.96×standard deviation으로 산출한다. 측정값 간 차이들이 정규분포를 따른다면 대략 95%는 이들 사이에 존재한다. 새로운 프로토콜 방법과 혈구계산판법의 두 방법에서 계수된 값 간 차이가 한계 범위 이내에 대부분 위치하고 있음을 확인할 수 있었다.

세계적으로 요침사 현미경검사를 위한 표준화된 프로토콜은 현재 없으며, 각국 기관의 가이드라인에서는 서로 조금씩 다른 표본제작 방법을 명시하고 있다. CLSI GP16-A3, Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards (JCCLS) GP1-P4, ECLM 등에서 제시한 요침사 현미경검사에 대한 가이드라인들 간에도 차이가 있었다. CLSI GP16-A3에서 제시한 예를 살펴보면, 원심분리 속도와 시간을 제외하고 검사에 사용하는 요량, 상청액 제거 후 남는 요 침사량, 농축률, 분주하는 요 침사물의 양, 커버글라스 크기 등에 대한 구체적으로 직접 제시하지 않고 각 검사실에서 자체적으로 규정하여 사용하도록 권장하고 있으며, JCCLS GP1-P4 및 ECLM 가이드라인에서는 요 침사량, 농축률 등에 대해 규정을 하고 있으나, 정해진 범위 내에서 검사실마다 자체적으로 규정하여 적용하도록 하고 있다. KAEQAS에서 제시한 가이드라인에서는 400 ×g에서 5분, 요량 10 mL, 침사량은 0.33±0.1 mL (농축률 30배), 분주량 0.02 mL를 제시하고 있다. 요침사 현미경검사를 위한 표본제작의 표준화를 위해서는 결과에 영향을 줄 수 있는 인자들에 대한 명확한 설정이 필요하다. 대한임상검사정도관리협회에서 1992년도 217기관 조사와 1996년도 262기관 조사에 의하면 원심속도 및 시간, 상청액 제거 후 침사량, 분주하는 침사물 양 등이 검사 기관마다 다양하다고 보고하였다[26, 27]. 대한진단검사의학회 임상화학분과위원회와 대한임상화학회에서 실시한 요침사 현미경검사의 표준화를 위한 기초자료 수집 결과를 보면, 최종 침사량과 농축계수가 다양했고, 슬라이드에 분주하는 침사물 양도 대부분 기관에서 명확하게 규정하고 있지 않았다[28].

새로운 프로토콜을 포함한 두 가지 요침사 현미경검사에서 개별 검체에 세포가 많이 포함되어 있을수록 각 시야에서 계수되는 세포 수의 차이가 꽤 있었고, 슬라이드에 뚝 쳐서 한 방울 떨어뜨리는 중·소형 검사실 방법은 떨어뜨려지는 양이 일정치 않았고, 양이 많아질수록 게수되는 수도 증가하였다. 전반적으로 상청액 제거 후 남는 침사량 및 슬라이드에 분주하는 침전물 양에 따라 상당한 결과 차이를 보였다. 소변에 혈구세포가 아닌 상피세포, 세균 등의 유기성분(organic compound)과 염류, 결정 등의 무기성분(inorganic compound)들이 포함되어 있는 경우 등 검체의 다양한 특성에 따라서도 영향을 받았다. 원심분리 후 상청액을 제거하여 각 방법에서 제시한 침사량을 정확히 맞추는 게 쉽지 않았으며, 검사자가 표본을 제작하여 약확대에서 전체적으로 세포의 분포 정도를 확인 후 검경 하였으나, 같은 슬라이드 내에서도 세포의 분포 정도가 달라서 어떤 시야를 선택하여 검경 하느냐에 따라 결과도 서로 다르게 나타났다. 표준화된 혈구계산판법과의 비교에서 새로운 프로토콜로 표본을 제작하여 검경했을 때 다른 방법보다 우수한 상관성과 일치도, 가장 작은 바이어스를 보였다.

요침사 현미경검사는 표본제작의 표준화가 안 되어 있어 검사실, 검사자 간 결과 차이가 발생할 수 있으므로, 동일한 환자라도 결과가 다르게 나올 수 있어 신뢰성 문제가 발생할 수 있다. 따라서 연구자들은 표준화 방법인 혈구계산판법과 견줄 만한 신뢰성 높은 결과를 도출할 수 있는 새로운 조건을 찾고자, 새로운 프로토콜로 표본을 제작하여 계수한 결과를 혈구계산판법과 비교하였다. 방법 간 상관관계와 동일 등급 및 한 등급 이내 일치율이 다른 방법 보다높았으며, ICC 및 Bland-Altman 분석에서도 높은 일치도를 보여 새로운 프로토콜을 요침사 현미경검사를 위한 표본제작 방법으로 제안하고자 한다.

요검사는 검사실에서 일상적으로 수행되는 기본적인 검사이다. 연구에서 새로운 프로토콜을 포함한 두 가지 수동 현미경검사 방법을 표준화된 chamber 방법과 비교하였다. 시험지검사와 자동 침사물 분석기에서 적혈구 양성 201개와 백혈구 양성인 201개 검체로 구성된 총 402개 검체를 분석 대상으로 선정했다. 적혈구 및 백혈구에 대한 표준화된 chamber 방법과 새로운 프로토콜 방법 간의 상관계수는 모두 r=0.98로, 높은 수준의 상관관계를 나타냈다. 이 두 방법 간의 동일 등급에 대한 쌍별 일치율은 적혈구의 경우 86.1%, 백혈구의 경우 88.6%였으며, 한 등급 차이 내 일치율은 모두 99.5%였다. 반면, 표준화된 chamber 방법과 중·소규모 검사실 방법 간의 일치율은 적혈구의 경우 11.9%, 백혈구의 경우 13.4%로, 동일 등급 일치율이 현저히 낮았고, 한 등급 차이 내 일치율은 각각 67.2%와 74.1%로 나타났다. 급내상관계수 및 Bland-Altman plot을 사용한 분석에서는 새로운 프로토콜이 다른 세 가지 수동 현미경검사 방법에 비해 우수한 일치도를 보인 것으로 확인되었다. 표준화된 chamber 방법과의 높은 상관관계와 일치도를 고려해 볼 때, 새로운 프로토콜 방법을 소변 침사물 표본제작의 표준화된 절차로 권장한다.

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This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (2023R1A2C1007284).

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Lee HJ¹, Professor; Kim DH², Professor; Lee MH³, Medical technologists.

- Conceptualization: Lee HJ, Kim DH.

- Methodology: Lee HJ, Lee MH.

- Validation: Lee HJ, Kim DH, Lee MH.

- Investigation: Lee HJ, Kim DH, Lee MH.

- Writing - original draft: Lee HJ, Kim DH.

- Writing - review & editing: Lee HJ, Kim DH.

This aryicle does not require IRB/IACUC approval because there are no human and aminal participants.