황색포도알균(Staphylococcus aureus, S. aureus)은 건강한 사람의 피부와 코에 상재하며, 피부질환과 식중독을 흔하게 일으키는 세균이다. S. aureus와 관련된 질병을 치료하기 위해 지속적인 항균제를 사용한 결과, 메티실린을 포함한 많은 항균제에 내성이 있는 메티실린 내성 황색포도알균(methicillin-resistant S. aureus, MRSA)이 출현하였다[1]. 메티실린 감수성 황색포도알균(methicillin-susceptible S. aureus, MSSA)은 mecA를 운반하는 staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec)가 획득되는 것으로 밝혀졌다[2]. SCCmec 유형과 유전자형은 지역사회에서 획득된 메티실린 내성 황색포도알균(community-acquired MRSA, CA-MRSA) 및 병원 획득 관련 메티실린 내성 황색포도알균(health care-associated MRSA, HA-MRSA)의 독립적 기원으로 확인되었다[3]. HA-MRSA 분리주는 일반적으로 SCCmec 유형 I∼III 에 속하는 반면 유형 IV 및 V는 일반적으로 CA-MRSA 분리주와 관련이 있다. 미국에서 분리된 대부분의 HA-MRSA는 SCCmec 유형 II가 많은 반면, 다른 국가에서는 이러한 분리주가 일반적으로 SCCmec 유형 III을 보유한다[2]. 한국과 일본에서는 SCCmec 2A형 균주가 우세하다[3].

MRSA에 의한 감염의 확산으로 인해 임상적으로 이용할 수 있는 유효한 약제가 감소하고, 대체 요법의 모색이 필요하게 되었다. MRSA는 일반 항균제 내성뿐만 아니라 의료기관 내 환자들 사이에 쉽게 퍼지기 때문에 치료가 어렵다[1]. 대체 항균제인 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone, FQ)이 널리 사용되었고 그로 인해 MRSA를 비롯한 S. aureus에서 FQ 내성균주가 전 세계에 확산되었다[4].

FQ 항균제는 DNA의 복제와 염색체 분리가 되는 세포분열시 이중나선 DNA 손상과 복구를 함으로써 이중나선구조 DNA을 풀어주는 아데노신 3 인산(adenosine triphosphate, ATP) 의존성 효소인 DNA gyrase와 topoisomerase IV의 작용을 방해함으로써 항균력을 나타낸다[5]. 대표적인 FQ 항균제는 ciprofloxacin (CIP), levofloxacin (LVX), moxifloxacin (MXF)이며, 이러한 항균제들에 내성을 가진 균종을 퀴놀론 내성 황색포도알균(quinolone resistant S. aureus, QRSA)이라고 알려져 있다[6].

DNA gyrase와 topoisomerase IV 유전자가 퀴놀론 내성결정부위(quinolone resistance-determining region, QRDR)에서 암호화하는데 QRDR의 변이는 퀴놀론에 내성을 갖는 상당한 역할을 한다[7, 8]. DNA gyrase는 단량체 소단위(monomeric subunits)인 gyrA와 gyrB로 구성되기 때문에 이들 유전자에 변이가 발생하면 항균제 내성이 증가한다[8].

FQ계 약제에 내성을 갖게 된 S. aureus의 출현 및 확산은 이러한 감염증 치료에 많은 어려움이 있으므로 임상적으로 중요한 문제가 된다. 따라서 S. aureus의 항균제 내성 기전을 밝히는 것은 이 세균의 치료와 예방 및 관리 계획을 수립하는데 중요하다[8, 9].

항균제 내성균의 유전자형은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)인 분자유전학적 분석을 이용하여 결정한다. 이러한 분자유전학적 분석을 이용한 QRSA의 유전자형 결정은 표현형 결정 시간보다 짧은 시간 내에 확인할 수 있으며 실험적으로 검색된 유전자형이 같아도 유전자의 변이 등으로 표현형이 다를 수 있으므로 이를 규명해야 한다[9].

본 연구에서는 혈액배양으로부터 분리된 총 60개의 QRSA를 대상으로 QRDR 부위의 DNA 염기서열 분석법을 이용해 FQ 항균제 내성균주에서 gyrA, gyrB 유전자에서 발생한 DNA 돌연변이의 분자유전학적 특성을 분석하고, SCCmec 유전자형에 따라 QRDR에서 나타나는 돌연변이의 양상을 조사하여 임상에 제공함으로써 QRSA에 대한 병원감염관리에 도움을 줄 수 있는 기초자료를 만들고자 한다.

1.연구대상

대전광역시 소재 850병상 규모의 종합병원에서 2016년 8월부터 2018년 6월까지 진단검사의학과 임상미생물검사실에 의뢰된 혈액배양 검체 중 S. aureus로 분리 배양된 총 60개의 QRSA 임상분리균주를 대상으로 연구를 수행하였다. 혈액배양 양성 배양병에서 중복 균주의 포함 없이 단일 균주로 균주별 항균제감수성시험, 메티실린 내성 관련 유전자 분석, FQ 내성 관련 유전자 분석을 실시하였다.

2.연구방법

1)혈액배양

환자로부터 전혈 검체를 무균적으로 채취하여 BACTEC FX (Becton Dickinson)를 이용하여 성인은 BACTEC PLUS Aerobic/F (Becton Dickinson)와 BACTEC LYTIC Anaerobic/F Bactec Plus (Becton Dickinson)를 세트로, 소아는 BACTEC PEDS PLUS/F (Becton Dickinson)와 BACTEC LYTIC Anaerobic/F Bactec Plus (Becton Dickinson)를 세트로 하여 5일간 배양하였다. BACTEC FX 시스템에서 배양하였으며, 균이 배양된 경우 그람염색과 동시에 혈액우무배지에 접종하여 5% CO₂, 35℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 분리된 균종들은 집락 성상과 그람염색 결과와 생화학적 시험을 이용하여 S. aureus를 분류하였다.

2)Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) 질량분석기를 이용한 세균 동정

혈액배양에서 단일 집락으로 분리‧배양된 모든 균주를 대상으로 Microflex MALDI Biotyper (Bruker Daltonics) 장비로 검사를 수행하였으며, 분석 결과는 MALDI Biotyper RTC software version 3.1 (Bruker Daltonics)을 이용해 세균 동정 결과를 도출하였다. 분리된 균주는 24시간 배양한 단일 집락을 멸균 상태로 MSP 96 Target Polished Steel BC Microscout Target Plate (Bruker Daltonics)에 도말한 후 세균이 마른 다음, 매트릭스 용액(50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid)과 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 첨가한 시약 1 μL를 가하여 실온에서 완전히 건조시킨 후 Microflex MALDI Biotyper 장비에 장착하여 분석하였다. 기기회사 기준 동정치(cut-off score)가 2.0 이상이면 균종 동정이 가능한 것으로, 1.7 이상 2.0 미만인 경우 균속 동정이 가능한 것으로, 1.7 미만인 경우 신뢰성이 없는 것으로 판정하였다.

3)항균제 감수성시험

혈액배양 검사에서 계대 배양된 단일 집락을 BBL^TM PROMPT^TM Inoculation System (Beckman Coulter)을 이용하여 Positive MIC 28 Panel에 접종하여 MicroScan^Ⓡ WalkAway 96 Plus System (Beckman Coulter)을 이용하여 검사하였다. 최소발육억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 결과값은 국제적으로 합의된 규격인 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 지침(CLSI M100 S30)에 따라 감수성(susceptible), 중등도 내성(intermediate) 또는 내성(resistant)으로 분류하였다.

항균제 감수성시험에 사용된 항균제는 amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, azithromycin, CIP, clindamycin, daptomycin, erythromycin, fosfomycin, fusidic acid, gentamicin, imipenem, LVX, linezolid, MXF, mupirocin, oxacillin, penicillin, rifampin, quinupristin-dalfopristin, tetracycline, teicoplanin, trimethoprim-sulfamethoxazole, vancomycin 총 23종이다.

4)MRSA 임상분리균주로부터 genomic DNA (gDNA) 추출

MRSA 분리균주의 분자유전학적 특성 분석을 위하여 blood agar plate에서 분리된 단일 집락에서 gDNA를 추출하였다. 배양된 세균의 단일 집락을 백금이로 취하여 5% Chelex^Ⓡ Resin (Bio-Rad) 용액 500 μL에 혼탁시켜 10분간 끓인 다음, 3,000 ×g로 10분간 원심분리하여 나온 상층액을 멸균튜브로 옮겨 NanoDrop^TM 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)를 이용해 추출한 gDNA의 농도와 순도를 확인한 후, 분석 시까지 ‒20℃에서 냉동 보관하였다.

5)S. aureus-specific PCR을 이용한 S. aureus의 종 재동정

세균 배양과 생화학적 검사법을 기초로 한 세균 동정 결과의 재확인을 위해 S. aureus-specific PCR 분석을 수행하였다. Prime Taq PCR Premix (GeNet Bio) 10 μL를 forward와 reverse primer 각 10 pmol/μL, 추출한 gDNA를 주형 DNA로 3 μL, 멸균 증류수 5 μL를 가하여 총 20 μL의 혼합액을 만들어 PCR을 수행하였다. 이 연구에 사용된 primer의 염기서열은 기존 연구 자료를 바탕으로 수행하였다[5].

S. aureus-specific PCR은 94℃에서 5분간 변성전처리 과정 후 94℃에서 denaturation 30초, 60℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 30초를 기준으로 30 cycle을 반복하고 72℃에서 final extension 과정을 5분간 반응하였다. 증폭 반응이 끝난 PCR 산물의 크기는 278 bp이며 2% agarose gel/tris boric acid ethylene-diamine-tetraacetic acid (TBE) DNA 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다.

6)SCCmec Subtyping

MRSA의 분자유전학적 역학조사방법인 SCCmec subtyping 방법을 이용하여 임상 검체 및 환경에서 분리된 MRSA 균주들의 유전형을 비교분석 하기 위해, Prime Taq Premix에 forward primer와 reverse primer를 각각 10 pmol씩 분주하고, 추출한 주형 DNA 1 μL, 멸균증류수 7 μL 분주하여 총 20 μL 혼합액을 만든 후 타겟한 유전자를 PCR을 통해 증폭하였다. MRSA의 SCCmec subtyping을 위해 Oliveira 등[10]이 제시한 multiplex PCR 방법에 따라 시행하였다[11].

7)DNA 전기영동

0.5% TBE buffer 30 mL에 아가로스(agarose)를 0.45 g 혼합 후, DNA 염색을 위해 SYBR^Ⓡ (Thermo Fisher Scientific) 3 μL를 첨가하여 agarose 겔을 만들었다. 완료된 PCR 산물을 1.5% agarose/TBE gel의 각 well에 분주하여 100 V, 20분간 전기영동 시행 후 100 bp DNA ladder marker (Thermo Fisher Scientific)와 비교하여 결과를 확인하였다.

8)염기서열 분석을 이용한 gyrA와 gyrB 유전자에서의 DNA 돌연변이 검출

QRDR 부위 중 gyrA와 gyrB 유전자의 DNA 돌연변이가 주로 발생하는 핫 스팟 영역을 PCR을 통해 증폭하였다. gyrA와 gyrB 유전자의 돌연변이 발생 핫 스팟 영역을 증폭할 수 있는 primer set는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank 데이터베이스에 공개되어 있는 참조 시퀀스에 따라 설계했으며[12, 13], DNA 돌연변이 부위는 S. aureus American Type Culture Collection (ATCC) 12600 표준균주의 표준 염기서열과 비교하여 분석하였다. FQ 저항에 대한 PCR은 8 mL (≤1 μg/μL)의 DNA 템플릿이 포함된 제조자 설명서에 명시된 Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen^Ⓡ)를 사용하여 수행하였다. gyrA와 gyrB 유전자 염기서열 분석을 위한 PCR의 조건은 95℃에서 5분간 pre-denaturation 후 95℃에서 denaturation 30초로 35 cycle, 50℃에서 primer annealing 30초로 35 cycle, 72℃에서 extension 과정 30초로 35 cycle을 반복하고, 72℃에서 final extension 과정을 5분간 반응하였다. 대상의 분획 존재유무는 전기영동에 의해 확인했으며, PCR 생성물 4 μL와 1 μL의 로딩 염료를 1.5% (w/v)의 agarose 겔에 1×TBE에 잠기게 하였다. 겔은 90 V에서 60∼90분 동안 가동하고 Florosafe (1st BASE^Ⓡ)로 염색하였다. DNA Ladder (Genaid^Ⓡ)는 PCR 제품의 분자 크기를 결정하는 데 사용되었다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 Macrogen 염기서열 분석 서비스(Macrogen Inc.)를 통해 염기서열 분석을 실시 하였으며, 염기서열 분석이 완료된 결과는 DNA Sequencing SoftWare Chromas (Technelysium Pty Ltd)를 이용하여 돌연변이 부위를 확인하였다.

1.혈액배양에서 MRSA의 분리빈도 및 결과 재확인

연구기간 동안 시행된 혈액배양 총 1,819건 중 혈액배양 양성 검체 162건(8.9%) 중 63건(3.5%)에서 S. aureus가 분리되었고, 그 중 60건(3.3%)이 MRSA로 분리되었다. 분리된 균주의 신뢰성을 확보하기 위해서 재확인 과정을 거쳤다. 과정으로 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 진행하였으며 분석된 동정치 2.0 이상으로 균종이 동정된 S. aureus 60 균주를 S. aureus-specific PCR로 재확인한 결과 모든 균주가 S. aureus로 확인되어 두 검사법 간의 결과가 100% 일치함을 확인하였다. 증폭 반응이 끝난 PCR 산물의 크기는 278 bp이며 2% agarose gel/TBE DNA 전기영동을 통해 그 결과를 확인하였다(Figure 1).

Fig. 1. Staphylococcus aureus specific PCR result. PCR was performed with DNA extracted from S. aureus, which was identified by blood culture and biochemical testing. The size of PCR products was 278 bp and 2% agarose gel/TBE DNA electrophoresis was used to confirm S. aureus.
Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; TBE, tris boric acid ethylene- diamine-tetraacetic acid; MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus; CTL, control.

2.항균제 감수성 검사

총 MRSA 60균주의 항균제 시험 결과, 60균주 전체가 amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin에 내성을 보였다. MXF는 59개 내성으로 98.3%, LVX는 내성 58개 균주로 96.7%, clindamycin 내성은 55개로 91.7%, azithromycin은 내성 53개로 88.3%를 보였다. CIP는 모두 내성, daptomycin은 모두 감수성, erythromycin은 내성 53개로 88.3%, gentamicin은 내성 44개로 73.3%를 차지했으며, tetracycline은 내성균주 42개로 70%의 비율이었다. Fusidicacid는 내성 39개로 65%, fosfomycin은 내성균주 21개로 35%, imipenem은 전부 내성, mupirocin은 17개로 28.3%, oxacillin과 penicillin은 모두 내성을 보였다. Rifampin은 내성 10개 균주로 16.7%, quinupristin-dalfopristin과 teicoplanin, trimethoprim–sulfamethoxazole과 vancomycin은 모두 감수성이었다.

FQ 약제에 속하는 CIP와 LVX, MXF의 비율은 CIP와 MXF가 내성인 균주는 59개로 98.3%, CIP가 내성이고 LVX가 내성인 균주는 58개로 96.7%, LVX와 MXF의 내성균주는 58개로 96.7%이다. 3개 항균제 모두 내성인 균주도 58개로 96.7%를 보였다(Table 1).

Table 1

Fluoroquinolone antimicrobial susceptibility profiles of MRSA isolates

Antibiotic resistance	MRSA
CIP, LVX	58 (96.7)
CIP, MXF	59 (98.3)
LVX, MXF	58 (96.7)
CIP, LVX, MXF	58 (96.7)

n (%).

Abbreviations: MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus; CIP, ciprofloxacin; LVX, levofloxacin; MXF, moxifloxacin.

3.SCCmec 유전자형 분석

혈액배양에서 분리된 MRSA 60주를 대상으로 multiplex PCR 방법을 사용하여 SCCmec 유전자형 분석을 진행하여 결과를 분석하고 SCCmec 유전자형을 결정하였다. MRSA 임상 균주들의 SCCmec 유전자형은 type II 44개, IVa 5개, type III 1개, type V 1개, non typeable 11개로 분석되었다(Table 2). type III과 type V의 균주는 같은 균주에서 분석된 것으로 type II와 함께 보였다.

Table 2

Result of SCCmec types of MRSA isolates

mecA gene	SCCmec type	Subtyping of SCCmec type IV				Total (N=60)
		a	b	c	d
+	II	‒	‒	‒	‒	44 (73.3)
+	IV	+	‒	‒	‒	5 (8.3)
+	III	‒	‒	‒	‒	1 (1.7)
+	V	‒	‒	‒	‒	1 (1.7)
+	Non typeable	‒	‒	‒	‒	11 (18.3)

Type III and type V strains were analyzed from the same strain and were analyzed together with type II.

n (%).

Abbreviations: SCCmec, staphylococcal cassette chromosome mec; MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus.

4.SCCmec 유전자형에 따른 항균제 감수성 시험 결과

연구대상 균주 60균주로 진행된 결과로 SCCmec typing에서 가장 많은 비율을 차지하는 내성균주는 SCCmec type II로, type II 균주의 70% 이상 내성을 갖고 있는 항균제는 amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, CIP, imipenem, oxacillin, penicillin, clindamycin, erythromycin이었으며, 균주의 50%∼70% 내성균을 갖고 있는 항균제는 tetracycline, fusidic acid, gentamicin이었고, 50% 미만으로는 fosfomycin, mupirocin, rifampin 항균제가 있었다. 그 다음으로 높은 내성률을 보이는 균주는 non typeable 균주로 항균제 내성이 특정 항균제에 대해서 20% 미만의 내성률을 보이고 있다. Type IV에서는 IVa를 제외한 균종에서 내성균주는 없었으며, type IVa의 내성은 10% 이하의 내성을 나타냈다. SCCmec type III와 V균주는 일부 항균제에 대해서 2% 이하로 낮은 내성을 보이고 있으며, daptomycin, teicoplanin, quinupristin-dalfopristin, trimethoprim–sulfamethoxazole, vancomycin 항균제는 모든 균주에서 감수성 결과를 보였다(Table 3).

Table 3

Analysis between antimicrobial susceptibility profiles resistance and SCCmec typing

Antibiotic resistance	SCCmec type
	II	IV				III	V	Non typeable
		a	b	c	d
Amoxicillin-clavulanic acid	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	11 (18)
Ampicillin	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	11 (18)
Azithromycin	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	5 (8)
Ciprofloxacin	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	11 (18)
Clindamycin	43 (72)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	6 (10)
Daptomycin	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)
Erythromycin	43 (72)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	5 (8)
Fosfomycin	20 (33)	1 (2)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	0 (0)
FusidicAcid	36 (60)	1 (2)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	2 (3)
Gentamicin	34 (57)	3 (5)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	9 (15)
Imipenem	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	11 (18)
Levofloxacin	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	10 (17)
Linezolid	1 (2)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)
Moxifloxacin	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	10 (17)
Mupirocin	11 (18)	1 (2)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	5 (8)
Oxacillin	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	11 (18)
Penicillin	44 (73)	5 (8)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	11 (18)
Rifampin	10 (17)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)
Synercid	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)
Teicoplanin	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)
Tetracycline	37 (62)	1 (2)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	1 (2)	1 (2)	4 (7)
Trimethoprim-sulfamethoxazole	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)
Vancomycin	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	0 (0)

n (%).

Abbreviation: SCCmec, staphylococcal cassette chromosome mec.

5.gyrA와 gyrB DNA 염기서열 분석을 위한 유전자 증폭산물 확인

2% agarose gel/TBE DNA 전기영동을 통해 QRDR 유전자인 gyrA와 gyrB를 확인하였다(Figure 2).

Fig. 2. PCR results for QRDR sequence analysis of gyrA and gyrB gene.
Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; QRDR, quinolone resistance-determining region; MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus; CTL, control.

6.QRSA 균주에 대한 gyrA와 gyrB의 DNA 돌연변이 위치

임상 검체에서 분리된 60개 QRSA 균주에 대한 gyrA의 돌연변이 위치는 249, 390, 497, 500, 513 및 744로 모두 6개의 돌연변이 유전자가 있었으며, gyrB의 돌연변이 위치는 1391, 1392, 1397, 1398, 1415 및 1416으로 모두 6개의 돌연변이 유전자가 발견되었다. gyrA와 gyrB 모두에 위치한 돌연변이는 249, 390, 497, 500, 513, 744, 1391, 1392, 1397, 1398, 1415, 1416으로 모두 12개의 돌연변이 유전자가 발견되었다(Tables 4, 5).

Table 4

Genetic mutations of gyrA and gyrB in 60 clinical specimens of QRSA

Mutations gene	Position	Total
Mutation only in gyrA	249, 390, 497, 500, 513, 744	6
Mutation only in gyrB	1391, 1392, 1397, 1398, 1415, 1416	6
Mutations in both gyrA and gyrB genes	249, 390, 497, 500, 513, 744, 1391, 1392, 1397, 1398, 1415, 1416	12
No mutation	0	0

Abbreviation: QRSA, quinolone resistant Staphylococcus aureus.

Table 5

DNA mutation pattern of gyrA and gyrB genes on QRSA clinical isolates

Clinical strain	Mutation pattern
	gyrA	gyrB
1	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
2	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
3	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A	A1574T, T1598C, T1748C
4	C2503T, A2612G, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
5	A2441C, C2503T, A2612G, A2670G, G2703T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A	A1574T, T1598C, T1748C
6	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, G2795C	A1574T, T1598C, T1748C, A1780C
7	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A	A1574T, T1598C, T1748C
8	A2441C, C2503T, A2612G, A2670G, G2703T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A	A1574T, T1598C, T1748C
9	C2503T, T2505C, A2612C, G2703T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777G, G2795C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
10	C2503T, G2514A, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
11	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777G, G2795C, T2781C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
12	C2503T, T2505C, A2642G, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
13	C2503T, A2642G, T2750C	A1574T, T1598C, T1748C
14	C2503T, T2750C, T2752C, G2795C	A1574T, T1598C, T1748C
15	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, G2795C, A2885G, T2888A	A1574T, T1598C, T1748C
16	C2503T, T2505C, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
17	C2503T, T2505C, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A	A1574T, T1598C, T1748C
18	C2503T, T2505C, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
19	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, T2815A	A1574T, T1598C, T1748C
20	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A	A1574T, T1598C, T1748C
21	C2503T, T2505C, A2753G, T2765A, C2777A, G2795C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
22	C2503T, T2505C, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
23	C2503T, G2703T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, G2795C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
24	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
25	Mixed pattern (DNA contaminated)	A1574T, T1598C, T1748C
26	C2503T, A2642G, A2670G, T2750C, A2753G, C2777G, T2801G, T2815A, A2822C, T2864A	A1574T, T1598C, T1748C
27	C2503T, A2642G, G2703T, T2750C, T2752C, A2753G, C2777G, T2801G, T2815A, A2822C, T2864A	A1574T, T1598C, T1748C
28	C2503T, T2505C, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, G2795C	A1574T, T1598C, T1748C
29	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, G2795C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
30	Mixed pattern (DNA contaminated)	A1574T, T1598C, T1748C
31	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1560C, A1574T, T1598C, T1748C
32	C2503T, T2750C, A2753G, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
33	C2503T, T2505C, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
34	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
35	C2503T, T2505C, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
36	G2514A, T2750C, A2753G, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
37	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
38	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
39	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
40	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
41	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2822C, T2864A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
42	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
43	C2503T, G2514A, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
44	A2642G, T2750C, A2753G, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
45	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, G2795C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
46	C2503T, T2505C, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
47	A2642G, T2750C, A2753G, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
48	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
49	C2503T, A2642G, T2750C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
50	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
51	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
52	C2503T, T2750C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C, A1780T
53	C2503T, A2642G, T2750C, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
54	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
55	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
56	C2503T, T2505C, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
57	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C
58	C2503T, T2750C, A2753G, T2765A, C2777A, A2885G	Mixed pattern (DNA contaminated)
59	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, T2765A, A2775T, C2777G, A2783G, A2787T, G2795C, T2798A	Mixed pattern (DNA contaminated)
60	C2503T, A2642G, T2750C, A2753G, A2885G	A1574T, T1598C, T1748C

Abbreviation: QRSA, quinolone resistant Staphylococcus aureus.

입원환자가 보균한 MRSA는 대표적인 의료관련감염의 원인균으로, 의료비의 증가와 직접적인 연관이 있어 세계적으로 중요한 문제가 되고 있다[14]. 비슷하게 S. aureus가 FQ계 항균제들에 내성을 가지면 QRSA라고 한다. MRSA나 QRSA와 같은 다제내성균 감염증은 사용할 수 있는 항균제가 제한적이며, 치료가 조금만 지연될 경우에도 예후가 악화될 수 있기 때문에 신속한 항균제 선택 및 투여가 필수적이다[14]. FQ 항균제는 그람양성균과 그람음성균 모두에 대한 탁월한 효능으로 인해 널리 사용되어 왔지만 급속도로 상승하는 내성률 때문에 사용에 신중을 기해야 한다[6].

Hashem 등[15]의 연구에 따르면 MRSA 분리균주 중에서 58%는 CIP 및 LVX에 내성이 있었다고 보고되었다. 항균제 감수성시험에서 FQ 약제에 속하는 CIP와 LVX, MXF의 비율은 총 60균주 중 MXF는 59개 내성으로 98.3%, LVX는 내성 58개 균주로 96.7%, CIP는 모두 내성으로 보였으며, 이 결과는 FQ 내성률을 구체적으로 조사한 다른 연구에서 관찰된 것보다 더 높았다[16-18]. 본 연구는 패혈증 환자에 원인체인 MRSA의 균주를 대상으로 실험한 연구로 선행 연구와 차이가 있지만 우리나라의 FQ 내성률이 높았다는 것을 알 수 있었으며 추후 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. QRSA에서 DNA gyrase와 topoisomerase IV 유전자를 암호화하는 QRDR의 변이는 퀴놀론에 내성을 갖는데 중요한 역할을 한다[7]. 새로운 돌연변이의 존재는 FQ 내성 유전자형의 복잡성을 증가시키고 공중 보건에 위협이 된다. 지속적인 항균제 감수성시험에 대한 감시 및 조사는 S. aureus가 어떻게 QRDR 돌연변이 및 FQ 내성을 만드는지 이해하는 데 도움이 될 것이고, 항균제를 올바르게 사용하여 다제내성균에 의한 감염을 줄이는 지표가 될 수 있을 것이다[19].

SCCmec I, II 및 III를 나타내는 S. aureus는 병원획득 관련 클론(HA-MRSA)에 속하며 다중 저항성 결정인자를 가지고 있는 반면, IV형은 지역사회 관련 클론(CA-MRSA)과 관련이 있다. 또한 SCCmec II형이 MRSA 사망률 증가와 관련이 있는 것으로 보고되었다[20].

Akpaka 등[20]의 연구에 따르면 MRSA를 SCCmec typing 분석한 결과 SCCmec II형과 III형이 90%, I형과 IV형은 10% 미만을 차지하는 것으로 보고되었다. 또한 Kim 등[11]의 연구에 따르면 임상 검체에서는 주로 SCCmec Type II형 및 Type IVa형, non typeable이 분석되었으며, SCCmec typing 분석 결과 대부분이 non typeable로 나타났고, SCCmec II형이 그 다음으로 많이 보였던 것으로 보고되었다.

임상 검체가 기존 연구에서 대부분 non typeable이 가장 우세하게 보고되었으나 본 연구에서는 non typeable이 두 번째로 많다는 연구결과가 나타나 약간의 상이한 결과를 보였다[11]. SCCmec II형이 우세한 것으로 분석되어 기존 연구와 비슷한 결과를 보였으며[11, 20] SCCmec 유전자를 보유하고 있는 MRSA 균주를 신속하게 식별할 수 있는 방안이 마련되어야 한다. 본 연구에서는 QRSA 균주에 대한 gyrA와 gyrB의 돌연변이 12개를 확인하였다. 이는 브라질의 한 병원에서 분리한 여러 계통의 다제내성 S. aureus SCCmec IV를 비교하고 parC 유전자에서 돌연변이와 gyrA 및 parC 유전자와 관련된 QRDR 영역의 돌연변이를 검출하였으며, 병원에서 만연했던 FQ 및 MRSA 분리균주의 클론 계통에 대한 MIC와의 연관성을 발견하였다는 보고와 좀 더 세심한 역학적 비교 검토가 필요할 것으로 생각된다[21]. gyrA 및 parC 유전자의 QRDR에 있는 이중 돌연변이를 포함하여 더 많은 돌연변이가 이 두 계통과 관련이 있으며, 실제로, 미국에서 분리된 S. aureus에서 QRDR의 돌연변이 수와 함께 증가하는 높은 FQ MIC뿐만 아니라 gyrA 및 parC에서 단일 및 이중 돌연변이를 발견하였다[22].

본 연구의 한계점은 QRSA 균주의 gyrA 및 gyrB 유전자의 돌연변이 위치만 분석한 점이다. 향후 FQ 및 MRSA 분리주의 클론 계통에 대한 추가 연구를 통해 gyrA, parC 유전자 관련 QRDR 영역의 돌연변이 검출 및 gyrB, parE 유전자 관련 다제내성 FQ 돌연변이 유전자의 관계 규명이 필요하다. 이는 국내 QRDR 돌연변이 유행 양상을 파악하고, 병원 내 QRSA 감염증 치료를 위한 적절한 항생제 선택 및 집단감염 예방에 유용한 정보를 제공할 수 있다.

플루오로퀴놀론(fluoroquinolone, FQ) 항균제 내성을 갖는 황색포도알균(Staphylococcus aureus)의 출현 및 확산으로 감염증 치료에 어려움을 겪고 있다. 이 퀴놀론 내성 황색포도알균(quinolone resistant S. aureus, QRSA) 에 대한 분자역학적 특성을 조사하여 치료에 도움을 주는 자료를 만들고자 하였다. 대전광역시 소재 1개 종합병원에서 혈액배양 검체에서 분리된 QRSA 균주를 대상으로 mecA와 SCCmec 유전자형 분석에 따른, gyrA, gyrB 유전자의 돌연변이를 조사하였다. Ciprofloxacin 내성균주는 SCCmec typing에서 II형이 44개로 73%, IVa형이 5개로 8%, III와 V형이 1개로 2%, non typeable 균주가 11개로 18%, levofloxacin, moxifloxacin은 II형이 44개로 73%, IVa형이 5개로 8%, III와 V형이 1개로 2%, non typeable 균주가 10개로 17%의 결과를 보였다. gyrA와 gyrB 영역 모두에서 58개로 96.7%, levofloxacin은 56개로 93.3%, moxifloxacin에는 57개로 95%를 나타냈다. QRSA 균주에 대한 gyrA와 gyrB의 돌연변이는 각각 6개씩 12개의 돌연변이가 확인되었다. 연구 대상 QRSA의 FQ 항균제의 내성률은 약 98%를 나타냈고, QRSA 균주에 대한 gyrA와 gyrB의 돌연변이는 각각 6개씩 12개의 돌연변이가 확인되었다.

This article is a condensed form of the first author’s master’s thesis.

This research was supported by the BB21 plus funded by Busan Metropolitan City and Busan Techno Park.

None

Hwang IW¹, Clinical laboratory technologist; Kim SH², Clinical laboratory technologist; Jung TW³, Clinical laboratory technologist; Kim YK¹, Professor; Kim S^4,5, Professor.

- Conceptualization: Kim S, Hwang IW.

- Data curation: Kim SH, Hwang IW.

- Formal analysis: Kim SH, Hwang IW, Kim SH.

- Methodology: Kim SH, Hwang IW.

- Software: Hwang IW, Jung TW.

- Validation: Kim SH, Hwang IW, Kim YK.

- Investigation: Kim YK.

- Writing - original draft: Hwang IW.

- Writing - review & editing: Kim YK, Kim SH, Kim S, Jung TW.

This article does not require IRB/IACUC approval because there are no human and animal participants.