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Development of a Synthetic Method for [68Ga]Ga-FAPI-04 Using a Cassette-based Synthesizer
Korean J Clin Lab Sci 2024;56:43-51  
Published on March 31, 2024
Copyright © 2024 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Jun Young PARK and Won Jun KANG

Department of Nuclear Medicine, Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea
Correspondence to: Won Jun KANG
Department of Nuclear Medicine, Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 50-1 Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Seoul 03722, Korea
E-mail: mdkwj@yuhs.ac
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2107-8160
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
[68Ga]Ga-FAPI-04 is a promising radiopharmaceutical that binds specifically to fibroblast activation protein, which is overexpressed in more than 90% of malignant epithelial tumors but not in normal healthy tissue. This study aimed to develop an efficient method for producing 68Ga-labelled FAPI-04 using a cassette-based automated synthesizer. [68Ga]GaCl3 was eluted from an Eckert & Ziegler Medical germanium-68/gallium-68 generator using 2.5 mL of 0.1 M HCl. The synthesis of the [68Ga]Ga-FAPI-04 was performed using different concentrations of HEPES (1∼2.5 M; 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid) in 3∼10 minutes; amounts of FAPI-04 precursor (5∼50 μg) and reaction temperature (25℃∼100℃) were optimized on the BIKBox synthesizer. The labeling efficiency of [68Ga]Ga-FAPI-04 was greater than 96% (decay corrected) using 25 μg FAPI-04 synthesized in 10 minutes at 100°C in 2 M HEPES (pH 3.85), and its stability was greater than 99% at 6 hours. The total synthesis time of [68Ga]Ga-FAPI-04 was 32.4 minutes, and the product met all quality control criteria. In this study, we developed and optimized a labeling method using [68Ga]Ga-FAPI-04 using a cassette-based synthesizer. The devised method is expected to be useful for supplying [68Ga]Ga-FAPI-04 for diagnosis in clinical practice.
Keywords : Fibroblast activation protein inhibitor, [68Ga]Ga-FAPI-04, Gallium-68, Radiopharmaceuticals
서 론

종양 내에서 암세포는 면역세포(immune cells), 버팀질세포(stromal cells), 내피세포(endothelial cells), 암연관섬유모세포(cancer-associated fibroblasts) 및 세포바깥바탕질(extracellular matrix) 등으로 구성된 미세환경(microenvironment)과 끊임없이 교신 및 상호작용을 통해 증식 및 전이 그리고 항암제에 대한 저항성을 획득한다[1, 2]. 특히, 암연관섬유모세포는 종양 미세환경을 구성하는 주요한 세포로써 세포바깥바탕질의 생성 및 재구성을 통해 암의 전이를 돕거나 성장인자를 분비하여 혈관발생(angiogenesis)을 유도하고, 면역세포들과의 상호작용을 통해 면역억제(immunosuppression)를 유도하는 것으로 알려져 있다[3]. Fibroblast activation protein (FAP), periostin, platelet-derived growth factor receptor, fibroblast-specific protein 1, palladin, twist, vimentin, tenascin C, CD90, galectin 1 등 다양한 암연관섬유모세포 표지자(marker)들 중 FAP는 약 97 kDa 분자량을 가지는 제2형 막경유 세린 단백분해효소(type II transmembrane serine protease)로써 다이펩타이드분해효소(dipeptidyl peptidase)와 펩타이드내부분해효소(endopeptidase) 활성을 가지고 있다[4, 5]. FAP는 정상세포에서는 거의 발현이 되지 않지만 활성화된 암연관섬유모세포 및 경화증(cirrhosis), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 섬유증(fibrotic diseases), 종양 등에 과발현 되어 있는 것으로 보고되어 있다[6, 7]. 특히, FAP는 폐암, 유방암, 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 전립선암 등 고형암의 버팀질에 과발현 되어있어 종양의 치료와 진단 및 진행 정도를 판단하는 종양표지자로써 역할과 유용성을 높이 평가받고 있다[8, 9].

최근 FAP와 특이적으로 결합하는 다양한 FAP 저해제(FAP inhibitor, FAPI)들이 개발되고 있으며, 특히 민감도가 높고 3차원적 영상으로 해석이 가능한 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography, PET)에 도입하기 위하여 fluorine-18 (18F), gallium-68 (68Ga) 등 방사성동위원소를 표지한 FAPI 기반 방사성의약품들이 개발되어 여러가지 질환에서 이들의 임상적 유용성을 평가하고 있다[10, 11]. FAP를 타깃으로 한 첫 임상적용은 1994년 전이성대장암환자를 대상으로 실시한 iodine-131 표지 F19 항체였으나, 항체의 특성상 분자량이 크고 생체 내 배출이 느려 영상제제로는 많은 한계점을 보였다[12, 13]. 하지만 이후 N-(4-quinolinoyl)-Gly-(2-cyanopyrrolidine) 구조물을 기반으로 한 저분자 화합물(small-molecule)이 개발되었고[14], 이를 개량한 FAPI-02, FAPI-04, FAPI-34, FAPI-46, FAPI-74 등 퀴놀린 기반(quinoline-based) FAPI가 개발되어 방사성의약품으로 응용되고 있다[15, 16].

68Ga은 germanium-68/gallium-68 (68Ge/68Ga) 제너레이터에서 손쉽게 용출할 수 있고 유지비가 들지 않으며 수용액상태에서 킬레이트제(chelator)와 안정적으로 결합할 수 있는 장점이 있어 68Ga 표지 방사성의약품의 사용빈도가 증가하고 있다[17]. 68Ga 표지 방사성의약품은 다양한 킬레이트제를 사용하는데 FAPI의 경우 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)를 가장 많이 도입하여 사용하고 있다. 하지만 DOTA는 68Ga과의 결합반응 시 수소이온농도지수(pH)에 의존적이기 때문에 FAPI와 합성반응은 pH에 따라 표지효율이 달라지며, FAPI 전구물질의 양과 반응온도도 표지효율에 영향을 줄 수 있어 최적화된 표지기술을 개발하는 것이 필요하다. 현재까지 개발된 다양한 FAPI 기반 방사성의약품들 중 [68Ga]Ga-FAPI-04는 다양한 종류의 종양에서 섭취율이 높고 전이를 구분할 수 있으며, 종양 대 배후방사능 비(tumor-to-background ratio)가 우수하여 임상적 유용성을 인정받고 있다[18]. 이에 본 연구에서는 [68Ga]Ga-FAPI-04의 임상적용을 위해 카세트기반(cassette-based) 방사성의약품 자동합성장치를 사용하여 합성하는 방법을 개발하고자 하였다.

재료 및 방법

1.장비 및 시약

본 연구에서 사용한 FAPI-04 (HY-128643)는 MedChem-Express사에서 구매하였고, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)는 GERBU Biotechnik GmbH사에서 구매하여 별도의 정제과정 없이 사용하였다. Sep-Pak C18 Plus Short (WAT020515) 카트리지는 Waters사의 제품을 사용하였고, 사용 전 5 mL의 에탄올로 흘려 준 후 10 mL의 주사용수로 전처리를 한 후 사용하였다. 68Ge/68Ga 제너레이터는 Eckert & Ziegler Medical사의 IGG-100 1.85 GBq (50 mCi) 제품을 사용하였다. 멸균필터는 Supor AEF 0.2 μm Intravenous Filter (AEF1NTE)는 Pall Medical사 제품을 사용하였고, filtered venting needle은 International Medical Industries사에서 구매하여 사용하였다. 고순도 염산과 에탄올(200 Proof, United States Pharmacopeia grade)은 Sigma-Aldrich사에서 구매하였고, 내화학성 HENKE-JECT는 Henke-Sass Wolf GmbH사 제품을 사용하였다. 0.9% 생리식염수와 주사용수는 중외제약사에서 구매하여 사용하였다.

2.[68Ga]Ga-FAPI-04의 합성

[68Ga]Ga-FAPI-04는 68Ge/68Ga 제너레이터로부터 용출한 [68Ga]GaCl3를 별도의 농축과정 없이 FAPI-04 전구체와 직접 표지하는 분획법(fraction collection method)을 적용하여 합성하였다(Figure 1). [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지반응은 카세트기반 자동합성장치 BIKBox (BIK Therapeutics)를 사용하였다(Figure 2). BIKBox 장치용 카세트는 세 개의 매니폴드(manifold)로 구성되어 있으며, 매니폴드A에는 68Ge/68Ga 제너레이터로부터 68Ga을 용출하기 위한 0.1 N 염산 6 mL와 시약을 운반하기 위한 20 mL 주사기, 주사용수, FAPI-04 전구물질이 포함된 바이알, HEPES 버퍼가 포함된 바이알을 장착하였다. 매니폴드B에는 Sep-Pak C18 카트리지와 [68Ga]Ga-FAPI-04를 용출하기 위한 1 mL 에탄올·0.9% 생리식염수 혼합액(1:1, v/v)이 포함된 바이알을 장착하였고, 매니폴드C에는 9 mL 생리식염수를 담고 있는 20 mL 주사기를 장착하였다.

Fig. 1. Schematic illustration for the radiosynthesis of [68Ga]Ga-FAPI-04.
Abbreviation: HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid.
Fig. 2. BIKBox synthesizer equipped with cassette for the labelling of [68Ga]Ga-FAPI-04 and screenshot of the user software interface of BIKBox synthesizer.
Abbreviations: 68Ge/68Ga, germanium-68/gallium-68; HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; FAPI, fibroblast activation protein inhibitor.

1)시약준비

BIKBox 장치용 카세트 매니폴드A에 장착된 20 mL 주사기를 사용하여 FAPI-04 전구물질과 HEPES 버퍼가 들어있는 바이알에 공기압을 불어넣은 후 압력차를 이용하여 반응기(reactor)로 각각 전구물질과 버퍼를 이동하였다. 이후 주사용수를 흘려주어 카세트 내부를 세척하여 잔류되어있는 시약을 제거하였다.

2)68Ga의 용출

매니폴드A에 장착된 0.1 N 염산을 주사기 펌프를 사용하여 분당 2 mL의 속도로 68Ge/68Ga 제너레이터에 흘려주어 두 번에 나누어 용출하였다. 첫 번째 용출시 1.7 mL의 0.1 N 염산을 68Ge/68Ga 제너레이터에 흘려준 후 용출된 [68Ga]GaCl3는 폐기하였고, 두 번째 용출시 2.5 mL을 흘려주어 획득된 [68Ga]GaCl3는 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지반응에 사용하기 위하여 반응기로 이동시켰다. 이후 10 mL의 주사용수를 흘려주어 카세트 내부에 잔류되어있는 [68Ga]GaCl3를 제거하였다.

3)[68Ga]Ga-FAPI-04 합성 및 분리정제

[68Ga]GaCl3 용출액과 FAPI-04 전구물질 및 HEPES 버퍼가 들어있는 반응기를 25℃, 50℃, 100℃에서 10분간 반응시킨 후 압축공기를 사용하여 40℃로 식힌 다음 3 mL의 주사용수로 반응액을 희석하였다. 그리고 매니폴드A에 장착된 20 mL 주사기를 사용하여 반응액을 매니폴드B에 장착된 Sep-Pak C18 카트리지 통과시킨 후 주사용수를 5 mL씩 두 번 Sep-Pak C18 카트리지에 흘려주어 반응하지 않은 [68Ga]GaCl3, 잔류 HEPES 및 염산용액을 제거하였다.

4)[68Ga]Ga-FAPI-04의 멸균 및 포장

Sep-Pak C18 카트리지에 흡착된 [68Ga]Ga-FAPI-04는 에탄올·0.9% 생리식염수 혼합액을 통과시켜 매니폴드A에 장착된 20 mL 주사기에 용출한 후 매니폴드C에 장착된 생리식염수 9 mL로 희석하였다. [68Ga]Ga-FAPI-04 혼합용액은 주사기 펌프를 사용하여 0.22 μm 멸균필터에 통과시킨 후 멸균 바이알에 충전하였다. 표지효율을 최적화하기 위하여 각 합성은 3회 이상 실시하였고, 합성 후 방사화학적 수율(radiosynthesis yield)은 반감기를 보정한 붕괴 보정 수율(decay corrected yield)로 표기하였다.

3.[68Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리

제조 완료된 [68Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리는 유럽 약전(European Pharmacopoeia)에 명시된 Ga-68 에도트레오타이드([68Ga]Ga-DOTATOC) 주사액(monograph No. 2482) 및 Ga-68 전립선특이막항원-11 주사액([68Ga]Ga-PSMA-11)의 지침(monograph No. 3044)에 의거하여 품질관리를 시행하였다[19]. 성상은 육안으로 관찰하였고, 방사화학적 순도는 방사능-박층크로마토그래피(radio-thin layer chromatography)로 평가하였다. 방사능-박층크로마토그래피는 instant thin-layer chromatography on silica gel impregnated glass fiber sheets (ITLC-SG) (SGI0001; Agilent Technologies Inc.) 박층판에 [68Ga]Ga-FAPI-04를 점적한 후 1 M ammonium acetate·methanol 혼합액(1:1, v/v) 및 0.1 M sodium citrate을 전개용매로 각각 전개한 후 방사능-박층크로마토그래피 스캐너 AR-2000 (Eckert & Ziegler Medical)으로 분석하였다. 이핵종 분석은 다중채널분석기 ORTEC DigiBASE (AMETEK Inc.)를 사용하였고, 반감기는 CRC-25PET (Mirion Technologies) 방사능측정기를 사용하여 10분간 방사능을 측정한 후 반감기를 계산식으로 산출하였다. pH는 pH시험지(pH test strips pH 0-14; Sigma-Aldrich) 및 pH 측정기 SevenCompact™ S220 (Mettler Toledo)을 사용하여 측정하였다. 엔도톡신시험은 Endosafe nexgen-PTS™ (Charles River Laboratories)를 사용하여 실시하였고, 무균시험은 직접법으로 액상티오글리콜산배지 및 대두카제인소화배지(Becton, Dickinson and Company)에 접종 후 호기성균, 혐기성균 및 진균의 증식을 14일간 관찰하였다.

결 과

1.HEPES 농도에 따른 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

68Ge/68Ga 제너레이터에 0.1N 염산을 사용하여 용출한 두 번째 분획의 [68Ga]GaCl3 방사능 양은 1.15±0.06 GBq (31.1±1.5 mCi)이었다. HEPES 농도가 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율에 미치는 영향을 확인하기 위해 25 μg FAPI-04 전구체를 1, 1.5, 2, 2.5 M HEPES와 각각 섞은 후 2.5 mL의 [68Ga]GaCl3와 100℃에서 10분간 반응하였다. HEPES의 농도에 따른 FAPI-04 반응액의 pH는 HEPES 1 M일 경우 3.4, 1.5 M은 3.6, 2 M은 3.85, 2.5 M은 4.0이었다. [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율은 HEPES 1 M을 사용할 경우 80.0%±1.25%, 1.5 M의 경우 89.4%±1.56%, 2 M의 경우 96.1%±1.14% 그리고 2.5 M을 사용할 경우 90.0%±1.33%이었다 (Figure 3A). 2 M HEPES를 사용하여 pH 3.85에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었으므로 이후 반응은 2 M HEPES를 사용하여 최적화 하였다.

Fig. 3. Effect of different reaction conditions on the radiochemical yield of [68Ga]Ga-FAPI-04. (A) Concentration of HEPES buffer, (B) reaction time, (C) amount of FAPI-04 precursor, (D) reaction temperature of the reaction mixture. Data are presented as the mean± standard deviation. Statistical analysis was performed by Student’s t-test, *P<0.05, ***P<0.001.
Abbreviations: HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; FAPI, fibroblast activation protein inhibitor.

2.반응시간에 따른 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

반응시간에 따른 표지효율을 확인하기 위해 25 μg FAPI-04 전구체와 2 M HEPES를 [68Ga]GaCl3와 100℃에서 각각 3, 5, 10분간 반응하였다. 3분간 반응할 경우 전체 합성시간은 25.3분이 소요되었고 5분간 반응 시 28분이 소요되었고 10분간 반응할 경우 32.4분이 소요되었다. 3분간 반응할 경우 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율은 85.2%±0.33%이었고, 5분간 반응할 경우 85.4%±0.40%로 반응시간 3분과 5분간에는 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(P<0.05). 하지만 10분간 반응할 경우 96.1%±1.14%로 표지효율이 가장 높았다(Figure 3B).

3.전구체 양에 따른 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

FAPI-04 전구체 양에 따른 표지효율을 확인하기 위해 5, 10, 25, 50 μg의 FAPI-04 전구체를 2 M HEPES 및 [68Ga]GaCl3와 100℃에서 10분간 반응하였다. 5 μg의 FAPI-04 전구체로 반응할 경우 표지효율은 87.1%±1.05%이었고, 10 μg으로 반응할 경우 89.0%±0.36%, 25 μg으로 반응할 경우 96.1%±1.14%, 50 μg으로 반응할 경우 92.0%±1.71%이었다(Figure 3C).

4.반응온도에 따른 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

반응온도에 따른 표지효율을 확인하기 위해 25 μg의 FAPI-04 전구체와 2 M HEPES를 [68Ga]GaCl3와 섞은 후 25℃, 50℃, 100℃에서 각각 10분간 반응하였다. 25℃에서 반응할 경우 표지효율은 3.5%±0.30%이었고, 50℃에서 반응할 경우 49.3%±0.46%, 100℃에서 반응할 경우 96.1%±1.14%이었다(Figure 3D). [68Ga]Ga-FAPI-04 표지반응은 분획법을 적용하여 반응액의 총 부피가 4 mL이므로 상온에서는 매우 낮은 표지효율을 보이지만 100℃의 열을 가할 경우 유의하게 높은 결합효율을 보였다(P<0.001).

5.[68Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리

최종 생산된 [68Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리 시 유럽 약전에 명시된 지침의 모든 평가기준을 만족하였다(Table 1). 성상 평가를 위해 육안으로 관찰 시 68Ga-FAPI-04는 맑고 투명하며 부유입자는 관찰되지 않았다. 방사화학적 순도는 방사능-박층크로마토그래피로 측정 시 99% 이상으로 확인되었다. ITLC-SG에서 1 M ammonium acetate·methanol 혼합액(1:1, v/v)으로 전개 시 [68Ga]Ga-FAPI-04의 머무름 인자(retention factor, Rf)는 0.8∼1.0이었고, 0.1 M sodium citrate을 전개용매로 전개 시 Rf는 0.1∼0.2이었다(Figure 4A). [68Ga]GaCl3의 경우 1 M ammonium acetate·methanol 혼합액(1:1, v/v)으로 전개 시 Rf는 0.1∼0.2이었고, 0.1 M sodium citrate로 전개 시 Rf는 0.8∼1.0로 [68Ga]Ga-FAPI-04와 반대로 나타났다(Figure 4B). 다중채널분석기를 사용한 방사성핵종 순도시험 시 511 KeV 및 1,077 KeV 이외의 피크는 검출되지 않았고, 방사능측정기로 측정된 [68Ga]Ga-FAPI-04의 반감기는 67.0±0.2분으로 68Ga의 반감기 기준인 62∼74분을 만족하였다. pH는 5.5∼5.7으로 기준범위인 pH 4.0∼8.0을 만족하였다. 엔도톡신시험에서 [68Ga]Ga-FAPI-04의 엔도톡신은 175 EU/V 미만으로 검출되었으며, 무균시험에서 미생물이나 진균의 증식은 발견되지 않았다.

Data summary of the QC for [68Ga]Ga-FAPI-04

QC test Method Acceptance criteria Results Guideline
Appearance Visual inspection Clear, colorless Pass KP, EP
pH pH meter 4.0∼8.0 5.5∼5.7 EP
Radionuclidic identity Half-life Ga-68: 62∼74 min 67 min EP
Gamma spectroscopy 511, 1,077 KeV 511 KeV
Radiochemical purity Radio-ITLC >95% >99% EP
Radionuclidic purity Gamma spectroscopy 511 keV>99.9% >99.9% KP, EP
Chemical purity Spot test HEPES<20 μg/mL Pass EP
Membrane filter integrity Bubble point test Supor AEF (Pall Medical)≥46 psi Pass EP
Foreign insoluble matter Visual inspection No particles Pass KP, EP
Bacterial endotoxin Limulus amebocyte lysate test 17.5 EU/Vmax <5.0 EU/mL KP, EP
Sterility Tryptic soy broth at 20℃∼25℃ No growth observed after 14 days Sterile KP, EP
Fluid thioglycolate medium at 30℃∼35℃

Abbreviations: QC, quality control; KP, Korean Pharmacopoeia: EP, European Pharmacopoeia; ITLC, instant thin-layer chromatography; HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; EU, entotoxin units; Vmax, maximum recommended volume in millilitres.


Fig. 4. ITLC chromatograms of (A) [68Ga]Ga-FAPI-04 and (B) [68Ga]GaCl3 using ITLC-silica gel plates as a stationary phase, and a 0.1 M sodium citrate (left) and a 1 M NH4OAc/MeOH (1:1, v/v) (right) as a mobile phase.
Abbreviations: ITLC, instant thin-layer chromatography; NH4OAc, ammonium acetate; MeOH, methanol; Rf, retention factor.
고 찰

FAP는 정상세포에는 거의 발현되지 않지만 90% 이상의 고형암에 과발현 되어있고 종양의 침투, 발달 및 전이와도 밀접한 관련이 있어 FAP에 특이적으로 결합하는 FAPI를 이용한 방사성의약품은 암진단제로서 잠재력을 높이 평가받고 있다[20]. 핵의학에서 종양의 진단, 병기판정 및 치표평가는 [18F]-fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) PET을 가장 많이 사용하고 있지만 [18F]FDG는 포도당 대사물질로써 감염성 질환이나 염증에서도 섭취되므로 종양에 특이적이지는 않다[21]. 하지만 FAPI는 포도당대사에 의존하지 않기 때문에 FAPI 기반 방사성의약품은 뇌, 간, 심근, 위장관, 골수 등 생리적으로 포도당의 섭취가 높은 장기에서 [18F]FDG보다 상대적으로 섭취가 낮고 종양 특이적으로 결합하여 다양한 암에서 [18F]FDG보다 임상적으로 유용성이 높은 것으로 보고되고 있다[22, 23]. 이에 iodine-125, fluorine-18, gallium-68, lutetium-177, indium-111 등 진단용 및 치료용 방사성동위원소를 FAPI에 표지하기 위해 다양한 합성법들이 개발되고 있다[24]. 진단용 방사성의약품에 가장 많이 사용되는 18F의 경우 aluminium-[18F]fluoride ([18F]AlF)를 활용하여 FAPI 기반 진단용 방사성의약품으로 개발되었으나 68Ga 합성법에 비해보다 표지수율이 낮고 합성법이 복잡하며 사이클로트론 시설을 갖추어야 하는 단점이 있다[25]. 하지만 68Ga은 제너레이터를 사용하여 손쉽게 얻을 수 있고 킬레이트제를 사용하여 높은 표지수율로 합성할 수 있기 때문에 68Ga 표지 FAPI 기반 진단용 방사성의약품이 임상에서 가장 활발히 연구되고 있다.

68Ga 표지 진단용 방사성의약품의 합성은 68Ge/68Ga 제너레이터로부터 [68Ga]GaCl3를 용출하여 후처리 하는 방법에 따라 분획법과 농축법(pre-concentration and purification method)으로 분류할 수 있다[26]. 분획법은 68Ge/68Ga 제너레이터를 염산으로 용출 시 용출되는 [68Ga]GaCl3 용출액 중 가장 많은 방사능을 포함하는 부분만 사용하는 방법이고, 농축법은 용출되는 68Ga 용출액을 양이온 혹은 음이온 교환수지를 사용하여 68Ga만 포획한 후 용출액의 부피를 크게 줄여서 합성하는 방법이다. 농축법은 작은 부피로 표지하므로 전구체의 양도 줄일 수 있고 표지효율도 높일 수 있지만 농축과정이 포함되므로 분획법보다 복잡한 표지과정을 거쳐야 하고, 합성시간이 늘어나는 단점이 있다. 하지만 분획법은 표지반응 시 반응액의 부피가 늘어나 표지효율이 떨어질 수 있으나 합성방법이 간단하여 카세트를 사용한 자동화합성장치에 적용하기가 쉽다. 최근 EasyOne (Trasis), GaSy synthesizer (Synthra GmbH), GallElut (Scintomics GmbH) 등 다양한 68Ga 표지 방사성의약품 합성용 자동합성장치들이 출시되었다[19]. 하지만 대부분의 자동합성장치는 분획법을 적용한 카세트기반 합성장치로 1회용 카세트를 사용하기 때문에 사용이 간편하고 제조 후 세척과정이 필요하지 않으며 준비과정에서 불필요한 오염을 줄일 수 있어 의약품 제조 및 품질관리기준(good manufacturing practice)에 적합하게 생산할 수 있는 장점이 있다. 또한 다양한 68Ga 표지 FAPI 기반 방사성의약품이 개발됨에 따라 자동합성장치를 사용하여 이들의 합성방법을 최적화하는 연구 또한 활발히 진행되고 있다[27, 28]. 이에 본 연구에서는 국내에서 출시된 카세트기반 자동합성장치를 사용하여 [68Ga]Ga-FAPI-04를 합성하는 방법을 개발하고자 하였다.

DOTA는 pH 3.5∼5에서 [68Ga]GaCl3와 표지효율이 가장 높은 것으로 알려져 있다[29]. 68Ge/68Ga 제너레이터에 0.1 N 염산을 사용하여 용출한 [68Ga]GaCl3의 pH는 0∼1이므로 68Ga을 높은 표지효율로 DOTA와 결합하기 위해 완충액을 사용하여 pH를 3.5∼4로 조절해야 한다. 68Ga 표지 방사성의약품 합성에 가장 많이 사용하는 완충액은 sodium acetate, ammonium acetate 및 HEPES 등이 있다[30]. 그 중 HEPES는 양이온성과 음이온성을 모두 갖고 있는 양쪽성 완충제(zwitterionic buffer)로 금속과 복합체를 잘 형성하지 않고 고온에서 합성반응 시 콜로이드(colloid) 형성을 감소시켜 68Ga 표지에 많이 사용된다[29]. 본 실험에서는 pH가 표지효율에 가장 큰 영향을 미치므로 먼저 HEPES의 농도에 따른 68Ga-FAPI-04의 표지효율을 확인한 결과 2 M HEPES를 사용할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었고(P<0.05), 표지반응을 10분간 반응하였을 때 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있다. 전구체 양에 따른 표지효율의 변화를 확인한 결과 25 μg의 FAPI-04 전구체를 사용할 경우 표지효율이 가장 높았고, 반응온도는 100℃에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었다(P<0.001). 이에 본 연구결과를 바탕으로 [68Ga]Ga-FAPI-04의 최적 표지조건은 25 μg의 FAPI-04 전구체를 2 M HEPES의 완충액을 사용하여 100℃에서 10분간 반응하는 것으로 확립할 수 있었다. 표지반응 후 [68Ga]Ga-FAPI-04의 멸균을 위하여 0.2 μm Supor AEF 멸균필터에 통과하였을 때 멸균필터 내 2.6%±0.10%의 방사능이 잔존하였고, [68Ga]Ga-FAPI-04의 안정성을 평가하기 위해 유효기간인 6시간동안 안정성을 확인한 결과 방사화학적 순도는 99% 이상으로 유효기간까지 안정한 것으로 확인하였다. [68Ga]Ga-FAPI-04의 총 합성시간은 약 32.4분이었으며, 최종 생산된 [68Ga]Ga-FAPI-04는 모든 품질관리기준을 만족하였다. 다만, 최근 연구에 따르면 [68Ga]Ga-FAPI-04와 구조가 유사한 [68Ga]Ga-FAPI-46의 표지반응 시 아스코르브산(ascorbic acid)을 첨가하여 표지효율을 더 증가시킨 방법이 보고됨에 따라 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율에 끼치는 영향에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다[26].

본 연구를 통해 FAP를 표적으로 하는 FAPI 기반 방사성의약품 [68Ga]Ga-FAPI-04의 표지방법을 카세트기반 자동합성장치를 사용하여 최적화 할 수 있었다. 이에 본 연구에서 개발한 [68Ga]Ga-FAPI-04 표지법은 안정적으로 추후 임상에서 환자의 진단을 위한 FAPI 기반 방사성의약품을 공급하는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

요 약

[68Ga]Ga-FAPI-04는 암세포에 과발현 되어 있는 fibroblast activation protein (FAP)에 특이적으로 결합하는 FAP 저해제(FAP inhibitor, FAPI)에 방사성동위원소 68Ga을 표지한 방사성의약품이다. 본 연구에서는 국내에서 제작된 카세트기반 자동합성장치를 사용하여 [68Ga]Ga-FAPI-04를 제조하는 방법을 개발하였다. [68Ga]Ga-FAPI-04의 합법을 개발하기 위해 완충액 HEPES의 농도, 반응시간, FAPI-04 전구체 양, 반응온도에 따른 표지효율을 확인하였다. [68Ga]Ga-FAPI-04는 2 M HEPES를 사용하여 pH 3.85에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었고, 반응시간이 10분일 경우와 25 μg의 FAPI-04 전구체를 사용할 경우 및 100℃에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었다. 또한 최종 합성된 [68Ga]Ga-FAPI-04는 모든 품질기준을 만족하여 본 연구를 통해 개발된 [68Ga]Ga-FAPI-04의 합성법은 FAPI 기반 방사성의약품생산에 활용도가 높을 것으로 예상된다.

Acknowledgements

None

Funding

None

Conflict of interest

None

Author’s information (Position)

Park JY, Clinical laboratory technologist; Kang WJ, Professor.

Author Contributions

-Conceptualization: Kang WJ.

-Data curation: Park JY.

-Formal analysis: Park JY.

-Methodology: Park JY.

-Software: Park JY.

-Validation: Park JY.

-Investigation: Park JY.

-Writing - original draft: Park JY.

-Writing - review & editing: Kang WJ.

Ethics approval

This article does not require IRB/IACUC approval because there are no human and animal participants.

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