용혈은 적혈구, 백혈구, 혈소판을 포함한 혈구의 파괴로 인한 세포 내용물의 유출로 정의할 수 있다[1, 2]. 용혈은 검체 결과에 영향을 미치는 lipemic, icteric한 간섭 요인들에 비해 영향이 큰 만큼 지금까지 많은 연구들이 진행되었다. 통계적으로 검사실에서 생기는 오류의 70%∼80%는 검사 전 단계(pre-analytical phase)에서 발생하며 그 중에서 용혈은 가장 비중 있게 다루어지는 요인인데[3], 이유는 다른 두 요인들에 비해 의료진에 의해서 발생할 수 있는 오류이면서 영향 정도가 다른 두 요인에 비해 다양한 검사 항목에서 나타나기 때문이다. 그러나 용혈의 영향 정도에 대해서 명확한 기준이 제시되지 않고 기관마다 별도의 기준을 정해서 사용하고 있다[4].

용혈이 생기는 요인으로는 크게 체내, 외적인 요인에서 발생한다[5]. 체내 용혈의 원인은 항원-항체 반응, 화학 반응, 용혈성 빈혈, 독성 물질, 인공 심장으로 인한 기계적 적혈구 파열, 혈액 투석과 같은 의료 개입 및 밸브 등으로 발생하며 모든 용혈 중에 2% 내로 발생한다. 체외 용혈이 생기는 요인으로는 채혈 과정[바늘 크기, 지혈대 압박 시간, 주사기(syringe) 채혈 시 plunger를 누르기 등], 검체 이송, 검체 전처리 과정 및 채혈자의 부족한 채혈 실력 등에서 발생하는데 이 중에서 주사기 채혈 시 plunger를 누를 때 주로 용혈이 발생한다[6-10]. 용혈이 검사 결과에 영향을 미치는 기전으로는 크게 네 가지로 구분할 수 있다[6]. 분광 간섭, 세포 내 고농도 성분의 방출, 검체 희석 효과 및 물리 화학적 간섭의 메커니즘을 통해 발생되며[7], 검사 항목마다 간섭이 발생하는 기전이 각각 다르다. 따라서, 용혈에 의한 다양한 간섭 원인에 따라 검체 취급과 검사에 적절한 방지 대책을 수행하여야 한다[6].

지금까지 용혈에 대한 많은 연구 결과들은 있었지만 영향 받는 항목, 정도에 대한 결과는 다양하게 나타났다[11]. 이런 현상이 나타나는 이유는 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째, 용혈에 대한 영향을 파악하기 위해 검체의 준비 및 전처리하는 방법이 다르다[6, 12-14]. 두 번째, 현재 화학 검사실에서 사용하는 장비 제조사에 따라 용혈 지수(hemolysis index, HI)가 다르게 표현된다. 그래서 지금까지 장비별 일치화를 위한 노력이 있었지만 아직 그 효과는 크지 않다. 따라서 화학 검사를 위해 사용하는 장비마다 혈청지수(serum index)에 대한 검사 방법, 보고 범위 및 단위가 다르며 검사실마다 보고 기준, 용혈된 검체 처리 방법, 보고 유무 등도 다르기 때문에 공통 연구를 통해 일치화 과정의 필요성이 꾸준히 제기되고 있다[4, 15].

현재 본 병원에서 사용하는 cobas^Ⓡ c702 (Roche Diagnostics)에서 각 항목마다 설정된 HI의 cut-off 값들은 삼투압 충격(osmotic shock)법을 이용한 연구 결과이다. 그러나 이 방법은 연구 검체들을 희석을 하며 진행하였기 때문에 결과의 정확도가 높지 않다. 이러한 문제 인식을 바탕으로 하여 혈청지수 일치화를 위한 첫 단계로서 임상에서 용혈로 인해 부적합 처리된 환자의 검체와 재채혈한 용혈되지 않은 검체를 직접 비교함으로써 영향 받는 검사 항목 및 영향 정도를 알아보고, 검사실 자체의 허용 HI 값을 구하여 제조사에서 제공하는 값과 비교해 보았다.

1.연구 대상 및 데이터 수집

본 연구는 2023년 1월부터 7월까지 경북대학교병원의 외래 및 입원 환자를 대상으로 진료를 위해 채혈된 검체 중 동일 환자의 용혈된 검체와 용혈 되지 않은 검체를 비교하였다. 용혈된 검체 총 540건 중에서 첫 번째 채혈 후 환자의 조건(식이, 약물 등)이 검사에 영향을 줄 수 있는 검체 223건은 제외하였으며, 첫 번째 채혈 후 재채혈까지 30분 이상 경과한 검체 80건, 다른 간섭 요인(lipemia, icterus)이 있었던 검체 22건도 제외하였다(Table 1). 단, 채혈 장소, 채혈자, 채혈 도구, 환자 병명, 진료과 등의 조건은 고려하지 않았으며 오직 용혈 유무만을 판단하여 비교 검사를 진행하였다. 본 연구는 병원 quality improvement 활동 및 정도 관리를 위한 연구로 경북대학교병원(진단검사의학과)에서 연구계획부터 승인하에 진행되었다.

Table 1

Characteristics of hemolyzed samples enrolled or excluded

Sample	Characteristic	No.
Enrolled samples	HI 51∼100	46
	HI 101∼200	62
	HI 201∼300	56
	HI >300	51
	Subtotal	215
Excluded samples	2nd samples rejected due to non-fasting, drugs, etc	223
	Delayed recollection (interval>30 min)	80
	Concomitant other interfering factors (lipemia, icterus)	22
	Subtotal	325
Total		540

Abbreviation: HI, hemolysis index (measured by cobas^Ⓡ c702).

2.검체의 전처리

혈장(plasma)은 BD VacutainerⓇ BarricorTM Plasma blood collection tube (Becton, Dickinson and Company)에 채혈 후 5분간 3,134 g으로 원심분리하여 검사를 진행하였다. 용혈 방지 혹은 제거를 위하여 재채혈 이외 다른 술식을 사용하지는 않았다.

3.연구 방법

본 연구에서 육안 판정을 통해 용혈로 부적합 판정을 받은 검체에 대하여 재채혈을 시행하였고, 최초 용혈 검체와 재채혈된 용혈 되지 않은 검체간 임상화학 검사결과를 비교하여 용혈의 영향을 조사하였다. 생화학자동분석기는 cobas^Ⓡ c702를 사용하여 총 23 항목들(Table 2)을 검사하였다.

Table 2

Characteristics of analytes by cobas^Ⓡ c702 (Roche) in this study

Analyte	Test principle	Reference range	Wavelength (sub/main)	Result unit
AST	UV absorbance	Male: 0∼40, female: 0∼32	700/340	U/L
ALP	Colorimetric	Male: 40∼129, female: 35∼104	480/450	U/L
ALT	UV absorbance	Male: 0∼41, female: 0∼33	700/340	U/L
Amy	Enzymatic colorimetric	28∼100	700/415	U/L
D-bil	Diazo method	0∼0.3	800/546	mg/dL
T-bil	Colorimetric diazo	0∼1.2	600/546	mg/dL
CK	UV assay	Male: 0∼190, female: 0∼170	546/340	U/L
GGT	Enzymatic colorimetric	Male: 0∼60, female: 0∼40	700/415	U/L
Iron	Colorimetric	33∼193	700/570	µg/dL
K	Ion-selective electrodes	3.4∼4.9	-	mmol/L
LDH	UV assay	0∼250	700/340	U/L
Mg	Colorimetric endpoint	1.6∼2.6	505/600	mg/dL
Phos	Molybdate UV	2.5∼4.5	700/340	mg/dL
TP	Colorimetric	6.4∼8.3	700/546	g/dL
UA	Enzymatic, colorimetric	Male: 3.4∼7, female: 2.4∼5.7	700/546	mg/dL
ALB	Colorimetric	3.5∼5.2	505/570	g/dL
CA	Photometrical	8.6∼10	376/340	mg/dL
Chol	Enzymatic, colorimetric	0∼200	700/505	mg/dL
Crea	Colorimetric	Male: 0.7∼1.2, female: 0.5∼0.9	570/505	mg/dL
Glu	Enzymatic UV, hexokinase	74∼106	700/340	mg/dL
Lip	Enzymatic colorimetric	13∼60	700/570	U/L
TG	Enzymatic colorimetric	0∼150	700/505	mg/dL
BUN	Kinetic test with urease and glutamate dehydrogenase	6∼20	700/340	mg/dL

Abbreviations: UV, ultraviolet; AST, asparate aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; ALT, alanine aminotransferase; Amy, amylase; D-bil, direct bilirubin; T-bil, total bilirubin; CK, creatine phosphokinase; GGT, γ-glutamyltransferase; K, potassium; LDH, lactate dehydrogenase; Mg, magnesium; Phos, phosphorus; TP, total protein; UA, uric acid; ALB, albumin; CA, calcium; Chol, cholesterol; Crea, creatinine; Glu, glucose; Lip, lipase; TG, triglyceride; BUN, blood urea nitrogen.

용혈의 정도를 나타내는 HI는 검체내 유리 헤모글로빈(free hemoglobin)을 파장 570 nm와 600 nm의 파장으로 비색법을 이용하여 측정하였다. 정상 검체의 기준은 생화학 검사 항목들 중 최소값인 lactate dehydrogenase (LDH)의 cut–off HI<15 및 lipemia, icterus index가 정상인 검체를 대상으로 하였다. 약한 용혈이 나타나는 HI가 51 이상인 검체부터 용혈이 되었다고 설정하였다. 비용혈 검체의 HI는 HI 50 이하의 검체 중 중앙값으로 설정하였다.

검사항목별로 같은 환자에서 용혈에 따른 결과값 차이의 상관 분석을 하였다.

1) Direct bilirubin (D-bil) 외 모든 검사: y = ax + b

2) D-bil: y = aln(x) + b

이 공식에서 변수 x는 ΔHI이며 변수 y는 ΔResult이다.

- ΔHI = HI^initial ‒ HI^recollected

- ΔResult = result^initial ‒ result^recollected

본 연구에서 cutoff HI 값은 위 공식 1과 2의 변수 y에 standard deviation (SD) 값을 대입하여 구하였다.

Cutoff HI = SD × 1 (1SD) 값에 해당하는 ΔResult를 유발하는 ΔHI + 정상 검체의 HI 값(HI median)

연구를 위해 사용된 SD는 다음과 같다.: 1) International Federation of Clinical Chemistry에서 권장하는 참고치에서 산출한 SD ([upper limit – lower limit] / 4); 2)본원 내부 정도관리에서 사용한 quality control (QC) 물질 Liquid Assayed Multiqual (Bio-Rad Laboratories Inc.) 중, level 1에서 산출된 SD; 3) level 3 물질에서 산출된 SD–이 세가지 SD 값들을 기준으로 구한 cutoff HI 값을 각각 HI^Ref, HI^QClow 및 HI^QChigh로 명명하였다.

각 검사 항목마다 재채혈 측정에서 얻은 선형회귀직선(best fit line)의 방정식 y = ax + b를 이용하여 cutoff HI를 구하는 과정은 다음과 같다.

ΔResult = a × ΔHI + b

ΔHI = (ΔResult – b) / a

ΔHI^1SD = (1SD – b) / a

Cutoff HI = ΔHI^1SD + HI median

Cutoff HI = (1SD – b) / a + HI median

검사 항목 중 선형회귀직선의 기울기(slope) a가 음수인 경우(용혈이 심할수록 결과값이 감소하는 경우), 결과값 사이의 음의 상관관계를 보이므로 cutoff HI 공식에서 1SD 대신에 –1SD (SD × (–1))을 취하였다.

Roche사의 cobas^Ⓡ c702 장비의 검사는 연구기간 동안 내부정도관리를 통한 안정적인 조건에서 진행했다.

4.데이터 분석

임상 검사 항목별 용혈 전ㆍ후의 차이에 대한 통계적 유의성을 알아보기 위해 paired t-test를 이용하여 분석하였고, 상관계수(correlation coefficient)를 구하기 위해 Pearson의 상관분석을 실행하였으며, 선형회귀분석(linear regression)을 통해 R² (결정계수)값을 구하였다. X축은 ΔHI를 나타내고 Y축은 ΔResult를 나타낸다. 세 종류의 SD를 이용하여 cutoff HI를 구하여 이 중 적합한 허용 HI를 선택한 후 cobas^Ⓡ c702 장비의 cut-off HI를 비교하였다. 결과 자료는 mean±SD로 나타내었다. 통계분석은 Microsoft Excel 2016 (Microsoft)을 이용하여 분석하였고, 통계적 유의수준(P-value)는 0.05를 기준으로 하였다.

1.용혈로 의한 검체의 paired t-test 평가, 용혈 검체에서 HI와 검사 결과의 상관성 비교

총 215 검체를 연구한 결과는 Table 3과 같다. 용혈 유무에 따른 검체간 비교에서, 유의한 차이를 보인 항목은 alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), amylase (Amy), D-bil, total bilirubin (T-bil), creatine phosphokinase (CK), gamma-glutamyl transferase (GGT), iron, potassium (K), LDH, magnesium (Mg), phosphorus (Phos), total protein (TP), uric acid (UA)였다(P<0.05, Table 3). 양의 상관관계는 ALT, AST, calcium (CA), CK, iron, K, LDH, lipase (Lip), Mg, Phos, TP 항목이었고(0<기울기 (A)<1) (Figure 1), 음의 상관관계는 albumin (ALB), ALP, Amy, D-bil, T-bil, cholesterol (Chol), creatinine (Crea), GGT, glucose (Glu), triglyceride (TG), UA, blood urea nitrogen (BUN)이 있다(기울기 (A)<0) (Figure 2). ΔHI와 ΔResult의 상관성은 LDH, K, iron, AST, CK, GGT, TP, Amy, Phos 순으로 높았다(Table 3).

Table 3

The comparison of hemolysis influence’s results on analytes

Analyte	ΔResult*	Best fit line or curve equation			Coefficient of determination
		a	b		R2-value	P-value†
ALB	0.16±3.92	‒0.001	0.360		0.001	0.598
ALP	‒3.59±11.51***	‒0.012	‒0.867		0.029	0.013*
ALT	1.34±8.22**	0.006	0.094		0.014	0.089
Amy	‒10.45±15.84***	‒0.029	‒3.952		0.086	<0.001***
AST	23.22±33.70***	0.098	1.401		0.214	<0.001***
D-bil	‒0.26±0.23***	‒0.089	0.204		0.074	0.031*
T-bil	‒0.06±0.22***	‒0.00002	‒0.053		0.0003	0.818
CA	‒0.04±0.36	0.00021	‒0.092		0.009	0.589
Chol	‒4.0±12.27	‒0.015	‒0.607		0.039	<0.001***
CK	29.74±49.07***	0.137	‒0.754		0.197	<0.001***
Crea	‒0.01±0.21	‒0.000081	0.007		0.004	0.373
GGT	‒9.31±13.79***	‒0.036	‒1.438		0.166	<0.001***
Glu	‒1.43±25.29	‒0.021	3.145		0.017	0.059
Iron	11.56±15.45***	0.047	1.056		0.236	<0.001***
K	0.88±1.22***	0.004	‒0.072		0.345	<0.001***
LDH	260.06±245.28***	1.244	‒15.986		0.646	<0.001***
Lip	0.26±33.81	0.023	‒5.287		0.011	0.121
Mg	0.04±0.13***	0.0002	0.003		0.046	0.001**
Phos	0.28±0.67***	0.001	0.008		0.082	<0.001***
TP	0.15±0.45***	0.0009	‒0.061		0.112	<0.001***
TG	‒2.58±20.00	‒0.029	3.786		0.052	0.010*
UA	‒0.15±0.60***	‒0.0008	0.035		0.049	0.001**
BUN	0.13±4.07	‒0.003	0.738		0.011	0.125

Mean±SD.

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. *P-values were calculated by paired t-test. ^†P-values were calculated by linear regression analysis.

Abbreviations: ALB, albumin; ALP, alkaline phosphatase; ALT, alanine aminotransferase; Amy, amylase; AST, asparate aminotransferase; D-bil, direct bilirubin; T-bil, total bilirubin; CA, calcium; Chol, cholesterol; CK, creatine phosphokinase; Crea, creatinine; GGT, γ-glutamyltransferase; Glu, glucose; K, potassium; LDH, lactate dehydrogenase; Lip, lipase; Mg, magnesium; Phos, phosphorus; TP, total protein; TG, triglyceride; UA, uric acid; BUN, blood urea nitrogen.

Fig. 1. Scatter plot of between ΔHI (hemolyzed sample–recollected sample) and ΔResult (hemolyzed sample–recellected sample) through Linear Regression Analysis. The regression line is linear for analytes of a positive effect. Regression line equation, regression coefficient value and coefficient of determination are shown in the figure.
Abbreviations: HI, hemolysis index; LDH, lactate dehydrogenase; AST, asparate aminotransferase; CK, creatine phosphokinase; K, potassium; MG, magnesium; Phos, phosphorus; TP, total protein; CA, calcium; ALT, alanine aminotransferase.

Fig. 2. Scatter plot of between ΔHI (hemolyzed sample–recollected sample) and ΔResult (hemolyzed sample–recollected sample) through Linear Regression Analysis. The regression line is linear for analytes of a negative effect. Regression line equation, regression coefficient value and coefficient of determination are shown in the figure.
Abbreviations: HI, hemolysis index; GGT, γ-glutamyltransferase; TG, triglyceride; ALB, albumin; BUN, blood urea nitrogen; T-bil, total bilirubin; ALP, alkaline phosphatase; D-bil, direct bilirubin.

2.허용 SD를 이용해 cutoff HI를 구하여 제조사의 cut-off HI와 비교

항목별 참고치의 허용 SD를 이용해 구한 cutoff HI를 HI^Ref, Bio-rad의 QC low 물질의 허용 SD를 이용하여 알아낸 cutoff HI를 HI^QClow, QC high 물질의 허용 SD를 이용하여 구한 cutoff HI를 HI^QChigh로 정하고 구하였다. 위 세 가지 허용 SD 중에서 QC high 허용 SD를 기준으로 하는 HI^QChigh가 적합한 허용 HI로 판단하여 cobas^Ⓡ c702 장비에서 제시한 cut-off HI와 비교하였다.

이를 바탕으로 HI≤50 에서는 AST, D-bil, GGT, LDH, K이며 HI 51∼100은 iron이었다. HI 101∼200은 Amy, CK, Phos, TP이며 HI 201∼300에서는 Chol, TG가 있었다. HI 301∼500은 UA, Glu이며 HI 501∼1,000에서는 ALB, ALP, ALT, Lip, Mg, BUN이 있다. HI>1,000은 CA, Crea, T-bil이 있었다.

AST, D-bil, CK, LDH, BUN는 Roche cut-off HI와 비슷한 HI로 나왔지만 ALB, Amy, Chol, GGT, Glu, iron, Lip, Mg, Phos, TP, TG, UA는 Roche cut-off HI에 비해서 낮게 나왔으며 특히 Amy, GGT, iron, K, Phos, TP은 HI<200에서 영향을 받는 것으로 나왔다. ALP, ALT, T-bil, CA, Crea은 Roche사의 HI에 비해 높게 나왔는데 특히 ALP, ALT는 Roche사의 cut-off HI에서는 HI<200이었지만, 본 연구 결과에서는 허용 HI가 HI>500으로 나왔다.

본 연구는 용혈 간섭에 의해 영향을 받는 항목과 간섭 정도를 파악하고, 자체적으로 ±1SD를 허용 기준으로 하여 cutoff HI를 구하고 그 중 허용 HI를 정하여 제조사에서 제공하는 cut-off HI를 비교 평가하였다. 검사에 영향을 받는 항목은 총 23항목 중에서 paired t-test를 통해 ALB, CA, Chol, Crea, Glu, Lip, TG, BUN을 제외한 항목에서 유의미한 간섭이 있었다(P<0.05). 선형회귀분석을 통해 양의 상관관계가 있는 항목은 ALT, AST, CA, CK, iron, K, LDH, Lip, Mg, Phos, TP 항목이었고(Figure 1), 음의 상관관계가 있는 항목은 ALB, ALP, Amy, D-bil, T-bil, Chol, Crea, GGT, Glu, TG, UA, BUN이 있었다(Figure 2).

참고치, QC low, QC high 물질의 SD를 이용하여 구한 cutoff HI를 각각 HI^Ref, HI^QClow 및 HI^QChigh 로 정한 후 주어진 공식을 이용해 구했을 때 참고치 SD는 성별에 따른 참고치가 다른 항목도 있으며 다른 두 SD에 비해서 큰 만큼 cutoff HI가 높은 값으로 나와 용혈 정도를 제대로 반영하지 못하였으며 QC low물질의 SD는 몇몇 항목에서는 지수가 음수로 나오기도 하였으며 연구 데이터를 비교했을 때 영향이 없는 지수가 나온 항목도 있었다. 그러나 QC high 물질의 SD를 이용한 HI^QChigh는 연구 데이터를 적절하게 반영한 만큼 HI^QChigh를 적합한 허용 HI로 생각된다.

AST, D-bil, CK, LDH는 허용 HI와 Roche사의 cut-off HI가 비슷하였으며(Table 4), iron, Phos, TP, GGT, Amy 항목들은 HI<200에서 영향을 받는다고 결과가 나온 만큼 용혈에 직접적으로 영향을 받아 간섭효과가 있다고 할 수 있다. 추가 검정에서 paired t-test에서 유의미한 결과가 없었던(P>0.05) ALB, Chol, TG 항목은 HI>200부터 용혈에 영향을 받는다고 나왔으며 허용 HI도 각각 508.9, 274.3, 278.7이었다. 따라서 HI>200에서는 재채혈을 권장하여 용혈과 관련 없는 검사 항목까지도 영향을 받는 일은 없어야 할 것이다. 그리고 Roche사의 index 연구 방법은 희석을 이용한 삼투압 충격법으로 검사시 간접(indirect)법으로 진행되는 전해질 검사에 이중희석(double-dilution) 효과로 작용하는 만큼 본 연구 결과의 정확성이 높다고 판단된다. Amy, GGT, D-bil은 음의 상관관계가 뚜렷하게 나타났으며 특히, D-bil (HI>100, 측정치 <0.35 mg/dL), GGT (HI>200, 측정치 <25 U/L) 검체들 중에는 용혈로 인해 측정치가 (–)인 결과도 있었으며 간 기능 검사에 기본 검사이자 필수적인 검사인 ALP, ALT의 경우 Roche사의 cut-off HI에서는 용혈에 영향을 받는 정도가 큰 정도의 지수였지만 허용 HI가 >500의 본 연구의 결과와는 차이가 있는 만큼 추가적인 논의가 필요하다(Table 4). 그리고 검체들 중 결과값이 높아서 희석이 들어간 경우 용혈로 인한 상관관계는 명확하게 나타나지는 않았다.

Table 4

The comparison the acceptable HI with Roche’s cut-off HI

Analyte	SD×1				Cutoff HIa) for sample acceptance
	Reference interval	QC low	QC high		HIRef	HIQClow	HIQChigh	HIRoche
ALB	0.5	0.09	0.09		966.4	508.9	508.9	1,000
ALP	22.3	1.3	8.12		1,748.8	40.7	597.8	200b)
ALT	10.3	1.05	3.48		1,753.9	179.3	595.2	90b)
Amy	20.5	1.55	9.47		572.7	‒75.1	195.6	500a)
AST	10	1.37	4.81		94.4	12.5	41.7	40c)
D-bil	0.07	0.01	0.08		28.7	28.0	31.2	25c)
T-bil	0.3	0.02	0.14		10,888.6	‒1,461.5	3,831.4	800b)
CA	0.4	0.13	0.25		2,310.7	1,045.3	1,607.7	1,000
Chol	50	2.56	4.54		2,980.2	156.5	274.3	700
CK	67.3	2.15	13.67		501.8	28.1	111.9	100c)
Crea	0.13	0.03	0.16		1,629.2	458.2	2,060.6	1,000
GGT	17.8	0.8	2.75		466.7	‒11.0	44.0	200a)
Glu	8.8	1.11	6.04		584.2	213.5	452.7	1,000
Iron	40	1.68	4.27		830.1	20.2	74.9	200a)
K	0.38	0.07	0.08		111.2	40	42.4	90a)
LDH	22.5	2.95	9.12		37.9	22.2	27.2	15c)
Lip	11.8	0.88	6.94		759.1	279.3	546.8	1,000
Mg	0.2	0.03	0.09		1,167.4	168.8	521.2	800a)
Phos	0.5	0.09	0.16		414.8	75.3	133.3	300a)
TP	0.53	0.09	0.11		627.4	167.1	188.3	500a)
TG	50	2.7	4.01		1,881.4	233.0	278.7	700
UA	0.9	0.09	0.24		1,132.5	157.5	338.1	1,000a)
BUN	3.5	0.37	1.78		1,572.2	416.3	937.0	1,000

^a)The big decrease HI^QChigh compared to HI^Roche. ^b)The big increase HI^QChigh compared to HI^Roche among analytes which show significant results in the paired t-test. ^c)The similar HI^QChigh compared to HI^Roche.

Abbreviations: QC, quality control; HI, hemolysis index; ALB, albumin; ALP, alkaline phosphatase; ALT, alanine aminotransferase; Amy, amylase; AST, asparate aminotransferase; D-bil, direct bilirubin; T-bil, total bilirubin; CA, calcium; Chol, cholesterol; CK, creatine phosphokinase; Crea, creatinine; GGT, γ-glutamyltransferase; Glu, glucose; K, potassium; LDH, lactate dehydrogenase; Lip, lipase; Mg, magnesium; Phos, phosphorus; TP, total protein; TG, triglyceride; UA, uric acid; BUN, blood urea nitrogen.

용혈지수와 결과값 사이의 상관성은 LDH, K, iron, AST, CK, GGT 순서로 나타났고(Table 3), 허용 HI의 최저값은 LDH 27.2로 다음으로 D-bil 31.2, AST 41.7, K 42.4, GGT 44.0, iron 74.9, CK 111.9 (Table 4)로 D-bil을 제외한 나머지 항목들에서는 상관계수와 허용 HI는 연관성이 높게 나타났다. 그러나, D-bil의 경우 HI가 Roche사의 cut-off HI는 25, 본 연구의 허용 HI는 31.2 (Table 4)인 만큼 경미한 용혈에도 영향을 받는 항목이 맞지만 용혈이 증가하더라도 용혈 전·후의 결과 차이가 크지 않고 선형으로 나타난 다른 항목들과 다르게 로그함수 그래프로 나타났다(Figure 2).

용혈로 인해 검체 데이터에 영향을 미치는 기전은 크게 네 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째, AST, K, LDH의 임상 검사 항목들은 세포내액의 농도가 세포외액의 농도보다 높아서 용혈이 되면 세포 내의 물질이 세포 외로 방출되면서 높게 측정된다. LDH 같은 경우 용혈의 영향이 가장 크다고 알려 졌으며[16] 본 연구에서도 용혈 전ㆍ후 결과가 400%까지 높게 측정되기도 했다. 그리고 본 연구에서 양의 상관관계가 있었던 항목들 중에 Mg, TP, Phos 항목에서 양의 상관관계가 나타난 이유는 세포내(intracelluar)에서 혈장보다 높은 농도로 있기 때문에 나타나며 실질적으로 세포내액과 세포외액의 구성 비율에 따라 영향을 미치는 정도가 HI로 나타났다. 두 번째, 화학적 간섭(chemical inteference) 효과로 CK의 경우 적혈구로부터 나온 물질(adenylate kinase)이 검사 물질들과 간섭 효과로 작용하여 높게 측정된다. 그러나 bilirubin의 경우 pseudo-peroxidase의 활성을 가진 유리 헤모글로빈이 diazonium색 형성을 방해함으로써 반응을 저해하며 특히 D-bil의 경우 Roche사는 cut-off HI가 25였으며 본 연구에서는 허용 HI가 31인만큼 큰 영향을 받는다고 알 수 있다[17]. 세 번째, 용혈시 방출된 물질인 유리 헤모글로빈과 검사 항목과의 파장이 겹쳐서 분광 간섭이 발생한다. 관련 검사 항목에는 ALP, GGT, Lip, ALB 등의 검사 항목이 해당하는데 본 연구에서는 ALP, GGT만 영향을 받는다고 나왔으며[18], 추가적으로 본 연구에서는 Amy도 파장으로 인해 음의 상관관계를 보였으며 허용 HI도 195.6으로 영향을 받는다고 나왔다. Iron은 적혈구에서 용혈시 방출되어 양의 상관관계가 나타나지만 측정 파장이 겹치는 음의 상관관계도 같이 간섭 효과로 작용하기 때문에 다른 세포내액이 용혈시 방출되어 간섭 효과를 나타내는 정도가 다른 항목들에 비해 약했으며 허용 HI는 74.9로 나타났다. 그리고 네 번째 dilution 효과로 위에 언급한 첫 번째 기전과는 반대로 세포내액의 양이 세포외액보다 낮아서 용혈 후 마치 dilution된 것처럼 간섭 효과가 발생하며 영향을 받는 인자는 Glu가 있는데 본 연구에서는 통계적으로 유의미한 결과는 없었다[6]. 그리고 과산화수소(hydrogen peroxidase)의 헤모글로빈 분해로 인한 간섭 효과로 Chol, UA가 영향을 받지만 이번 연구에서는 허용 HI가 두 항목 모두 250 이상으로 다른 기전에 비해서 큰 영향을 미치지는 않았다[11].

지금까지 용혈에 대한 연구 및 관련 데이터들은 연구마다 간섭 받는 항목, 영향 정도 등이 다르게 보고되었는데[10, 11], 이유는 용혈의 정의, 용혈 검체를 대상으로 하는 연구방법 및 분석기의 측정 원리와 방식에 따라 발생했다. 연구 초기에 용혈의 정의는 단순히 적혈구가 깨져서 생기는 것만을 용혈로 간주하여 원심 후 분리된 적혈구만을 가지고 연구를 진행하였는데[19, 20], 점차 여러 연구자들에 의해 용혈에 대한 개념이 재정립되기 시작했다[1, 2]. 즉 채혈 과정에서 생기는 간섭 요인인 만큼 적혈구가 깨져서 헤모글로빈이 방출되는 것만을 용혈로 보기 보다는 백혈구, 혈소판의 세포 성분의 방출로 인한 용혈 영향 정도도 배제해서는 안 된다고 하였고 이후 검체 처리를 위한 적절한 지침이 발표되었다[21, 22]. 지금까지 Roche사의 장비에 설정된 cut-off HI는 적혈구만 이용한 삼투압 충격법을 사용하여[12, 19, 20] 지수를 설정하였는데 결과 데이터에 미치는 영향 및 중요성으로 보아 용혈지수에 관한 추가적인 연구의 필요성이 제기된다.

최근 Marques-Garcia [6]의 연구에 따르면 지금까지 용혈과 관련된 연구 방법에는 용혈 세포의 기준 및 dilution 유무에 따라 freezing-thawing, 삼투압 충격법, shear stress가 있다. 현재는 2019년 Delgado 등[14]의 연구 방법으로 사용되었던 freezing-thawing 방법이 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 모두 용혈시키며 다른 두 방법에 비해 용혈 검체를 만드는 과정이 간단하며 상대적으로 변동성이 낮아서 예측 가능한 용혈 정도를 만들 수 있기 때문에 세 가지 방법 중에서 용혈 연구에 가장 적합하다고 하였다. 그러나 본 연구 방법은 채혈 과정에서 발생하는 용혈과 같은 조건에서 영향 받는 정도를 알아보기 위해 shear stress 방법을 바탕으로 하여 용혈 정도를 만들기 위해 검체 희석 및 혈청, 혈장을 첨가하는 등의 추가적인 과정은 하지 않고 검사 전 단계에서 발생하는 용혈로 인한 검체 처리 및 재채혈 과정을 임상에서 발생하는 상황과 같이 진행하였을 뿐만 아니라 검사실에서 사용되는 세 가지 SD를 이용하여 연구를 하였기 때문에 임상에 활용될 수 있는 연구 결과로 생각된다.

현재 임상에서는 육안 판독 및 장비의 HI 측정을 통해 용혈 검체를 확인한다. 하지만 육안 판독은 장비에서 측정하는 혈청 지수에 비해서 객관적이지 않다. 그럼에도 불구하고 육안 판독을 통해 HI가 200정도의 심한 용혈은 쉽게 구별할 수 있기 때문에 본 연구 결과를 바탕으로 재채혈을 제언하였던 HI>200부터는 육안 판독을 통해 확인하여 빠르게 재채혈할 수 있게 절차 및 검사자의 업무 능력이 필요하다고 생각된다.

최근 일치화에 활발한 Australasian Association for Clinical Biochemistry의 the Royal College of Pathologists of Australasia Quality Assurance Program survey에서는 혈청 헤모글로빈 농도가 100 mg/dL에서 500 mg/dL 사이에서 용혈의 기준값을 정한 기관이 48%였지만, 50 mg/dL을 기준값으로 설정한 기관은 91개의 기관 중에서 단 한 기관 밖에 없었다[23]. 하지만 Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) 가이드라인 C56-A에서 용혈은 50 mg/dL에서 유의한 차이가 보인다고 기술되어 있고[22], 본 연구에서도 HI가 ≤100에서 AST, D-bil, GGT, iron, LDH, K가 영향을 많이 받는 만큼 CLSI 가이드라인을 권장한다.

지금까지 다양한 연구를 통해 용혈로 인해 생기는 간섭으로 영향 받는 항목 및 영향 정도를 발표 하였으며 Pyo 등[23], Won 등[24]의 연구에 따르면 헤모글로빈의 연구와 검사 결과를 이용한 보정식을 만들었지만 임상에서 적극적으로 활용되지 않고 있다[25]. 하지만 병리 생태학적 요인(in vivo)으로 인해 발생하는 용혈, 재채혈이 어려운 환자(소아, 응급환자)에는 보다 적극적으로 활용하기를 제안했다[9, 26, 27].

본 연구의 제한점은 첫 채혈과 재채혈 사이의 대상자의 상태 변화에 대해서는 적극적으로 제한하지는 못하였다. 다만, 식이 및 약물 등 검체 결과에 영향을 미칠 수 있는 여러 외부 요인들의 유무 확인 후 진행했다.

결론적으로, cobas^Ⓡ c702의 cut-off HI를 HI^QChigh와 비교했을 때 AST, D-bil, CK, LDH는 비슷했지만 Amy, GGT, K, iron, Phos, TP은 장비의 cut-off HI보다 낮게 ALP, ALT는 높게 나왔다(Figure 3). 용혈과 결과값 사이의 상관 관계가 없는 ALB, Chol, TG 항목에서 HI>200에서는 유의미한 결과가 나왔기 때문에 재채혈하는 것이 바람직하다고 생각된다. 그리고 HI≤100에서 다수의 항목들이 영향을 받는 만큼 약한 용혈이 나타나는 HI>50부터 용혈 기준을 설정하는 것을 권장한다.

Fig. 3. The comparison of HI between the obtained HI^QChigh from our study and Roche’s cut-off HI recommendation. ALP, ALT, Amy, GGT, iron, K, TP, and UA show a fairly big difference compared to Roche.
Abbreviations: HI, hemolysis index; ALP, alkaline phosphatase; ALT, alanine aminotransferase; Amy, amylase; AST, asparate aminotransferase; D-bil, direct bilirubin; CK, creatine phosphokinase; GGT, γ-glutamyltransferase; K, potassium; LDH, lactate dehydrogenase; Mg, magnesium; Phos, phosphorus; TP, total protein; UA, uric acid.

본 연구는 용혈의 영향과 허용 hemolysis index (HI)를 조사하기 위해 용혈된 검체와 재채혈된 검체의 결과를 비교하였다. 용혈 전ㆍ후, alkaline phosphatase (ALP), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), amylase (Amy), direct bilirubin (D-bil), total bilirubin (T-bil), creatine phosphokinase (CK), gamma glutamyl transferase (GGT), iron, potassium (K), lactate dehydrogenase (LDH), magnesium (Mg), phosphorus (Phos), total protein (TP), uric acid (UA) 항목에서 유의미한 결과를 보였다. LDH, K, iron, AST, CK, GGT, TP, Amy, Phos는 용혈 정도와 결과 사이에 높은 상관관계가 있었다. Quality control (QC) high standard deviation (SD)을 이용하여 구한 허용 HI, HI^QChigh를 비교했을 때 AST, D-bil, CK, LDH는 비슷했지만 Amy, GGT, K, iron, Phos, TP는 장비의 cut-off HI보다 낮은 HI에서부터 영향 받았으며 ALP, ALT는 높게 나왔다. 그리고 paired t-test를 통해 유의미한 결과가 없었던 albumin, cholesterol, triglyceride 항목에서도 HI>200에서는 유의미한 결과가 나왔기 때문에 재채혈하는 것이 바람직하다고 생각되며 HI<100일 때 영향을 받는 항목들이 있었던 연구 결과를 기반하여 약한 용혈이 나타나는 HI>50부터 용혈 기준을 설정하는 것을 권장한다.

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Kim HB, Clinical laboratory technologist; Won DI, Professor; Son KA, Clinical laboratory technologist; Kim JM, Clinical laboratory technologist; Woo YJ, Clinical laboratory technologist.

-Conceptualization: Kim HB, Won DI.

-Data curation: Kim HB, Won DI, Son KA.

-Formal analysis: Kim HB, Kim JM.

-Methodology: Kim HB, Won DI, Son KA.

-Software: Kim JM, Son KA.

-Validation: Kim HB, Won DI.

-Investigation: Woo YJ, Kim HB, Kim JM.

-Writing - original draft: Kim HB, Son KA.

-Writing - review & editing: Won DI, Kim HB, Son KA, Kim JM, Woo YJ.

All procedures were performed in accordance with approved by Kyungpook National University Hospital (Department of Laboratory Medicine).