2021년에 발표된 중앙암등록본부 자료에 의하면 2021년에 우리나라에서 발생한 폐암은 남녀를 합쳐서 28,628건, 전체 암 발생의 11.8%로 2위를 차지했다. 남녀의 성비는 2.1:1로 남자에게 더 많이 발생하였으며 발생 건수는 남자가 20,331건으로 남성의 암 중에서 1위를 차지하였고, 여자는 9,629건으로 여성의 암 중 5위였다. 또 다른 특징은 남성의 경우 증가폭이 조금씩 감소하고 있지만 여성의 경우 최근에 연평균 3.2%씩 증가하고 있는 추세다[1].

폐암은 흡연이 주된 원인으로 보고되어 왔으며, 담배는 약 7,000종의 유해물질이 함유되어 있는데, 이 가운데 발암 물질로 알려진 것이 60여 종 이상이다. 흡연을 하면 흡연을 하지 않는 사람에 비해 폐암에 걸릴 위험이 11배 증가하며 흡연하는 담배 수와 흡연 기간, 흡연 시작 연령과 비례하여 폐암의 위험이 증가한다. 한국인 폐암의 69.8%가 직접 흡연자였으며 흡연율이 높은 미국과 유럽 연합에서 남성 폐암의 90%이상, 여성 폐암의 74%∼80%를 차지하는 것으로 나타났다[2-5].

폐암은 크게 소세포성폐암(small cell carcinoma)과 비소세포성 폐암(non-small cell carcinoma)으로 구분된다. 국제 암 연구기관의 폐암 데이터를 살펴보면 소세포성폐암에 비해 비소세포성 폐암이 차지하는 비율이 약 70∼80%로 더 높다. 비소세포성 폐암 중 폐편평상피암(lung squamous cell carcinoma)에서는 남성이 여성보다 많으며 폐선암(lung adenocarcinoma)에서는 여성이 남성보다 발생 비율이 높다[6]. 게다가 폐암은 생존율이 매우 낮은 암으로, 일반적으로 초기 단계에서는 징후와 증상이 나타나지 않는다. 따라서 폐암이 발견되고 난 후 5년 생존율은 18.6%로 다른 대장암(64.5%), 유방암(89.6%), 전립선암(98.2%)과 같은 다른 주요 암 부위보다 낮다. 우리나라의 경우도 남녀 모두의 5년 생존율은 20% 정도로 매우 낮은 것으로 나타났다[7].

하지만 최근에 유전자 프로파일링 기술이 발전하면서 종양의 발생 및 성장에 중요한 종양 유전자와 종양 억제 유전자의 변이에 대한 연구가 활발히 진행되어, 폐암을 유발하는 특정 유전자들이 발견되면서 생존율에 큰 영향을 미치게 되었다[8]. 기존에 사용되었던 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 형광제자리부합법(fluorescence in situ hybridiation, FISH), 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)검사 방법과는 다르게 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing, NGS)은 단일 테스트에서 표적 디옥시리보헥산(deoxyribonucleic acid, DNA)의 위치나 전체 엑솜, 전체 게놈의 염기서열을 분석하여 점 돌연변이나 염기의 삽입·결실·융합·전위·복제수변이(copy number variation, CNV) 등을 동시에 식별할 수 있다. 이러한 NGS 결과에 따른 유전적 변이의 확인은 개인화된 표적 치료로 이어져 생존율에 큰 영향을 줄 수 있다. 특히 폐선암은 NGS를 이용한 동반진단을 통해 맞춤 의학으로 생존율에 도움을 얻을 수 있다[9, 10]. 특히 폐선암 driver oncogene인 epidermal growth factor receptor (EGFR) 유전자 변이는 EGFR tyrosine kinase inhibitor (TKI) 치료에 반응을 보이며 상당한 생존율을 나타낸 것으로 나타났다[11]. 또한 anaplastic lymphoma kinase (ALK)와 receptor tyrosine kinase 1 (ROS1)도 ALK TKI 치료로 더 나은 생존율을 나타냄이 보고되었다[11]. 따라서 NGS와 같은 분자적 검사기법으로 확인된 폐암 환자의 적절한 표적 치료에 대한 반응률은 그렇지 않은 환자 집단의 반응률(20%∼30%)에 비해 높은 반응률(60%∼70%)을 나타내었다[12].

따라서 각 환자의 유전자 돌연변이 패턴을 분석하여 표적 치료에 적용하는 환자의 생존률에 도움을 주는 유전자 검사가 반드시 필요하다. 최근 포르말린 고정 파라핀 포매 조직(formalin- fixed paraffin-embedded, FFPE)을 이용하여 유전자 염기서열을 빠르게 분석할 수 있는 NGS는 많은 표적 유전자에 대해 빠르고 효율적으로 염기서열을 분석하여 환자의 표적 치료에 이용되고 있다[13].

이에 본 연구는 2018년에서 2020년 사이에 폐선암으로 진단을 받은 환자 83명을 NGS를 통해 두 종양 조직에서 단일염기서열변이(single nucleotide variation, SNV), CNV, 구조적 변화(structural variation)등 한국인의 최신 유전자 변이를 검출하였으며, 기존 진단에 사용되고 있는 유전자 변이 검출 기법인 PCR, FISH, IHC염색법을 수행하였고 NGS 결과와 일치도를 분석하여 폐선암 환자의 돌연변이 유전자 검출을 위한 NGS의 유용성을 평가하였다.

1. 임상검체 및 환자 데이터 수집

2018∼2020년 한양대학교병원 내원 환자 중 폐선암으로 진단을 받은 환자 83명을 대상으로 절제 또는 생검 조직을 이용하여 제작된 병리과의 FFPE를 이용하였다.

모든 환자는 사전에 진단을 위한 다양한 검사와 유전자 검사를 위해 검사 동의서에 서명한 환자를 대상으로 진료에 사용된 기록을 이용하여 데이터를 수집하였으며, 모든 환자 개인정보는 인식할 수 없도록 암호화하여 한양대학교병원에서 연구윤리심의위원회의 생명윤리에 대한 승인을 받았다(IRB approval number: HYUH 2022-03-030-001).

2. Hematoxylin and eosin 염색

조직의 분화패턴을 확인하여 폐선암을 구분하기 위해 hematoxylin and eosin (H&E)염색이 수행되었다. 박절기를 이용하여 4 μm으로 자른 FFPE 절편을 슬라이드에 부착시키고 62℃ 신전기에서 30분간 파라핀을 녹인 후 자일렌으로 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80% 50% 단계적으로 알코올을 차례로 거치며 함수하고 물로 세척을 하였다. 이후 hematoxylin (DAKO, Santa Clara, CA, USA)에 5분간 핵을 염색하였다. 이후 물로 세척한 뒤 bluing buffer (DAKO)에서 청색화 과정을 거친 후 eosin (DAKO)에 세포질을 염색하였다. 이 후 50%, 80%, 95% 100% 에틸알코올을 차례로 거치며 탈수시키고 자일렌에 투명과정을 거친 후 봉입하여 현미경으로 검경하였다. 폐암 조직의 분화패턴과 형태학적 기준을 바탕으로 고분화(well differentiation), 중등도 분화(moderately differentiation), 저분화(poorly differentiation)를 구분하였다.

3. 면역조직화학(immunohistochemistry)염색

정확한 폐선암의 분류를 위해서 IHC염색을 수행하였다. 4 μm로 자른 FFPE는 Bond max III (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) 와 Benchmark automatic immunostaining device (Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA)을 사용하여 염색하였다. 박절기(microtome)를 이용하여 4 μm로 자른 후 슬라이드에 부착하여 62℃ 신전기에서 30분간 여분의 파라핀을 녹인 후 자일렌으로 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 75% 단계적 알코올을 차례로 거치며 함수시켰다. 증류수로 세척한 후, 3% 과산화수소수에서 15분간 반응시켜 내인성 과산화효소를 억제하였다. 차단 항체액 100 μL를 조직에 가한 후 실온에서 30분간 반응시킨 후, 1차 항체를 희석하여 상온에서 반응시켰다. pH 7.6 Tris-HCl buffer 로 세척한 후, biotinylated link 항체(LSAB kit; DAKO) 100 μL를 30 분간 실온에서 반응시키고 pH 7.6 Tris-HCl buffer로 세척하였다. 그 후, peroxidase-labelled streptoavidin 용액 100 μL를 가한 후 15분간 실온에서 반응시켰다. pH 7.6 Tris-HCl buffer 로 세척한 후, 공기 중에서 건조시키고, hematoxylin 으로 대비염색한 후 퍼마운트(permount; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 봉입하여 현미경으로 판독하였다. IHC염색의 판독은 각 단백질 항원에 대한 IHC염색의 판정은 조직표본을 광학현미경으로 관찰하여 핵과 세포질에 염색되는 범위를 0∼3점(0, none; 1+, ≤10%; 2+, 10 to 25%; 3+,>25%)으로 분류하였다.

4. 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing)

폐선암으로 확인된 암조직을 대상으로 각각의 세포 내 종양을 유발하는 유전자 돌연변이와 새로운 표지자를 발견하기 위해 NGS를 이용하여 유전자 분석을 시행하였다. 먼저 10 μm로 자른 FFPE를 염색이 안 된 슬라이드와 4 μm의 H&E 염색 슬라이드를 준비하였다. H&E 슬라이드 상에서 종양 부위를 유성펜 또는 다이아몬드 펜으로 표기하였다. 다이아몬드 펜을 이용하여 염색하지 않은 슬라이드의 종양 부위에 상응하는 부분을 표기한 후 digestion buffer를 슬라이드 조직에 올려 칼로 긁어 튜브에 넣은 뒤 RecoverAll Multi Sample RNA/DNA Kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 DNA와 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)을 추출하였다. 추출한 DNA의 농도측정은 Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하였으며 RNA 농도측정은 Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 Qubit 4 Fluorometer (hermo Fisher Scientific)로 측정하였다. RNA는 PCR 방법으로 SuperScript Ⅳ VILO Master Mix (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 상보적 DNA (com-plementary DNA, cDNA)을 합성하였다. 그 후 실시간 PCR (real-time PCR) 방법으로 cDNA (TaqMan Reagent Starter Kit, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 와 DNA (TaqMan RNase P Detection Kit; Thermo Fisher Scientific)를 정량하였으며 Ion S5 XL (Thermo Fisher Scientific) 장비로 sequencing을 수행하였다. 그 후 데이터 분석은 Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific)에서 제공하는 The Torrent Mapping Alignment Program과 Torrent Variant calling 알고리즘을 이용하여 생물정보학적 분석을 시행하였다. 결과 해석에 포함되는 Variant calling의 판정기준은 Table 1과 같다.

Table 1

Next generation sequencing variant call criteria

Nucleotide variation	Variant call criteria
SNV/INDEL	VAF: ≥5% in SNV
	5% in INDEL
CNV	Amplification: avg. CNV ≥4 (gain), <1 (loss)
Translocation (fusion gene)	Read counts: ≥20
	Total valid mapped reads: ≥50,000

Abbreviations: SNV/INDEL, single nucleotide variation/small insertions, deletion; VAF, variation allele frequency; CNV, copy number variation.

본 연구의 유전자 돌연변이 평가는 세계에서 가장 널리 사용되는 4등급 평가 시스템(Tier system)을 기반으로 하였으며, 그중에서도 강력한 임상적 중요성(Tier I)이 있거나 잠재적인 임상적 중요성(Tier II)이 있는 유전자 변이만을 선택하여 적용하였다.

5. EGFR 돌연변이 검출을 위한 실시간 중합효소연쇄반응 (EGFR real-time PCR)

NGS 결과의 정확한 분석을 위해서 EGFR real-time PCR 검사를 시행하였으며 정확도와 정밀도를 평가하기 위해 그 결과를 사용하였다. 먼저 10 μm으로 자른 FFPE를 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 농도는 Nano Drop 2000 (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 측정하였다. 그 후 PANA Mutyper^TM R EGFR Kit (Panagene, Dajeon, Korea)을 사용하여 EGFR 돌연변이 유전자형을 검출하였으며 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)로 PCR을 시행하였다. 이때 야생형에 상보적인 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA) 탐침자를 첨가하여 야생형의 증폭을 억제하였으며, 소량의 EGFR 돌연변이만을 선택적으로 증폭하여 분석하였다. Real-time PCR의 과정은 95℃에서 30초간 변성과정, 70℃에서 PNA clamping 과정을 20초간 거친 뒤 63℃에서 1분간 annealing 과정을 15회 수행하였다. 그 후 95℃에서 10초간 변성과정, 53℃에서 20초간 annealing과 detection 과정, 73℃에서 20초간 연장과정을 35회 수행하여 증폭시켰다. 이 결과를 토대로 동일한 임상검체에서 수행된 NGS 결과와 비교하였다.

6. FISH–ROS1

NGS 결과의 정확한 분석을 위해서 FISH-ROS1 검사를 시행하였으며 일치도를 평가하기 위해 수행되었다.

1∼2 μm으로 자른 FFPE 2장을 준비하여 슬라이드에 부착하고 공기 중에서 건조시켰다. 하나의 검체 슬라이드를 이용하여 H&E 염색을 수행하고 H&E 슬라이드에 종양 부위를 유성펜 또는 다이아몬드 칼로 표기하였다. 다이아몬드 칼을 이용하여 염색하지 않은 슬라이드에 종양부위와 상응하는 부분에 표기를 한 후 Hybrite (Bimedis, Osceola, Olando, USA) 56∼60℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 그 후, 자일렌에서 5분, 2회 탈파라핀 하였으며, 자일렌 제거를 위해 100% 에틸알코올에서 5분간 3회 처리하였으며 5분간 실온 건조하였다. 다음 80℃ 전처리 용액에서 30분간 반응시키고 증류수(distilled water, DW)에서 2분, 2회 수세한 후 paper towel로 물기를 제거하였다. 다음으로 ZytoLight SPEC ROS1 Dual Color Break Apart Probe (Zytovision, Bremerhaven, Germany)이용하여 FISH-ROS1 검사를 시행하였다. 37℃에 슬라이드를 올리고 pepsin solution을 떨어뜨린 후 16분 동안 반응시켰다. 그 후 1% formal-dehyde solution을 실온에서 5분간 처리한 후 wash buffer saline-sodium citrate를 실온에서 5분간 처리하였고 DW에 1분간 수세하였다. 슬라이드를 70%, 85%, 100% 에틸알코올에 순차적으로 처리하여 탈수한 후 5분간 실온 건조하였다. 그 후 ROS1 probe를 올리고자 하는 부위를 유성펜으로 슬라이드 뒷면에 표시하고 빛이 차단된 상태에서 ROS1 probe를 cover glass에 약 5 μL 정도 올린 후 잘 덮어주고 paper bond를 이용하여 잘 막아주었다. 이후 슬라이드를 Thermobrite (Leica Biosystems, Barrington, IL, USA)에 올리고 14∼24시간 동안 hybridization한다. 그 후 wash buffer A로 37℃에서 5분간 슬라이드를 2회 washing 한 후 70%, 85%, 100% 에틸알코올에 순차적으로 처리하여 탈수한 후 빛에 노출되지 않게 실온 건조한다. 4′,6-diamidino-2-phenylindole를 이용하여 대조 염색을 시행하였다. 이 probe들의 교잡 target은 ROS1 유전자의 breakpoint의 반대쪽이다. 3’ ROS1 probe는 breakpoint에서 말단 소립쪽으로 교잡되고 약 215 kb이며 SpectriumOrange 형광을 가지고 있다. 5’ ROS1 probe는 breakpoint에서 동원체 쪽으로 교잡되고 약 715 kb이며 SpectrumGreen 형광을 가지고 있다.

FISH-ROS1의 양성기준은 50개의 핵을 통한 시그널 패턴의 수를 기록하여 관찰한 암세포 중 분리된 오렌지와 녹색 시그널의 거리가 시그널 직경 1개 이상인 세포가 15% 이상이거나 관찰한 암세포 중 융합 시그널과 녹색 시그널만 존재하는 세포가 15% 이상인 경우이며, 음성기준은 융합된 시그널만 2개 이상이거나 융합된 시그널 2개 이상에 오렌지 시그널만 1개 이상인 경우로 설정하였다. 만약 50개의 세포 중에서 5개 이하의 세포가 양성(5/50 또는 <10%)일 경우 음성으로 간주한다. 만약 50개의 세포 중에서 25개 이상의 세포가 양성(25/50 또는>50%)일 경우 양성으로 간주한다.

7. IHC-ALK (D5F3)

NGS 결과의 정확한 분석을 위해서 IHC-ALK (D5F3) 검사를 시행하였으며 일치도를 평가하기 위해 수행되었다.

4 μm로 자른 FFPE를 positively-charged glass slide에 부착시킨 후 BenchMArk XT Automated Slide Stainer (Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA)을 사용하여 염색하였다. Optiview DAB IHC Detection Kit 및 Optiview Amplifi-cation Kit (Ventana Medical Systems)가 사용되었으며 Anti- IHC-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody를 이용하여 면역염색을 시행하였다. 결과 해석을 돕기 위해서 Rabbit Monoclonal Negative Control immunoglobulin G (Ventana Medical System)를 사용하여 모든 검체에 일치하는 음성 시약 대조 슬라이드를 제작하였다. 그 후 대조염색으로 핵을 hematoxylin II로 counter stain과 post counter stain을 차례대로 수행하였다. 퍼마운트를 이용하여 봉입하였으며 현미경으로 IHC-ALK (D5F3)염색의 검사 지침에 따라 판독하였다. 각 단백질 항원에 대한 IHC염색의 판정은 조직표본을 광학현미경으로 관찰하여 핵과 세포질에 염색되는 범위를 0∼3점(0, none; 1+, 10%; 2+, 10 to 25%; 3+,>25%)으로 판독하였다.

8. 통계학적 분석

본 연구에서 통계 분석을 위해 SPSS software version 25.0 (IBM, Armonk, NY, USA)를 이용하였다. 흡연과 EGFR 돌연변이 간의, 흡연과 TP53 돌연변이 간의 연관성을 확인하기 위해 교차분석(Pearson’s chi-square test)을 시행하였다. 검사방법에 따른 유전자 돌연변이(EGFR, ALK, ROS) 진단의 일치도 평가를 위해 Cohen’s Kappa coefficient를 계산하였다. 유의확률(P-value)이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

1. Hematoxylin and eosin 염색을 이용한 폐선암 조직의 분류

종양조직으로부터 절제되어 만들어진 FFPE를 H&E 염색을 시행하여 비소세포암의 형태학적 특징을 관찰한 결과 lepidic pattern, acinar pattern, papillary pattern의 특징을 나타내는 분화가 잘 된 종양 조직을 폐선암으로 구분하였다(Figure 1). 그 결과 acinar pattern 27건(32.5%), papillary pattern 9건(10.8%), lepidic pattern 7건(8.4%)으로 나타나 acinar pattern이 가장 많은 분포를 차지하였다.

Fig. 1. Subclassification of non small cell lung cancer using paraffin section hematoxylin & eosin stain (A, C, E: 100x; B, D, F: 200x). (A∼F), well differentiated lung adenocarcinoma (A, B: lepidic pattern, C , D: acinar pattern, E, F: papillary pattern).

2. 폐선암 분류의 민감도와 특이도를 높이기 위한 면역조직화학 (immunohistochemistry)염색

종양 조직이 생검 표본일 경우, 종양세포가 부족하거나 조직이 너무 작아서 종양의 형태학적 특징을 확인하기 어려운 예들은 H&E 염색만으로 종양의 정확한 분류가 어려울 수 있다. 따라서 폐선암의 분류를 위해 IHC 마커인 TTF-1, Napsin A, P40을 1차 항체로 IHC염색 후 이를 구분하였다[14]. TTF-1과 Napsin-A 염색에서 양성반응이 나타나고 P40에서 음성반응이 나타나면 폐선암으로 판별하여 폐선암 구분의 민감도와 특이도를 높였다(Figure 2). 그 결과 비소세포성폐암 중 H&E 염색으로 정확한 분류가 어려웠던 폐선암종 26건(23%)을 IHC염색을 통해 확인하였다.

Fig. 2. Subclassification of lung adenocarcinoma using immuno-histochemical staining (A, C, E: 100x; B, D, F: 200x). Napsin A (+) and TTF-1 (+) are classified as lung adenocarcinoma. P40 (-) are not stained as lung adenocarcinoma carcinoma cells. (A, B) Napsin A (+), (C, D) TTF-1 (+), (E, F) P40 (-).

3. 분화가 불량한 폐선암의 구분을 위한 면역조직화학(immunohistochemistry)염색

폐선암 세포의 분화가 불량한 경우 TTF-1, Napsin A, P40 세 가지 마커의 조합으로 비소세포성폐암 중 폐선암을 정화하게 분류하기 어려워진다. 따라서 추가적으로 CK7과 CK5/6을 통해 폐선암을 구분하였다. 분화가 불량한 폐선암은 P40 염색에서 음성반응이 나타나고 TTF-1, Napsin A 염색 결과 약한 양성반응을 나타냈으나 CK7에서 강한 양성반응이 나타났다(Figure 3). 그 결과 분화가 불량한 폐선암 14건(12.5%)을 추가로 확인하였다.

Fig. 3. Results of H&E staining and immunohistochemistry staining of poorly differentiated lung adenocarcinoma (200×). (A) H&E, (B) Napsin A (weakly +), (C): TTF-1 (weakly +), (D): CK7 (strong +), (E) P40 (-) are classified as lung adenocarcinoma. Abbreviation: H&E, hematoxylin and eosin.

4. 비소세포성폐암 환자의 임상적 특징

전체 폐선암 환자의 임상적 특징에 대하여 알아보고자 폐선암 환자 총 83명을 대상으로 분석하였으며 그 특성은 Table 2와 같이 나타났다. 전체 코호트에는 남성 34명(41%), 여성 49명(59%)이 포함되었다. 흡연자는 1년 이상 흡연경험이 있거나 현재까지 흡연하고 있는 사람을 대상으로 분석하였으며 이들 중 흡연자는 34명(41%)이었으며 비흡연자는 49명(59%)이었다. 폐선암의 발병률은 비흡연자(N=49, 59%)가 흡연자(N=34, 41%)보다 높게 나타났다.

Table 2

Baseline characteristics of analytic patients

Characteristics	Analytic patient (N=83)
Lung adenocarcinoma
Age, yr	65 (40∼89)
Sex
Male	34 (41)
Female	49 (59)
Smoking
Former and current	34 (41)
Never	49 (59)

Data are presented as median (range) or number (%).

5. 폐선암 환자의 단일염기서열변이(single nucleotide variation) 분석

H&E 염색과 IHC 염색 결과 폐선암으로 확진된 환자 총 83건이 NGS로 분석되었다.

검사된 폐선암 83건 중 약 99%에서 적어도 1건의 변이가 관찰되었다. 26개의 유전자에서 총 178개의 SNV에 Missense, Nonsense, In-Frame indels, Frame Shift indels 돌연변이가 존재함을 입증하였으며, 한 환자 당 적게는 1개의 변이가 많게는 7개의 변이가 관찰되었다. 개별 유전자의 돌연변이 수를 환자 수로 나누어 유전자 돌연변이 빈도를 계산한 결과 여성에게서 가장 빈번하게 나타난 돌연변이는 EGFR (30, 61%)과 TP53 (30, 61%)이었으며, PIK3CA (5, 10%), KRAS (3, 6%), POLE (3, 6%), CDKN2A (2, 4%), BRCA2 (2, 4%), BRAF (2, 4%), ARID1A (1, 2%), FGFR4 (1, 2%), IDH (1, 2%), KNSTRN (1, 2%), NOTCH1 (1, 2%), MSH6 (1, 2%), KIT (1, 2%), NF1 (1, 2%), PALB2 (1, 2%), SMARCA4 (1, 2%), STED2 (1, 2%), TET2 (1, 2%), U2AF1 (1, 2%)순으로 나타났다.

남성에게서는 TP53 (20, 85%)이 가장 빈번하게 발생하는 돌연변이였으며 그 뒤를 이어 EGFR (10, 29%), KRAS (9, 26%), ARID1A (3, 9%), CDKN2A (3, 9%), BRCA2 (2, 6%), ERBB2 (2, 6%), KNSTRN (2, 6%), PIK3CA (2, 6%), POLE (2, 6%), TET2 (2, 6%) ATRX (1, 2%), ATM (1, 2%), BRAF (1, 2%), CHEK1 (1, 2%), MSH6 (1, 2%), NOTCH1 (1, 2%), STK11 (1, 2%), U2AF1 (1, 2%), VHL (1, 2%) 순으로 나타났다(Figure 4).

Fig. 4. Next generation sequencing analysis results, oncoprint heatmap of single nucleotide variations and insertions and deletions in lung adenocarcinoma. Missense is shown in red, nonsense in blue, in-frame indels in yellow, and frame shift indels in brown. The upper bar chart is the number of variations in each patient. The lower bar chart shows the Sex and smoking status of each patient and the results of PCR for EGFR. Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; EGFR, epidermal growth factor receptor.

한국인 폐선암 환자에게서 가장 많이 나타나는 돌연변이는 EGFR과 TP53이었으며 흡연과의 연관성을 확인한 결과 흡연경험이 있는 남성에서 EGFR 돌연변이는 8건(26.7%)이 확인되었으며 여성에서 EGFR 돌연변이는 비흡연 환자에서 주로 확인되었다(N=29, 60.4%). 전체 성별에서 EGFR 돌연변이는 흡연 환자보다 비흡연 환자에서 유의하게 자주 확인되었다(P=0.007). 흡연경험이 있는 남성에서 TP53 돌연변이가 19건(63.3%)이 확인되었으며 비흡연 여성에서도 TP53 돌연변이가 29건(60.4%)이 확인되었다. 전체 성별에서 TP53 돌연변이는 비흡연 환자보다 흡연 환자에서 더 확인되었으나 통계적으로 유의하지 않았다(P=0.539) (Table 3)

Table 3

Correlation between smoking and EGFR or TP53 mutations

Variable	Smoking	Non-smoking
Female
EGFR mutant	1 (100)	29 (60.4)
Wild-type	0 (0)	19 (36.6)
Male
EGFR mutant	8 (26.7)	2 (50)
Wild-type	22 (73.3)	2 (50)
Total
EGFR mutant	9 (29.0)	31 (59.6)
Wild-type	22 (71.0)	21 (40.4)
P-value	0.007
Female
TP53 mutant	1 (100)	29 (60.4)
Wild-type	0 (0)	19 (36.6)
Male
TP53 mutant	19 (63.3)	1 (25.0)
Wild-type	11 (36.7)	3 (75.0)
Total
TP53 mutant	20 (64.5)	30 (57.7)
Wild-type	11 (35.5)	22 (42.3)
P-value	0.539

Data are presented as number (%).

Abbreviation: EGFR, epidermal growth factor receptor.

6. 폐선암 환자의 복제수변이(copy number variation) 분석

CNV는 43개의 유전자에서 132건의 CNV가 관찰되었으며, CNV에 증폭과 결손 돌연변이가 존재함을 확인하였다. CNV는 전체 폐선암 환자 83명 중 41건(49%)이 나타났으며 한 환자당 적게는 1건 많게는 10건의 증폭과 결손 돌연변이가 존재하였으며 증폭이 118건(89%) 발생하여 결실 14건(11%)보다 우세하게 나타났다(Figure 5). 여성(6건, 12%)과, 남성(6건, 14%) 모두를 통틀어서 EGFR 증폭이 12건(10%)으로 발생빈도가 가장 많았으며 EGFR 증폭이 있는 환자 중 EGFR 단일염기변이가 동시에 발생한 경우는 여성 환자 6중 6명이 EGFR 단일염기변이가 동시에 발생하였고 남성 환자인 경우는 6명 중 3명이 EGFR 단일염기변이가 동시에 발생하였다. 이 중 EGFR 엑손 19번 결실 돌연변이가 가장 흔하게 발생하였다(7건, 89%).

Fig. 5. Next generation sequencing analysis results, oncoprint heatmap of copy number variations in lung adenocarcinoma. Amplification is shown in red, deletion in blue. The upper bar chart is the number of variations in each patient. The lower bar chart shows the Sex and smoking status of each patient and the results of PCR for EGFR. Abbreviation: PCR, polymerase chain reaction; EGFR, epidermal growth factor receptor.

7. 폐선암 환자의 유전자 재배열(gene rearrangement) 확인

NGS를 이용하여 10건의 유전자 융합과 1건의 MET exon 14 skipping을 확인하였다(Table 4). 10건의 유전자 융합 중 가장 많은 것은 EML4-ALK fuson (2, 2%), KIF5B-RET fuson (2, 2%)이었으며, TPM3-NTRK1 fusion, SDC4-ROS1 fusion, SLC34A2-ROS1 fusion, EZR-ROS1 fusion, EZR-ROS1 fusion, MET exon 14 skipping이 각 1건이 확인되었고 그 중에서도 ROS1 유전자의 융합이 가장 많았다.

Table 4

Gene rearrangement of lung adenocarcinoma patients using next generation sequencing analysis

Characteristics	Analytic patients (N=83)
EML4-ALK fusion	2 (2)
KIF5B-RET fusion	2 (2)
TPM3-NTRK1 fusion	1 (1)
SDC4-ROS1 fusion	1 (1)
SLC34A2-ROS1 fusion	1 (1)
EZR-ROS1 fusion	1 (1)
RET-PCM1 fusion	1 (1)
MET exon 14 skipping	1 (1)

Data are presented as number (%).

8. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 검사법과 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing) 검사 결과의 일치도 분석

NGS 결과의 신뢰도를 높이기 위해서 동아시아 여성의 폐선암에서 자주 발견되는 EGFR hotspot 돌연변이(exon 19 delection, exon 20, exon 21 mutation)에 대한 PCR 검사를 수행하였으며 NGS 결과와 비교하여 100% (40/40)가 서로 동일함을 확인하였다(Table 5).

Table 5

comparison of PCR-EGFR test result and NGS result

Case No.	PCR-EGFR	NGS
1	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
3	EGFR exon 19 deletion	Leu747_Ala750delinsPro
6	T790M mutation in EGFR exon 20/L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
9	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
10	EGFR exon 19 deletion	Leu747_Pro753delinsSer
11	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del/
12	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
14	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
15	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
16	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
17	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
18	EGFR exon 19 deletion	Leu747_Pro753delinsSer
20	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
22	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
23	L861Q mutation in EGFR exon 21	Leu861Gln
24	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
26	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
27	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
28	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
34	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
35	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
36	EGFR exon 19 deletion	Leu747Pro
37	L861Q mutation in EGFR exon 21	Leu861Gln
39	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Arg748del/Thr751_Lys754delinsIleSerProGlu
40	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
43	EGFR exon 19 deletion	LeuGlu746_Ser752delinsVal
44	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
46	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
47	EGFR exon 19 deletion	Leu747_Ser752del
49	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
52	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
56	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
61	EGFR exon 19 deletion/T790M mutation in EGFR exon 20	Glu746_Ala750del/Thr790Met/ Cys797Gly
65	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
69	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
70		Glu709_Thr710delinsAsp
72	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del
76	L858R mutation in EGFR exon 21	Leu858Arg
77	EGFR exon 19 deletion	Leu747_Thr751del
81	EGFR exon 19 deletion	Glu746_Ala750del

Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; EGFR, epidermal growth factor receptor; NGS, next generation sequencing.

9. IHC-ALK 검사법과 염기서열 분석법(next generation sequencing) 검사 결과의 일치도 분석

페선암 환자 73명의 FFPE를 대상으로 IHC를 이용하여 ALK 재배열 검사를 진행하였다. ALK 재배열 검사는 IHC적 검사방법이 이용되었으며 이 검사법은 미국식품의약국(Food and Drug Administration)이 승인한 Ventana ALK (D5F3) 동반진단분석방법으로 ALK 단백질의 발현을 판독하였다(Figure 6) [15]. 그 결과 폐선암에서 ALK 재배열이 3건 관찰되었다. 검사 결과의 신뢰도를 높이기 위해 Ventana ALK (D5F3) 동반진단분석방법과 NGS 결과를 바탕으로 둘의 결과를 비교하였다. NGS에서는 EML4-ALK fusion 2건이 일치하였으며 1건은 유전자 융합을 발견하지 못했다.

Fig. 6. Results of IHC-ALK (D5F3) staining in lung adenocarcinoma tissue (A, C, E: 100x; B, D, F: 200x). (A, B) H&E stain, (C, D) positive IHC-ALK (D5F3), (E, F) negative IHC-ALK (D5F3) stain. Abbreviations: IHC, immunohistochemistry, ALK, anaplastic lymphoma kinase; H&E, hematoxylin and eosin.

10. FISH-ROS1 검사법과 염기서열 분석법(next generation sequencing) 검사 결과의 일치도 분석

페선암 환자 77명의 FFPE를 대상으로 FISH를 이용하여 폐선암세포의 핵 안에서 ROS1 유전자의 재배열을 관찰하였다. FISH-ROS1 검사 결과 3건의 ROS1 유전자 재배열이 확인되었다(Figure 7). NGS 결과의 일치도를 분석하기 위해 결과를 비교하였으며 NGS에서도 3건의 ROS1 유전자 융합(SDC4-ROS1 fusion, SLC34A2-ROS1 fusion, EZR-ROS1 fusion)이 확인되면서 FISH-ROS1과 NGS 결과가 모두 일치하는 것으로 나타났다.

Fig. 7. Result of FISH-ROS1 test in lung adenocarcinoma tissue (1,000×). (A) Nuclei of tumor cells stained with DAPI. (B) Green signal detected through green filter. (C) Orange signal detected through green filter. (D) The result of merged the two signals. Red circles: ROS1-positive signal (split signal and single green signal). Yellow circles: ROS1 negative signal (green/orange fusion signal and single orange signal). Abbreviation: ROS1: receptor tyrosine kinase 1; FISH, fluorescence in situ hybridization; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

11. IHC-ALK (D5F3), 형광제자리부합법(fluorescence in situ hybridization), PCR-EGFR 검사를 이용한 염기서열 분석법(next generation sequencing) 결과의 일치도 분석

앞서 시행한 IHC, FISH, PCR 검사 결과와 NGS 결과를 비교 분석한 결과 PCR-EGFR 검사는 NGS 결과와 100% (κ=1.00)의 일치도를 나타냈다. IHC-ALK (D5F3) 검사는 98.6% (κ=0.79)의 일치도를 확인하였으며 FISH-ROS1 검사의 경우 100% (κ=1.00) NGS 결과와 일치하는 결과를 나타냈다(Table 6).

Table 6

Concordance rates between PCR-EGFR, IHC-ALK (D5F3), and FISH-ROS1 and NGS analysis in lung adenocarcinoma cases

Methodology	NGS
	Positive	Negative	Total
PCR-EGFR
Positive	40*	0	40
Negative	0†	43	43
Total	40	43	83
Concentration rates (%)	100 (κ=1.00)
IHC-ALK (D5F3)
Positive	2	1	3
Negative	0	70	70
Total	2	71	73
Concentration rates (%)	98.6 (κ=0.79)
FISH-ROS1
Positive	3	0	3
Negative	0	74	74
Total	3	77	77
Concentration rates (%)	100 (κ=1.00)

Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; EGFR, epidermal growth factor receptor; NGS, next generation sequencing; IHC, immunohistochemistry; ALK, anaplastic lymphoma kinase; FISH, fluorescence in situ hybridization; ROS1, receptor tyrosine kinase 1.

*In addition to the EGFR mutations, the two cases were accom-panied by mutations at different locations in PCR (case 6). and NGS (case 11); ^†In one case, the EGFR mutation was confirmed in NGS, but it was located in exon 18 and judged to be accordant.

비소세포성폐암은 전체 폐암에서 차지하는 비율이 약 70%∼80%이며 폐선암, 폐편평상피암, 대세포암으로 구분된다. 그 중 폐선암은 전체 폐암의 약 40%를 차지한다[16]. 폐선암은 EGFR, KRAS, ALK, ROS1 등 다양한 유전자의 돌연변이와 관련이 있다[11]. 특히 동양인에게서 가장 많이 발생하는 것으로 보고된 EGFR 돌연변이에 의한 폐선암은 1세대 표적 치료제인 gefitinib과 erlotinib, 2세대 표적 치료제인 afatinib과 dacomitinib이 개발되었으며 1, 2세대 치료제에 내성이 있는 폐선암 환자를 위한 3세대 표적 치료제까지 개발되어 EGFR 돌연변이를 유무를 확인한다면 임상에서의 치료 효과를 기대할 수 있다. 또한 KRAS, ALK, MET, ROS1 돌연변이에 대한 표적 치료제가 개발되어 폐선암 환자의 유전자 돌연변이에 관한 분석은 환자의 치료와 예후에 큰 영향을 미치며 생존율을 높이는데 매우 중요하다[8]. 최근 개발된 차세대염기서열분석법은 유전체 하나를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 후 생물정보학적 기법을 이용하여 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독이 가능해짐에 따라 폐선암에 대한 유전자 돌연변이를 분석을 가능하게 한다[9, 10].

본 연구에서는 NGS를 이용하여 폐선암 환자의 치료에 도움이 되는 유전자 돌연변이의 검출과 발생빈도 분석에 집중하였으며 폐암을 유발하는 가장 대표적 원인 흡연과 돌연변이 유전자와의 관련성을 분석하여 폐선암에서 NGS의 중요성을 평가하였다.

폐선암 조직의 유전자 분석을 위해서는 폐암으로 진단받은 환자의 조직에서 정확한 하위분류가 필요하다. 세계보건기구(World Health Organization)에서 권장하는 가이드라인에 따라 H&E 염색을 시행하였고 추가적으로 IHC염색을 시행하여 폐선암 조직을 분류하였다[14]. 폐선암 환자를 대상으로 성별, 나이, 흡연 상태로 분류한 결과 남성보다 여성이, 흡연자보다 비흡연자의 발생 비율이 높게 나타났다. 이러한 결과는 이전에 보고되었던 연구 결과와 일치한다[6].

NGS 결과는 종양 억제 유전자인 TP53 (60.2%)이 한국인 폐선암 환자에서 가장 많이 발생하는 돌연변이로 확인되었으며 이러한 결과는 암유전체지도 프로그램(The Cancer Genome Atlas Program)에서 보고된 폐선암 환자의 유전자 돌연변이 분석결과와 일치하였다[17]. 하지만 이제까지 보고된 연구에 의하면 동아시아인의 폐선암에서 가장 빈번하게 발생하는 유전자 돌연변이는 EGFR로 보고되어 본 연구와 차이가 있었다[18-20]. 특히 폐선암에서 EGFR 돌연변이는 비흡연자에게 많이 발생하는 것으로 보고되었으며 TP53 돌연변이는 흡연과 강한 연관이 있다고 보고되어 본 연구에서 EGFR과 TP53 돌연변이와 흡연과의 연관성을 통계분석 하였다[21]. EGFR 돌연변이는 비흡연 환자에서 주로 확인되었으며(P=0.007) TP53 돌연변이는 흡연과 무관하게 발생한 것을 확인하였다(P=0.539). 이러한 결과는 한국인에서 폐선암을 유발하는 TP53 돌연변이의 원인이 흡연이 아닌 다른 원인에 의해서 발생되며 최근 증가하고 있는 비흡연 여성의 폐선암에서 가장 많은 발병 원인으로 추측되지만 TP53 돌연변이를 유발하는 다양한 원인과 더 많은 증례를 포함한 비교 연구가 필요하다. 또한 NGS 결과 폐선암 환자에서 ALK, ROS1, RET, MET 등, 유전자 재배열을 확인하였으며 폐선암에서 이들이 차지하는 비율은 이전에 보고되었던 연구와 일치하였다[22].

본 연구의 NGS 결과의 신뢰성을 확인하기 위해서 다양한 추가 연구가 진행되었다. 폐선암 환자를 진단하고 임상에서 환자를 치료하는데 필요한 기존 유전자 검사방법인 PCR-EGFR, IHC-ALK (D5F3), FISH-ROS1을 이용하여 NGS 결과와 일치도를 평가하였다[23]. PCR-EGFR 검사는 NGS 결과와 100% (κ=1.00)의 일치도를 확인하였다. IHC-ALK (D5F3) 검사는 1건의 불일치가 발생하여 98.6% (κ=0.79)의 일치도를 나타냈는데 이 경우 작은 생검검체로 조직의 양이 부족하여 정확한 데이터를 얻는데 어려움이 있었을 것으로 판단된다. FISH-ROS1 검사의 경우 100% (κ=1.00) NGS 결과와 일치도를 나타내어 NGS는 폐선암에서 한 번의 검사로 다양한 돌연변이 유전자를 검출하는데 적합하다고 사료된다.

결론적으로 NGS를 이용한 폐선암 환자의 돌연변이 유전자의 진단은 점 돌연변이나, 염기의 삽입, 결실, 융합, 전위, CNV 등, 동시 분석을 가능하게 하여 동반진단을 통한 폐선암 환자의 표적치료를 가능하게 하며 아직 알려지지 않은 새로운 표지자를 확인하는데 매우 유용할 것으로 사료된다.

폐암은 크게 소세포성 폐암과 비소세포성 폐암으로 구분되며 비소세포성폐암이 차지하는 비율은 약 70%∼80%이다. 비소세포성폐암 중 폐선암은 전체 폐암의 약 40%를 차지한다. 최근 유전자 프로파일링 기술이 발전하면서 종양의 발생 및 성장에 중요한 종양 유전자와 종양 억제 유전자의 변이에 대한 연구가 활발히 진행되어 폐암을 유발하는 특정 유전자들이 발견되면서 생존율에 큰 영향을 미치게 되었으며 특히 폐선암은 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing, NGS)을 이용한 동반진단을 통해 표적 치료로 생존을 높이는데 도움을 얻을 수 있다. 본 연구는 한국인에서 폐선암을 유발하는 유전자 변이 검출을 위해 비소세포성폐암 환자의 파라핀 포매 조직(formalin-fixed paraffin-embedded)으로 hematoxylin and eosin 염색을 시행하여 폐선암을 구분하였으며 정확한 폐선암 조직을 분류하기 위해 면역조직화학(immunohisto-chemistry, IHC)염색을 시행하였다. 그 결과를 바탕으로 NGS를 이용하여 유전자 변이의 종류와 패턴을 분석하였고 폐암을 유발하는 가장 대표적인 원인인 흡연과의 관계를 확인하였다. NGS 결과 단일염기서열변이(single nucleotide variation, SNV), 복제수변이 (copy number variation, CNV), 유전자 재배열을 확인하였으며 폐선암에서 SNV는 TP53 (44.6%), EGFR (35.7%), KRAS (10.7%), PIK3CA (6.2%), CDKN2A (4.4%) 순으로 발생하였고 CNV의 경우 EGFR (14%)이 가장 빈번하게 발생하였다. 또한 ALK, ROS1, RET 과 같은 유전자 재배열을 확인하였다. NGS의 신뢰도를 확인을 위하여 기존에 사용되고 있는 유전자 검사방법인 PCR-EGFR, IHC-ALK (D5F3), FISH-ROS1 검사를 추가적으로 시행하여 NGS 결과와 일치도를 확인하였다. 이 연구는 폐선암 환자에 대한 NGS가 여러 유전자의 돌연변이를 동시에 확인하여 치료 전략에 더욱 긍정적인 이익을 줄 수 있음을 보여준다.

This article is a condensed form of the first author’s doctoral thesis.

None

Baek JH, Graduate student; Jo KB, Professor.