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Cisplatin Suppresses Proliferation of Ovarian Cancer Cells through Inhibition Akt and Modulation MAPK Pathways
Korean J Clin Lab Sci 2020;52:62-68  
Published on March 31, 2020
Copyright © 2020 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Jae-Sun Choi

Department of Biomedical Laboratory Science, Far East University, Eumseong, Korea
Correspondence to: Jae-Sun Choi
Department of Biomedical Laboratory Science, Far East University, 76-32 Daehak-gil, Gamgok-myeon, Eumseong 27601, Korea
E-mail: jaenny123@gmail.com
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1733-4088
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Cisplatin (CDDP) is a chemotherapy agent used for patients with ovarian cancers. CDDP activates multiple signaling pathways, which causes various cellular reactions according to the type of cancer cells. Therefore, it is difficult to clearly conclude its signaling pathways. The purpose of this study is to determine the role of the signal protein of Akt/ERK1/2 and MAPK by CDDP-induced apoptosis in ovarian cancer cells (SKOV3). As a result, the number of apoptosis increased according to the TUNEL assay, and flow cytometric analysis confirmed that the percentage of sub-G1 early apoptosis was 8.73% higher than the control. The PARP and caspase-3 activity that appeared in the process of apoptosis was increased and the Bcl-2 expression was decreased. It was verified that the Akt and ERK1/2 activity was decreased, and p38 and JNK activity increased in a time dependent fashion. In conclusion, these results demonstrate that cisplatin inhibits the proliferation of ovarian cancer cells by inhibiting Akt activity and induces apoptosis by modulating the MAPK signaling pathway. However, a decrease in the ERK1/2 activity by CDDP was the opposite result to the result shown from the HeLa cells. For this reason, further research on signaling pathways is necessary. These results are expected to be useful for ovarian cancer treatment strategies targeting the MAPK pathway.
Keywords : Akt, Apoptosis, Cisplatin, MAPK, Ovarian cancer
서 론

난소암은 가장 치명적인 부인과 악성 종양으로 주로 상피성 난소암의 형태로 존재한다[1, 2]. 2018년 미국에서 난소암 발병 사례는 대략 22,240건 정도로, 이로 인한 암 사망 수치는 14,070건에 가까울 것으로 예상하였다. 이는 전체 암의 사망 원인 중 5번째에 속하며 미국 여성의 암 사망률 5%를 차지한다[3].

Cisplatin (cis-[Pt(NH3)2 Cl2], CDDP)은 난소암 등의 고형암 치료에 사용되는 가장 강력한 화학 요법제 중 하나이다. Cisplatin을 포함하는 백금 기반의 항암제들은 실제 cisplatin이 임상 실험에서 성공한 후 수많은 연구자들의 수고와 노력에 의하여 발견되고 발전하였다[4, 5]. 그러나 cisplatin의 광범위한 항암 활성에도 불구하고 난소암 치료 과정 중 독성 부작용 및 종양 내성을 동반하여 재발율로 인한 치료에 한계를 갖는다. 이에 따라 부작용을 줄이기 위해 cisplatin과 함께 사용할 수 있는 물질과의 병용요법이나 cisplatin이 가지는 다중 신호경로를 타겟으로 세포 사멸을 유도하는 새로운 치료 전략으로의 연구가 진행되고 있다. 세포 사멸(apoptosis)의 경로는 연속적인 진행과정으로 초기 세포사멸의 활성화 단계인 핵 내의 신호전달, 전이단계인 미토콘드리아에서의 단백질 조절 및 실행 그리고 실행 단계인 세포질에서의 단백질 분해 등으로 구조적 변화가 일어나는 순서로 이어진다[6]. 세포 사멸을 일으키는 암세포의 성향은 화학 요법제와 반응하여 결정되는 중요한 요소이고 종종 암세포는 세포 사멸을 조절하는 변이 유전자를 가진다[7, 8]. 예를 들어 pro-survival과 관련 있으며 PI3-K (phosphatidylinositol 3-kinase)에 의해 조절되는 Akt serine-threonine kinase는 사람에서 발생하는 암에 빈번하게 활성화된다[9]. 종양 억제 유전자 MMAC1 (mutated in multiple advanced cancers 1)으로 알려진 PTEN (phosphatase and tensin homolog)은 PI3-K/Akt 경로를 음성적으로 조절하여 몇몇 세포 사멸을 자극하면서 세포 사멸에 반응하는 민감성을 증가시킨다[10]. 게다가 PTEN은 성장인자에 의해 유도된 Shc (src homology domain C-terminal)의 인산화를 억제하고 MAPK (mitogen- activated protein kinases) 신호전달경로를 방해하기도 한다[11]. MAPKs의 3가지 주요 그룹은 ERK (extracellular signal- regulated protein kinases), JUN (c-JUN N-terminal kinase/stress-activaed protein kinase)과 p38 subfamilies로 포유동물 세포내 발견된다. 각각의 그룹은 다양한 세포 외부의 자극과 스트레스를 통해 세포 내부의 경로가 변화될 수 있도록 조절하는 단백질들을 가진다[12, 13]. Cisplatin은 세포의 종류 및 치료 용량에 따라 세포 반응을 조절하기 위하여 다중 신호 경로를 활성화 시킨다[34]. 그러나 다양한 스트레스에 의해 세포 사멸을 유발하는 신호 경로 과정 중에 신호 단백질의 발현 변화로 단백질 역할을 규명하기에는 더 많은 연구가 필요한 실정이다. 특히 cisplatin을 처리한 다양한 세포에서의 ERK1/2 활성 변화는 세포사멸 또는 세포 생존에 대한 논란을 가진다[14, 15]. 본 연구에서는 cisplatin으로 세포사멸을 유도한 SKOV3 세포에서 세포사멸 과정 중 나타나는 Akt와 MAPK 신호 단백질의 작용을 규명하고자 하였다. 신호 단백질 발현 변화를 통해 이들의 역할을 규명하기 위해서 cisplatin이 SKOV3 세포에 미치는 세포사멸에 초점을 두고 시행하였다. 세포 사멸체 확인과 초기 세포 사멸율 분석하고 caspase-3 및 Bcl-2의 발현을 고려하여 Akt, ERK1/2, p38 그리고 JNK의 역할을 결정하였다.

재료 및 방법

1. 시약 및 항체

Cisplatin (cis-diamminedichloridoplatinum (II), CDDP)은 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. p-AKT (ser 473), p-ERK1/2, p-JNK, p-P38, cleaved-PARP cleaved-caspase-3, Bcl-2와 b-actin에 대한 1차 항체는 모두 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)에서 구입하여 1:1,000 또는 1:5,000으로 희석하여 사용하였다.

2. 세포 배양

본 연구에 사용된 인간의 난소암 세포(SKOV3) (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)는 서울 의과대학에서 분양받아 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에 2 mM L-glutamine (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과 10% fetal bovine serum (HyClone, Thermo Scientific), 1% penicillin streptomycin (Invitrogen)을 첨가하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

3. 세포 생존율 측정

세포 생존율은 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl- tetrazolium (MTT) (Cell Titer 96 AQueous Cell Proliferation Assay kit; Promega Corporation, Madison, WI, USA) assay 방법에 따라 수행하였다. 동일한 수의 세포를 96 well plate에서 24시간 배양 후 다양한 농도의 cisplatin을 처리하여 48시간 동안 다시 배양하였다. 배양액을 제거한 후 다시 100 mL의 배양 액에 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2, 5- diphenyl-tetrazolium (MTT) 용액(4 mg/mL) 20 mL를 첨가하여 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 연속 배양하였다. 상층액을 제거하고 DMSO 100 mL/well 넣어 15분간 반응 후 microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군과 비교하여 백분율 수치를 계산하고 IC50 값을 결정하였다. SKOV3 세포에 IC50에 해당하는 cisplatin을 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다.

4. TUNEL assay를 이용한 세포사멸 확인

In Situ Cell Death Detection Kit (Roche, Penzberg, Germany)를 이용한 terminal deoxynucleotidyl transferase mediated digoxigenin-dUTP-biotin nick-end labeling (TUNEL) assay를 통해 SKOV3 세포의 세포 사멸체을 입증함으로 세포 사멸을 확인하였다[16]. 세포는 4% 포름알데히드로 고정시키고 40분 동안 실온에서 배양하였다. 이어서 PBS에서 여러 번 세척하여 얼음 위에서 0.2% Triton X-100 용액에 5분 동안 투과시킨 후 50 mL의 TUNEL reaction mixture 혼합물을 chamber slide에 첨가하고 37°C, 5% CO2 암실 조건 하에서 1시간 방치하였다. 마지막으로, 상층액을 제거하고 PBS로 5분 동안 2번 세척한 후 confocal microscope Model LSM 510 (Carl Zeiss, Jen, Germany)으로 관찰하였다.

5. 세포주기 분석

Cisplatin 처리에 따른 SKOV3 세포의 초기 세포 사멸을 관찰하기 위하여 제조사(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)의 설명에 따라 Annexin V FITC로 염색하였다. 대략 1×105개의 세포를 수확하여 pH 7.4 phosphate-buffered saline으로 세척 하였다. 세척한 세포는 100 mL Annexin-V binding buffer (10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulphonic acid, 140 mM NaCl과 2.5 mM CaCl2; pH 7.4)에 현탁시키고 5 mL Annexin-V-FITC를 첨가하여 15분 동안 실온에서 배양하고 2 mL Annexin-V binding buffer를 첨가하여 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 이후 배양 세포에 190 mL Annexin-V binding buffer로 희석하여 세포가 최종 농도 1 mg/mL PI (propidium iodide)가 되도록 염색한 후 Becton-Dickinson FACScan과 Cell Quest software (Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포주기 분석은 염색한 세포로부터 DNA양을 측정하여 결정하였다.

6. Western blot analysis

SKOV3 세포에 cisplatin을 처리한 후 단백질 저해제 칵테일이 첨가된 radioimmuno- precipitation buffer (50 mM Tris; pH 8.0; Cell Signaling, USA)에 용해하여 상층액의 단백질 양을 BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 측정하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 nitrocellulose 막으로 전사하였다. 5% skim milk로 2시간 동안 실온에서 blocking 한 후 3회 세척하였다. 1차 항체 anti-cleaved caspase-3, anti-cleaved PARP, anti-Bcl-2, anti-phospho-Akt, anti-phospho-ERK, anti-phospho-p38, anti-phospho-JNK와 b-actin은(all Cell Signaling Technology, Inc.) 4°C에서 24시간 반응시키고 tris buffered saline with tween 20 (TBST)로 3번 세척 후, 2차 항체 horseradish peroxidase-conjugated anti-IgG (Invitrogen)로 실온에서 2시간 반응하였다. 세척 후 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, IL, USA)을 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.

7. 통계학적 분석

본 연구에서의 모든 실험 결과는 평균(mean value)±표준 편차로 나타내었다. 두 그룹 간의 평균을 비교할 때는 Student’s t-test를 사용하여 비교하였고 통계적 유의성은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 실시하여 검증하였다.

결 과

1. Cisplatin이 SKOV3 세포에 미치는 세포 생존수와 초기 세포사멸

Cisplatin이 SKOV3 세포의 생존에 미치는 영향을 조사하기 위해 5 μM과 10 μM 농도로 0, 24 및 48시간 처리한 세포를 MTT assay 방법을 통해 세포 생존율을 결정하였다. SKOV3 세포에 cisplatin을 48시간 동안 처리한 결과 50%의 세포 증식 억제를 보이는 농도는 10 μM로 나타났다(Figure 1). cisplatin에 의해 유도 관찰된 세포 사멸이 세포 sub-G1 주기에서 나타나는 초기 세포사멸과 관련이 있는지 조사하기 위해 유세포 분석을 수행하였다(Figure 2). SKOV3 세포에 10 μM의 cisplatin을 48시간 처리한 결과, 처리하지 않은 대조군은 Annexcin-V- FITC positive 세포가 0.72%을 보였으나 cisplatin을 처리한 경우 9.46%로 증가하는 것을 확인하였다.

Fig. 1. Effects of Cisplatin on viability in SKOV3 cells. Cells were seeded in 96-well plates and treated with 5 μM and 10 μM concentrations of cisplatin, and cell viability was determined with the MTT assay. The values are calculated relative to the control group (0 μM cisplatin). The results are shown as mean±SD and are representative of three independent experiments. *P<0.05 versus the control group.
Fig. 2. Effects of Cisplatin on early apoptosis in SKOV3 cells. Apoptosis of cells treated with 10 μM cisplatin for 48 h. Cells in the sub-G1 phase were identified according to strong Annexin-V binding. The data are representative of three independent experiments.

2. Cisplatin이 SKOV3 세포에 미치는 세포사멸과 caspase 활성

TUNEL assay는 세포 사멸의 신호전달경로[16] 과정 중에 나타나는 세포의 DNA 손상을 현미경으로 관찰할 수 있는 분석 방법이다. Cisplatin이 세포 사멸을 통해 항암 효과를 나타내는지의 여부를 평가하기 위해 48시간 동안 cisplatin 10 μM로 처리된 SKOV3의 사멸 세포 체를 TUNEL assay로 관찰하였고 세포 사멸률을 24시간과 48시간에 확인하였다. Cisplatin으로 처리한 SKOV3 세포의 사멸 세포 수는 대조군과 비교하여 시간이 증가할수록 유의하게 증가하였다(Figure 3).

Fig. 3. Cisplatin induces apoptotic cells in SKOV3 cells. Cells were treated with cisplatin and after treatment, the number of apoptotic cells was determined with the TUNEL assay. Data are presented as the mean±SD and are representative of three independent experiments with similar results. *P< 0.05 versus the control group.

Caspase-3는 세포 사멸의 주요 단계에서 나타나는 단백질이다. Cisplatin 처리한 SKOV3에서의 세포 사멸을 알아보기 위해 western blot으로 cleved PARP, cleved caspase-3 및 Bcl-2 단백질 수준을 측정하였다. Cleved PARP과 cleved caspase-3의 수준은 유의하게 증가하였으나 반대로 Bcl-2 수준은 유의하게 감소하였다(Figure 4).

Fig. 4. Cisplatin induces apoptosis in SKOV3 cells. SKOV3 cells were treated with 10 μM cisplatin for the indicated times, after which cells were lysed and analyzed for cleaved-PARP, cleaved-caspase-3, and Bcl-2 expression by western blotting using an anti-cleaved-PARP, anti-cleaved-caspase-3, and anti-Bcl-2 antibody Actin was used as an internal control. The western blots are representative of three independent experiments with similar results.

3. Cisplatin이 SKOV3 세포에 미치는 Akt와 MAPK 신호 단백질 발현

Cisplatin으로 세포 사멸을 유도한 신호전달 과정에는 어떠한 신호 전달 단백질들의 활성이 변화하여 SKOV3 세포에 영향을 미치는지 이들 활성 단백질에 대한 항체를 이용하여 western blot으로 확인하였다. Akt의 활성화는 세포 생존에 결정적인 역할을 하는 단백질로 p-Akt와 p-ERK 단백질 발현은 24시간에서 유의적으로 감소하였으나 p-Akt는 48시간에서 변화가 없었다( ). MAPK은 세포에 주어진 스트레스를 통해 p38이나 JNK 단백질들을 단백질들을 활성화하여 다양하게 세포의 신호를 조절하여 세포 증식이나 세포 생존에 관여한다. Figure 5 에 제시한 바와 같이, p-p38과 p-JNK 단백질 발현은 24시간에서 유의하게 증가하였으나 48시간에서 p-38의 발현은 감소하였으며 p-JNK의 발현은 48시간에서 변화가 없었다.

Fig. 5. Effects of Cisplatin on phosphorylation of AKT and MAPK in SKOV3 cells. SKOV3 cells were treated with 10 μM cisplatin for the indicated times, after which cells were lysed and Akt, ERK, p38 and JNK activation determined by western blotting with an anti-phosphor-Akt antibody, anti-phosphor-ERK antibody, anti-phosphor-p38 antibody and anti-phosphor-JNK antibody. Actin was used as an internal control. A representative image is shown from three independent experiments.
Acknowledgements

This work was supported by the 2019 Far East University Research (FEU 2019R37).

Conflict of interest
None
Author’s information (Position)
Choi JS, Professor.
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