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Protective Effect of Agrimonia pilosa var. Extract on Cultured NIH3T3 Fibroblasts Damaged by Potassium Dichromate
Korean J Clin Lab Sci 2019;51:205-213  
Published on June 30, 2019
Copyright © 2019 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Jun-Hee Lee1, Young Mi Seo2,*

1Department of Emergency Medicine, Sanbon Hospital, Wonkwang University College of Medicine, Gunpo, Korea,
2Department of Nursing, College of Medicine, Wonkwang Health Science University, Iksan, Korea
Correspondence to: Young Mi Seo Department of Nursing, College of Medicine, Wonkwang Health Science University, 514 Iksan-daero, Iksan 54538, Korea E-mail: dudn0408@wu.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

The protective effect of Agrimonia pilosavar. (AP) extract on potassium dichromate (K2Cr2O7)- induced cytotoxicity in cultured NIH3T3 fibroblasts, was examined by performing an XTT assay for the cell viability and antioxidative effects, such as lactate dehydrogenase (LDH) activity and superoxide anion-radical (SAR) scavenging activity. In this study, K2Cr2O7 decreased the cell viability significantly in a dose-dependent manner, and the XTT50 value was determined to be 37.5 μM, which was highly-toxic according to the Borenfreund and Puerner’ toxic criteria. The antioxidant, butylated hydroxytoluene (BHT), increased remarkably the cell viability damaged by K2Cr2O7-induced cytotoxicity in these cultures. With regard to the protective effect of the AP extract on K2Cr2O7-induced cytotoxicity, AP extract produced a significant increase in cell viability and antioxidative effects as the inhibitory ability LDH and SAR scavenging ability. These findings suggest that oxidative stress is involved in the cytotoxicity of K2Cr2O7, and the AP extract effectively protected the cells from K2Cr2O7-induced cytotoxicity by antioxidative effects. These results suggest that natural resources, such as AP extract, may be a putative therapeutic agent for the diminution or treatment of cytotoxicity induced by heavy metallic bases, such as K2Cr2O7 correlated with oxidative stress.

Keywords : Agrimonia pilosa var, Oxidative stress, Potassium dichromate
서 론

크롬(chromium)은 은백색의 단단한 물질로 대부분 자연상태에서 3가 형태로 존재하고 있으며, 산업장에서 많이 사용하고 있는 재료로는 3가와 6가 크롬의 화합물로서 특히 6가 크롬은 3가 크롬보다 독성이 강하기 때문에 중독의 원인이 되고 있다[1]. 6가 크롬 중에서 중크롬산은 부식작용과 산화작용에 의해 인체에 유해함이 이미 잘 알려져 있으며, 특히, 중크롬산염 중 중크롬산칼륨(potassium dichromate, K2Cr2O7)은 중크롬산소다와 함께 사용용도가 넓어 가죽제조를 비롯한 염색, 안료제조 및 시멘트제조와 같은 다양한 산업공정의 원료로 사용되고 있다[2]. 이 과정 중 K2Cr2O7로부터 나오는 분진 입자나 흄은 인체의 피부장벽은 물론, 호흡기나 입을 통하여 인체내로 들어가 각종 장기에 손상을 초래하여 피부병변, 폐암, 뼈천공과 같은 많은 질환을 야기한다[3]. 특히, 인체의 점막조직이나 피부에 대한 부식성이 강하기 때문에 이의 취급시에는 각별한 주의를 요한다. 이와 같이, K2Cr2O7은 환경오염원이면서 발암물질로 알려져 있으나 이로 인한 병변발생 시 뚜렷한 치료적 방법이나 효과적인 치료약제가 매우 빈약한 실정이다[4]. 그 외에도 K2Cr2O7과 같은 크롬염에 대한 중독성현상을 비롯한 세포내 DNA와 같은 핵산물질의 손상이나 물질수송과 같은 기전에 대해서도 자세히 밝혀져 있지 않으며, 세포수준에서의 독성에 대한 연구도 많지 않다[2, 5]. 크롬을 비롯한 수은이나 카드뮴, 납과 같은 몇몇 중금속류는 붕괴될 때 자유라디칼(free radicals)이 발생되는데 그 독성이 산화적 손상(oxidative stress)과 연관이 있을 것으로 보고되면서 이들에 의한 병변치료를 항산화 작용 측면에서 접근하는 연구가 이루어지고 있다[6].

최근, 한약재, 약초 및 허브 등과 같은 각종 식물에는 항산화를 비롯한 항암이나 항염 및 항독에 효과적인 생리활성물질이 다량 함유되어 있는 것으로 알려지면서 이들 성분에 대한 약리작용은 물론, 병변에 대한 치료적 효능검정에 대한 연구가 진행되고 있다[7, 8]. 특히, 이들의 성분 중에 페놀화합물의 일종인 flavonols와 같은 폴리페놀류나 플라보노이드화합물은 항산화를 비롯한 항염이나 항균에 뛰어난 효능이 있다고 알려져 있다[7, 9]. 식물 중 짚신나물(Agrimonia pilosavar., AP)은 장미과(Rosaceae)에 속하는 여러해살이풀로 우리나라의 산이나 들의 풀밭 전역에서 자생하고 있다. 생약명으로는 지선초 또는 황화초라고도 불리우며 6∼8월경에 5장의 노란 꽃잎을 피운다. 전초는 개화전에 채취하여 깨끗이 세척한 다음 그늘에서 말려 사용한다. AP에는 정유(oil)를 비롯하여 폴리페놀류의 탄닌(tannin) 또는 아그리모놀라이드(agrimonolide), 플라보노이드류인 사포닌(saponin), 항산화제인 vitamin C 및 스테롤(sterol)과 같은 다양한 성분을 함유하고 있어 오래전부터 장출혈을 비롯하여 항암, 고혈압, 강장, 대하증과 같은 병변치료에 사용하여 왔다[10]. Lee 등[11]은 AP의 물과 메탄올 추출물에 대한 항산화 영향을 superoxide (SOD)-유사활성을 비롯한 DPPH-라티칼 소거능, ABTS 양이온 소거능 및 폴라페놀함량조사와 같은 측면에서 분석하였으나 본 연구는 이와 다른 방법인 막손상 저해능 및 자유라디칼 음이온-소거능에 의한 조사 및 폴리페놀과 플라보노이드 함량에 대한 분석에 의한 항산화 측면에서 조사하였다. 물론, 항산화 효과에 대한 분석은 reactive oxygen species (ROS)나 superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (GPx)와 같은 자유라디칼 제거능이나 항산화효소의 활성능을 측정하는 다양한 분석벙법 등이 알려져 있다[12, 13]. 크롬염의 일종인 potassium chromate나 K2Cr2O7의 독성기전에는 DNA와 같은 핵산물질의 손상이나 세포대사장애[2] 등과 같은 여러 기전이 있지만 본 논문에서는 K2Cr2O7의 독성을 산화적 손상 측면에 근거하여 분석하였다. 이는 위에서 언급한 바와 같이 Lee 등[11]에 의한 항산화 분석과는 달리, 세포생존율을 비롯한 lactate dehydrogenase (LDH) 및 superoxide anion radical (SAR)-소거능을 조사하였다.

근래 세포배양기법이 발달되면서 각종 병변에 대한 모델제작을 비롯하여 화학약제나 신물질의 효능검정은 물론, 줄기세포를 이용한 병변치료 및 태아의 세포배양에 의한 산전진단과 같은 다양한 목적에 활용되고 있다[14]. NIH3T3 섬유모세포종을 활용한 K2Cr2O7의 세포독성을 산화적 측면에서 조사하였다. NIH3T3 섬유모세포종은 피부나 호흡계통을 비롯한 인체 내 여러 장기에 널리 분포하고 있는데, K2Cr2O7 같은 중금속염의 입자들이 쉽게 통과하기 때문이다. 또한 K2Cr2O7 독성에 대한 AP 추출물의 영향을 항산화 측면에서 조사하여 산화적 손상과 관련된 중금속염과 같은 독성물질에 대한 독성경감이나 치료를 위한 물질을 천연소재로부터 알아보았다.

재료 및 방법

1. 약제 제조 및 K2Cr2O7의 처리

본 실험에 사용한 시약으로 K2Cr2O7을 비롯한 xanthine, potassium phosphate buffer (pH 7.5), dimethylsulfoxide (DMSO), butylated hydroxytoluene (BHT), hydrogen peroxide (H2O2), phosphate buffered saline (PBS), XTT, sodium carbonate, aluminum nitrate 및 ethyl alcohol은 Sigma사(St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였다. K2Cr2O7의 제조는 Kim 등[15]의 연구를 근거로 XTT50값을 구하기 위하여 fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA)이 없는 minimum essential medium (MEM, Gibco, USA)을 사용하였으며, 각각 0∼40 μM의 저장액을 만들어 사용하였다. XTT (2,3-bis- [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-caboxanilide, disodium salt)는 PBS를 이용하여 50 μg/mL의 저장액을 만든 후 냉암소에 보관한 다음 필요한 양을 직접 배양액에 첨가하여 사용하였다. K2Cr2O7의 처리는 배양중인 NIH3T3 섬유모세포에 K2Cr2O7이 25∼35 μM 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 48시간 동안 배양한 후 세포생존율을 대조군과 비교하여 XTT50 농도를 측정하였다.

2. AP 채취 및 추출

전북 야산에서 AP 전초를 개화전에 채취하여 원광대학교 부설 생명자원과학연구소에서 동정을 확인하고 사용하였다. 채취한 전초는 잘 씻어 통풍이 잘 되는 그늘에서 말린 후 일정한 길이로 잘라 냉암소에 보관해 시료로 사용하였다. 보관중인 시료 67.3 g을 잘게 파쇄한 다음 시료와 이의 3배 정도의 3차 증류수를 1,000 mL의 환저플라스크에 함께 넣고 3시간 동안 가열하였다. 위의 과정을 4회 반복 추출하여 여과한 다음 574 ×g에서 30분 동안 원침시켰다. 원침 후 진공농축기에서 농축감압시킨 다음 3.2 g의 시료를 얻었으며, 이 때 수율은 4.8%로 나타났다.

3. 세포 배양 및 세포생존율 분석

NIH3T3 섬유모세포(ATCC, CRL 1658)의 배양은 Oh 등 [14]의 방법에 따라 배양용기에 부착된 세포는 trypsin을 이용한 효소해리술에 의하여 분리하였다. 분리된 세포들은 원침 후 10% FBS가 함유된 MEM 배양액에 넣고 균질화 한 다음 1×105 cells/well이 되도록 조절한 후 96-well 배양용기에 배분하였다. 배분된 세포들은 36°C, 5% CO2로 조절된 항온기내에서 72시간 동안 배양하였다. 세포생존율 분석은 Mosmann [16]의 방법에 따라, 배양 세포에 약제나 시료추출물을 농도별로 처리한 다음 실험 당일 제조한 XTT 50 μg/mL를 well당 20 μL씩 넣고 36°C로 조절된 항온기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 DMSO를 넣어 실온에서 정치한 다음 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교 조사하였다. XTT50값의 산출은 회귀직선식에 의하여 산출하였다.

4. BHT의 항산화능 측정 및 K2Cr2O7에 대한 BHT의 영향

항산화제인 BHT의 항산화능을 조사하기 위하여 Son 등 [17]의 연구를 근거로 활성산소의 일종인 H2O2 35 μM를 배양 세포에 처리하기 2시간 전에 BHT가 30∼50 μM 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 처리한 다음 세포생존율을 대조군과 비교 조사하였다. K2Cr2O7에 대한 BHT의 영향조사를 위하여, XTT50 농도의 K2Cr2O7을 배양세포에 처리하기 2시간 전에 BHT가 40 μM과 50 μM로 각각 포함된 배양액에서 세포를 배양한 다음 세포생존율에 의하여 대조군과 비교 조사하였다.

5. AP 추출물의 세포독성 및 추출물 처리

AP 추출물에 대한 독성을 조사하기 위하여 추출물이 각각 110∼170 μg/mL로 각각 포함된 배양액에서 48시간 동안 배양한 후 대조군과 세포생존율을 비교 조사하였다 또한, K2Cr2O7에 대한 AP 추출물의 최대효능 분석을 위하여 독성이 없는 최대농도인 130 μg/mL와 150 μg/mL의 농도를 선정하였다. 배양 세포에 K2Cr2O7 XTT50 농도를 처리하기 2시간 전에 AP 추출물 130 μg/mL와 150 μg/mL가 각각 포함된 배양액에서 세포를 배양한 다음 이의 영향을 세포생존율에 의하여 대조군과 비교 조사하였다.

6. AP 추출물의 함량 분석

폴리페놀분석은 AOAC [18] 방법에 의하여, 추출시료 0.2 mL에 phenol reagent 0.2 mM를 첨가하여 3분 동안 정치하였다. 정치 완료 후 0.4 mL sodium carbonate를 가하여 1 시간 동안 반응시킨 다음 ELISA reader로 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 시약으로 tannic acid를 이용하여 검량곡선을 작성하였다. 플라보노이드 분석은 Nieva Moreno 등 [19]의 방법에 따라 시료용액 0.1 mL에 10% aluminum nitrate와 1 M potassium acetate 혼합물 0.2 mL에 에탄올 4.7 mL를 가하여 25°C에서 40분 동안 반응 후 ELISA reader로 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 quercetin을 이용하여 검량곡선을 작성하였다

7. 항산화 분석

Lactate dehydrogenase (LDH) 활성 측정을 위하여 배양세포에 약제나 추출물을 각각 처리한 다음 배양액을 250 ×g에서 10분 동안 원침시켰다. 원침 후 50 μL의 상등액을 취한 다음 LDH CytoTox detection kit (Asan Co., Seoul, Korea)의 반응액(0.05 U/mL) 50 μL를 넣고 실온에서 30분 동안 정치하였다. 정치 후 ELISA reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, LDH 활성은 대조군에 대한 백분율로 하였다. 또한, LDH 활성 저해능(%)은 100−[(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100]으로 나타냈다. 또한, superoxide anion-radical (SAR) 소거활성 측정은 nitroblue tetrazolium (NBT)의 환원방법에 따라, 시료용액 0.1 mL와 0.4 mL potassium phosphate buffer (pH 7.5)에 0.4 mM xanthine과 NBT를 가하여 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 1 N HCl ImL를 가하여 반응을 정지시켜 생성된 SAR 양을 ELISA reader 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소거능의 측정은 시료첨가군과 무첨가군의 차이에 의한 백분율로 표시하였으며, BHT의 활성을 양성대조군으로 사용하였다. SAR 소거능(%)은 100−[(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100]으로 나타냈다.

8. 통계 분석

실험결과는 SPSS/WIN 18.0을 이용하여 mean±SD로 표시하였다. 실험결과에 대해 ANOVA를 시행하였고 사후 분석은 Tukey HSD에 의하였으며, 유의수준은 P<0.05에서 채택하였다.

결 과

1. K2Cr2O7의 세포독성 측정

배양 NIH3T3 섬유모세포에 K2Cr2O7의 독성을 조사한 결과, 처리 농도에 비례하여 K2Cr2O7은 세포생존율을 대조군에 비하여 유의하게 감소시킴으로써 독성을 나타냈다(P<0.001). 이 과정에서 XTT50 값은 37.5 μM의 처리에서 나타났다(Table 1).

The cytotoxicity of potassium dichromate (K2Cr2O7) on cultured NIH3T3 fibroblasts by XTT assay

Concentrations of K2Cr2O7 (μΜ)XTT assay (450 nm)FPTukey HSD

Mean±SD
Controla1.53 ±0.1137.01<0.001a>b>c, d
25b1.10±0.28
30c0.87±0.09
35d0.73±0.09

The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.


2. BHT의 항산화능 측정

BHT의 항산화능 조사결과, 35 μM의 H2O2만을 처리한 경우는 대조군에 비하여 세포생존율이 43.5% (0.81±0.17)로 나타난 반면, 30 μM과 40 μM의 BHT의 처리에서 각각 67.7% (1.26±0.09)와 75.3% (1.40±0.17)로 나타났다. 또한, 50 μM 농도의 BHT의 처리에서는 87.1% (1.62±0.13)로 나타났다(P<0.001) (Table 2). BHT 항산화능에 대한 사후검증결과 대조군, 50 μM BHT, H2O2 순으로 항산화능이 높았다. 50 μM BHT, 40 μM BHT, 30 μM BHT 간에는 통계적인 유의한 차이는 없었으나, 50 μM BHT, 40 μM BHT, 30 μM BHT 순으로 항산화능이 높았다. 또한 50 μM BHT는 대조군과도 통계적인 유의한 차이가 없었다.

The antioxidative ability of butylated hydroxytoluene (BHT) on hydrogen peroxide (H2O2) in cultured NIH3T3 fibroblasts

Concentrations of BHT (μΜ)XTT assay (450 nm)FPTukey HSD

Mean±SD
Controla1.86±0.2444.61<0.001a>c>b
35 H2O2b0.81 ±0.17
30c1.26±0.09
40d1.40±0.17
50e1.62 ±0.13

The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.


3. K2Cr2O7에 대한 BHT의 영향

K2Cr2O7의 세포독성에 대한 항산화제인 BHT의 영향을 조사한 결과, XTT50 농도의 K2Cr2O7만의 처리에서는 세포생존율이 대조군에 비하여 37.4% (0.65±0.06)로 나타난 것에 비하여 40 μM과 50 μM의 BHT의 처리에서는 각각 51.1% (0.89± 0.04)와 63.8% (1.11±0.09)로 나타났다(P<0.001) (Table 3). K2Cr2O7의 세포독성에 대한 BHT의 항산화 효과를 사후검증한 결과 대조군, 50 μM BHT, 40 μM BHT, K2Cr2O7 순으로 세포생존율이 높게 나타났다.

The effect of butylated hydroxytoluene (BHT) on the cytotoxicity induced by potassium dichromate (K2Cr2O7) in cultured NIH3T3 fibroblasts

Concentrations of BHT (μM)XTT assay (450 nm)FPTukey HSD

Mean±SD
Controla1.74±0.12244.07<0.001a>d>c>b
K2Cr2O7 (XTT50)b0.65±0.06
40c0.89±0.04
50d1.11±0.09

The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.


4. AP 추출물의 세포독성

AP 추출물에 대한 독성을 위하여 AP 추출물이 각각 110∼170 μg/mL로 포함된 배양액에서 배양한 결과 110 μg/mL와 130 μg/mL 처리에서는 세포생존율이 대조군인 100% (1.92± 0.16)에 비하여 95.8% (1.84±0.10)과 93.2% (1.79±0.13)로 각각 나타났다. 또한, 150 μg/mL와 170 μg/mL에서는 추출물 처리에서는 91.7% (1.76±0.15)와 88.5% (1.70±0.13) (P=0.033)로 각각 나타났다(Table 4). 따라서, 최대허용한계농도는 170 μg/mL 이상에서 나타나 본 실험에서는 170 μg/mL 이하의 농도를 사용하였다. AP 추출물의 세포독성에 대한 사후검증결과 대조군, 170 μg/mL AP 순으로 세포생존율이 높았다. 110 μg/mL AP, 130 μg/mL AP, 150 μg/mL AP는 통계적으로 유의한 차이는 없으나 110 μg/mL AP, 130 μg/mL AP, 150 μg/mL AP 순으로 세포생존율이 높았다. 110 μg/mL AP는 대조군과 150 μg/mL AP는 170 μg/mL AP와 통계적인 차이를 보이지 않았다.

The cytotoxicity of Agrimonia pilosa var. (AP) extract on cultured NIH3T3 fibroblasts by XTT assay

Concentrations of AP extract (μg/mL)XTT assay (450 nm)FPTukey HSD

Mean±SD
Controla1.92±0.162.960.033a>e
110b1.84±0.10
130c1.79±0.13
150d1.76±0.15
170e1.70±0.13

Cultured NIH3T3 fibroblasts were treated with AP extract at the concentrations of 110, 130, 150 and 170 μg/mL, respectively. The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.


5. AP 추출물의 함량 분석

AP 추출물의 함량조사에 있어서 폴리페놀(polyphenol)의 함량은 47.3 mg/g으로 나타났으며, 플라보노이드(flavonoid) 함량은 24.2 mg/g으로 각각 나타났다(Figure 1).

Fig. 1.

The component of Agrimonia pilosa var. (AP) extract. values are mean±SD. The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.


6. K2Cr2O7의 세포독성에 대한 AP 추출물의 영향

AP 추출물이 K2Cr2O7의 세포독성에 미치는 영향을 조사한 결과, K2Cr2O7의 처리에서는 세포생존율이 대조군에 비하여 41.4% (0.55±0.16)로 나타난데 비하여 130 μg/mL 추출물 처리에서는 50.4% (0.67±0.10)로 나타났다. 또한 150 μg/mL 추출물 처리에서는 71.4% (0.95±0.29)로 나타나 K2Cr2O7만의 처리에 비하여 유의한 증가를 보였다(P<0.001) (Table 5). AP 추출물이 K2Cr2O7의 세포독성에 미치는 영향에 대한 사후검증결과 대조군, 150 μg/mL AP, 130 μg/mL AP와 K2Cr2O7의 처리 순으로 세포생존율이 높은 것을 알 수 있었다.

The protective effect of Agrimonia pilosa var. (AP) extract on the cytotoxicity induced by potassium dichromate (K2Cr2O7) in cultured NIH3T3 fibroblaststs

Concentrations of AP extract (μg/mL)XTT assay (450 nm)FPTukey HSD

Mean±SD
Controla1.33±0.1427.30<0.001a>d>c, b
K2Cr2O7 (XTT50)b0.55±0.16
130c0.67±0.10
150d0.95±0.29

The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.


7. LDH 활성 측정

LDH 활성을 측정한 결과 130 μg/mL 농도처리에서는 활성이 대조군에 비하여 113.3% (2.21±0.22)로 나타났으며, 150 μg/mL의 처리에서는 102.6% (2.00±0.36)로 나타났다. 이는 K2Cr2O7만의 처리 134.9% (2.63±0.34)에 비하여 모두 유의한 감소를 보였다(P<0.001). 따라서, LDH 활성 저해능은 추출물 130 μg/mL 와 150 μg/mL 농도에서 K2Cr2O7 처리군에 비하여 각각 21.6%와 32.3%로 높은 저해능 보였다(Table 6). AP 추출물의 LDH 활성 측정에 대한 사후검증결과 대조군에 비해 150 μg/mL AP와 130 μg/mL AP, K2Cr2O7 처리 순으로 LDH 활성 저해능이 높은 것을 알 수 있었다.

The lactate dehydrogenase (LDH) activity of Agrimonia pilosa var. (AP) extract determined at a wavelength of 490 nm

Concentrations of AP extract (μg/mL)LDH activity (490 nm)FPTukey HSD

Mean±SD
Controla1.95±0.159.85<0.001a, d, c>b
K2Cr2O7 (XTT50)b2.63±0.34
130c2.21±0.22
150d2.00±0.36

The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.

Abbreviation: K2Cr2O7, potassium dichromate.


8. Superoxide anion-radical (SAR) 소거활성 측정

AP 추출물에 대한 SAR-소거활성 측정 결과, 130 μg/mL 추출물의 처리에서는 소거활성이 87.6% (1.34±0.13)로 나타났으며, 150 μg/mL의 처리에서는 73.9% (1.13±0.09)로 나타났다(P<0.001). 따라서, 소거능은 130 μg/mL 와 150 μg/mL에서 각각 12.4%와 26.1%로 대조군에 비하여 유의한 소거능을 나타냈으며, 특히 추출물 150 μg/mL의 농도에서는 양성대조군인 BHT 소거능인 81.7% (0.28±0.05)값의 30% 이상인 것으로 나타났다(Table 7, Figure 2). AP 추출물의 SAR-소거활성 측정에 대한 사후검증결과 대조군에 비해 BHT, 150 μg/mL, 130 μg/mL 순으로 높은 것을 알 수 있었다.

The superoxide anion-radical (SAR) scavenging activity of Agrimonia pilosa var. (AP) extract determined at a wavelength of 560 nm

Concentrations of AP extract (μg/mL)SAR scavenging activity (560 nm)FPTukey HSD

Mean±SD
Controla1.53±0.22123.92<0.001b>d>c>a
40 BHTb0.28±0.05
130c1.34±0.13
150d1.13±0.09

The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.

Abbreviation: BHT, butylated hydroxytoluene.


Fig. 2.

The superoxide anion radical (SAR)-scavenging ability of Agrimonia pilosa var. (AP) extract. values are mean±SD. The data indicate the mean±SD for triplicate experiments. ***P<0.001


고 찰

K2Cr2O7을 포함한 6가 크롬은 독성이 강하기 때문에 중독이 원인이 되고 있으며, 산업장에서 생활과 밀접한 관련이 있는 제조원료로 사용되고 있다. 또한 독성으로 인한 돌연변이성 물질로도 작용하고 있어 이의 취급 시 각별한 주의를 요한다[20]. 따라서, 본 연구에서는 K2Cr2O7의 세포독성을 조사하기 위하여 배양 NIH3T3 섬유모세포에 25∼35 μM 농도의 K2Cr2O7을 처리하였다. 그 결과 K2Cr2O7은 처리 농도에 비례하여 세포생존율이 유의하게 감소되었으며, XTT50 값이 100 μM 이하인 37.5 μM로 나타남으로서 Borenfreund와 Puerner [21]에 의한 독성판정기준에 근거하여 고독성(highly-toxic)인 것으로 나타났다. 이들은 약제의 독성을 XTT50값이 100 μM 이하인 경우는 고독성(highly-toxic), 100∼1,000 μM은 중간독성(mid-toxic), 1,000∼2,000 μM은 저독성(lower-toxic)으로 각각 판정하였다. 본 연구 결과는 K2Cr2O7과 같은 6가 크롬인 삼산화크롬(CrO3)의 독성을 배양 섬유모세포에서 보고한 연구 결과와도 일치하였다[5]. 이같이 K2Cr2O7이 배양 NIH3T3 섬유모세포에 독성을 나타낸 것은 K2Cr2O7이 세포내 DNA, RNA와 같은 핵산물질의 합성을 저해했거나[13], 세포내 단백질합성을 저해하여 세포손상을 유발했을 가능성도 배제 할 수는 없지만[22], 그 보다는 K2Cr2O7이 자유라디칼 생성에 의한 산화적 손상을 유발함으로서 세포독성효과를 나타냈을 가능성이 클 것으로 생각된다[19]. 따라서 본 연구에서는 K2Cr2O7의 산화적 손상과 세포독성 간의 상호 관련성을 조사하였다. K2Cr2O7의 독성과 산화적 손상과의 관련성을 조사하기 위하여 XTT50 농도의 K2Cr2O7을 세포에 처리하기 전 항산화제인 BHT를 배양 세포에 처리한 결과 세포생존율을 유의하게 증가시켰다. 본 실험의 결과는 BHT가 K2Cr2O7의 세포독성을 방어한 것으로써 K2Cr2O7의 세포독성은 산화적 손상이 관여되어 있음을 제시하고 있다. 또한, 본 실험 결과는 K2Cr2O7과 같은 6가 크롬인 CrO3에 대해 항산화제인 vitamin E가 독성을 방어하였다는 연구 보고와도 일치하였다[20]. 또한, K2Cr2O7의 세포독성에 대한 AP 추추물의 영향을 조사하기 위하여 AP 추출물이 130 μg/mL와 150 μg/mL의 농도로 포함된 각 배양액에서 세포를 전 배양한 결과 K2Cr2O7만의 처리에 비하여 처리 농도 모두에서 세포생존율의 증가를 보였으며 특히, 150 μg/mL의 농도에서는 유의한 증가를 보였다. 본 연구 결과는 AP 추출물이 K2Cr2O7의 독성을 방어한 것으로써 flavonoid나 saponin을 함유하고 있는 청미래덩굴 추출물이 K2Cr2O7과 같은 6가 크롬의 독성을 방어하였다는 연구 보고와 일치하였다[4]. 이같은 결과는 AP 추출물속에 함유된 폴리페놀류인 tannin이나 플라보노이드류인 saponin 및 항산화제인 vitamin C와 같은 성분들이 K2Cr2O7의 산화적 손상을 방어한 결과라고 생각된다. Tannin이나 Saponin [23] 및 vitamin C [13]와 같은 개개 성분의 효능이 이미 밝혀져 있으며, 특히 Jung 등[20]과 Kim 등[15]은, vitamin E가 크롬염의 일종인 CrO3의 산화적 손상을 방어하였다는 연구보고들이 이를 증명해 주고 있다. 차후 AP 추출물속의 각 성분에 대한 항산화 분석이 이루어져야 할 필요성이 있다고 생각되나, 본 연구에서는 위 각 성분에 대한 기능 보다는 오히려 이들이 속하고 있는 총폴리페놀류나 플라보노이드류의 함량에 대한 언급이 없어 이를 조사한 결과 각각 47.3 mg/g의 폴리페놀과 24.2 mg/g의 플라보노이드가 다량 함유된 것으로 측정되었다. 이는 Lee와 Seo [24]가 항산화능이 높은 지금초 추출물에서 조사한 51.2 mg/g과 26.5 mg/g과 거의 동일한 양적 수치를 나타냈다. 따라서, 본 연구의 성분분석에서와 같이 AP 추출물의 항산화 효과는 tannin이나 saponin 및 vitamin C가 속해 있는 플라보노이드나 폴리페놀의 강력한 항산화 작용의 영향인 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 AP 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위하여 LDH 저해능을 비롯하여 superoxide anion-radical (SAR) 소거능을 조사하였다. 먼저 LDH 활성 저해능에서 AP 추출물 130 μg/mL와 150 μg/mL의 농도의 처리에서는 K2Cr2O7만의 처리에 비하여 각각 21.6%와 32.3%로 모두 유의한 활성 저해능을 보였다. 본 실험 결과는 AP 추출물이 K2Cr2O7의 자유라디칼에 의한 막지질의 산화를 방어한 것으로 추출물의 항산화 작용이 있음을 말해 주고 있다. 이같은 항산화 효과는 AP 추출물의 항산화 성분들의 단독 또는 복합적인 작용 때문인 것으로 생각된다[9]. 특히, vitamin C와 같은 항산화 물질은 분자구조에 페놀화합물처럼 수산기(−OH)가 있어 타 물질과의 결합력이 매우 뛰어나 항산화를 비롯한 항염 등에 유효한 생리활성을 나타낸다[13]. 한편, SAR 소거능의 조사에 있어서, AP 추출물 130 μg/mL와 150 μg/mL의 농도의 처리에서는 대조군에 비하여 각각 12.4%와 26.1%로 모두 유의한 소거능을 보였다. 본 실험 결과는 AP추출물이 자유라디칼인 superoxide anion (O2)을 소거할 수 있는 항산화능이 있다는 것을 나타내고 있다. 이같은 항산화능은 AP 추출물속에 함유된 saponin이나 tannin 또는 vitamin C와 같은 폴리페놀류나 플라보노이드류 및 항산화 성분들의 상호작용 결과로 생각된다[9, 13].

요 약

크롬염의 일종인 중크롬산칼륨(K2Cr2O7)의 세포독성을 배양 NIH3T3 섬유모세포를 재료로 산화적 손상측면에서 조사하였으며, 또한 K2Cr2O7의 세포독성에 대한 짚신나물(Agrimonia pilosa var., AP) 추출물의 영향을 세포생존율을 비롯한 LDH 억제능 및 superoxide anion-radical (SAR) 소거능과 같은 항산화 측면에서 분석하였다. 본 실험에서 배양 NIH3T3 섬유모세포에 25∼35 μM의 K2Cr2O7을 각각 처리한 결과, 처리 농도에 따라 대조군에 비하여 세포생존율이 유의하게 감소되었으며, 이 때 XTT50값은 37.5 μM에서 나타나 고독성(highly-toxic)인 것으로 나타났다. 또한, 항산화제인 BHT는 K2Cr2O7의 세포독성을 유효하게 방어하였다. AP 추출물은 K2Cr2O7의 세포독성에 의하여 감소된 세포생존율을 유의하게 증가시킴으로서 세포독성을 방어하였다. 이와 동시에, AP 추출물은 LDH 활성 저해능을 비롯하여 SAR 소거능을 보임으로서 항산화 효과를 나타냈다. 위의 결과로부터 K2Cr2O7의 세포독성에 산화적 손상이 관여하고 있는 것을 확인하였고, AP 추출물은 K2Cr2O7의 독성을 항산화능에 의하여 효과적으로 방어하였다. 따라서, AP 추출물과 같은 천연성분은 크롬과 같은 산화적 손상과 관련된 독성을 방어할 수 있으므로 산화적 손상에 의한 질환 치료를 위한 물질로 활용적 가치가 크다고 사료된다.

Acknowledgements

This paper was supported by Wonkwang Health Science University in 2019.

Conflict of interest

None

Author’s information (Position)

Lee JH1, M.D.; Seo YM2, Professor.

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