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Evaluation of Absorption and Release, Survival Efficiency and Recovery Rate of Transport Medium according to the CLSI M40-A2 Standard
Korean J Clin Lab Sci 2019;51:164-170  
Published on June 30, 2019
Copyright © 2019 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Sung-Il Ha1,*, Hyun-Soo Suk1, Jeong-Seob Shin1, Woong Heo1, Kang-Gyun Park2, Yeon-Joon Park3

1Department of Laboratory Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul Saint Mary’s Hospital, Seoul, Korea,
2Department of Laboratory Medicine, The Catholic University of Korea, Uijeongbu Saint Mary’s Hospital, Uijeongbu, Korea,
3Department of Laboratory Medicine, The Catholic University of Korea, College of Medicine, Seoul, Korea
Correspondence to: Sung-Il Ha Department of Laboratory Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul Saint Mary’s Hospital, 222 Banpo-daero, Seocho-gu, Seoul 06591, Korea E-mail: hsi0708@hanmail.net
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

The absorption and release capacities, survival efficiency, and recovery rates of five kinds of transport media were evaluated based on the swab elution method (Quantitative) of CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) M40-A2. Liquid media showed mostly better results than semi-solid media in the three evaluations. The flocked swabs had better ability to absorption and discharge bacteria than the standard swabs. The liquid medium (S4) had the best survival efficiency. Pneumococcal strains with poor growth had a higher survival efficiency and recovery rate in liquid media (S4, S5). The results of microbial recovery showed that S. pyogenes met all the CLSI standards in all media. S. pneumoniae was inadequate in the semi- solid media (S2, S3) and all the remaining media met the criteria. H. influenzae was unsuitable in semi-solid media (S1, S3) and met the criteria in semi-solid medium (S2) and liquid medium (S4, S5). The viability of the H. influenzae, pneumococcal strain causing respiratory disease, was poor in most media. Overgrowth of P. aeruginosa was observed at room temperature. The combination of liquid medium and flocked swab confirmed the best results in the three evaluation methods.

Keywords : CLSI M40-A2, Flocked swab, Liquid media, Semi-solid media, Standard swab
서 론

임상 미생물 검사에서 감염원을 배양하기 위해 임상 검체의 적절한 운반은 검체 배양의 성공적인 평가에 영향을 미치는 가장 중요한 요인일 수 있다. 대다수의 검체는 미생물 검사실에 지연되어 도착하기 때문에 검체 내 미생물의 생존 가능성을 유지하는 것이 필수적이며, 24시간에서 48시간 동안 미생물의 생존성을 유지하는 것이 매우 중요하다[1, 2]. 그리고 수송배지에 사용되는 swab의 흡수 및 배출 능력 또한 중요한 요소로 작용한다[2].

수송배지 사용의 역사를 살펴보면 1893년 전선 끝에 거즈를 싸서 튜브에 넣고 열풍 살균하여 디프테리아에 감염된 것으로 의심된 환자 인두 점막에서 처음으로 사용한 것이다[3]. 그 이후 검체를 수송하기 위한 수송배지는 임균 수송을 목적으로 1948년 최초로 Stuart’s medium이 개발되었고, 그 이후에 Vibrio, Salmonella, Shigella 같은 장내세균 생존능력 향상을 위해 Cary-Blair medium이 개발되었다[4-6]. 그리고 마지막으로 현재 널리 사용되고 있는 Amies medium은 온타리오 공중 보건 연구소(Ontario Public Health Laboratories, PHL)의 의료 미생물학자인 C.R. Amies가 1967년에 임균의 회수율을 향상시키기 위해 Stuart’s 수송배지를 모방하여 개발한 것이다[7].

앞서 언급했듯이 현재 검체 채취 및 수송을 위한 수송배지의 발전은 크게 없었으면, 이에 대한 평가도 많이 존재하지 않아 대부분의 검사실이 예전부터 사용해 오던 면봉 수송배지가 wound, pus 등의 검체 채취 및 운송에 가장 광범위하게 사용되고 있다. 물론 현재 사용하고 있는 면봉 수송배지가 비교적 편리하고 비용이 저렴하지만 검체 내 미생물의 보존과 배양 양성률을 향상시키기 위해서는 현재보다 좀 더 나은 수송배지가 필요하였다. 그래서 좀 더 효율적이고 성능이 뛰어난 수송배지를 찾고자 평가를 진행하게 되었다.

재료 및 방법

1. 수송배지의 종류

평가에 이용된 수송배지는 3종류의 반유동 배지 AM608-2S™ (S1, Asan Co., Seoul, Korea), Transystem™ (S2, Copan Diagnostics Inc., Murrieta, CA, USA), N-Swab transport™ (S3, Noble Bio, Hwaseong, Korea), 2종류의 액체배지 eSwab™ (S4, Copan Diagnostics Inc., Murrieta, CA, USA), REST™ Swab transport (S5, Noble Bio, Hwaseong, Korea) 총 5종류를 비교 평가하였다(Table 1).

Composition and swab form of transport medium

Transport mediumTypeMediumSwab

TypeMaterial
AM608-2S™ (S1)Agar gelAmiesStandardCotton
Transystem™ (S2)Agar gelAmiesStandardRayon
N-Swab transport™ (S3)Agar gelAmiesStandardNylon
eSwab™ (S4)LiquidAmiesFlockedRayon
REST™ Swab transport (S5)LiquidAmiesFlockedNylon

2. 실험 방법

평가 방법은 48시간 동안 세균을 실온에 방치하여 임상적으로 중요한 세균의 흡수 및 배출, 생존 효율, 회수율을 시판되는 5종류의 수송배지를 CLSI M40-A2의 Swab elution method (Quantitative) 기준으로 평가하였다[3, 8, 9].

평가에 4종류의 표준 균주를 이용하였고(Table 2), 각각의 균주를 McF 0.5 탁도로 맞춘 후 1:10희석하여 희석된 균 부유액을 96 well plate에 100 μL를 분주하고, 균 부유액을 분주한 곳에 swab 넣고 10∼15초간 흡수시킨 후 swab을 다시 수송배지에 넣어 실온 방치하였다. 실온 방치는 0시간, 24시간, 48시간 하였고, 각각의 시간마다 3개의 수송배지를 사용하였고, 실온 방치 0시간은 수송배지를 실온에서 5∼15분 방치하여 검사에 이용한 것이다. 실온 방치한 수송배지에서 swab을 꺼내어 생리식염수 1 mL이 들어있는 튜브에 넣고 15초간 vortex 후 100 μL를 채취하여 균 부유액을 1.5×105∼101 CFU/mL까지 계단 희석을 수행하였다. 단, 액체배지는 그 상태로 15초간 vortex 후 100 μL를 채취하여 균 부유액을 1.5×105∼101 CFU/mL까지 계단 희석을 수행하였다. 각각의 농도별로 적절한 배지를 2개씩 선택하여 100 μL를 분주하여 멸균 spreader로 펴서 접종하였다. 세균의 배양 조건에 맞추어 48시간까지 배양하여 colony count를 실시하였다.

Growth conditions for M40-A2 test microorganisms

OrganismStrainInoculum (CFU/mL)MediumIncubation temperature (°C)Incubation atmosphere
Streptococcus pyogenesATCC 196151.5×1065% sheep blood agar35±25% CO2
Streptococcus pneumoniaeATCC 496191.5×1065% sheep blood agar35±25% CO2
Haemophilus influenzaeATCC 102111.5×106Chocolate agar35±25% CO2
Pseudomonas aeruginosaATCC 278531.5×1065% sheep blood agar35±2Aerobic

Abbreviations: ATCC, American Type Culture Collection; CFU, colony forming unit.


1) 균 흡수 및 배출에 대한 평가 방법

첫 번째 균 흡수 및 배출에 대한 평가는 96well plate에 그람 염색에 사용되는 Safranin O (SHOWA, Co., Gyoda, Saitama, Japan)를 100 μL를 넣고 각각의 swab을 흡수시킨 후 생리식염수가 들어있는 튜브에 넣고 vortex 전과 후를 육안으로 비교하였다.

두 번째 균 흡수 및 배출에 대한 평가는 5가지 균 부유액 농도를 이용하였고, 0 시간에서 triplicate 사용한 수송배지, duplicate로 접종한 배지, 총 6개 배지에서 자란 집락의 평균값을 기댓값과 비교 평가하였다.

2) 균 생존 효율 평가 방법

균 생존 효율 평가는 0시간을 기준으로 24시간, 48시간의 생존 효율을 백분율(%)로 평가 하였다. S. pneumoniae는 균이 잘 성장하지 않아 1.5×105 CFU/mL의 농도의 평균값을 기준으로 생존 효율을 평가하였고, S. pyogenes, H. influenzae는 1.5×104 CFU/mL 기준으로, P. aeruginosa는 과성장 되어 1.5×103 CFU/mL의 평균값을 기준으로 생존 효율을 평가하였다.

3) 균 회수율 평가 방법

균 회수율에 대한 수송배지 평가는 0시간과 48시간 배양 간의 집락 수 차이로 평가하였다. CLSI M40-A2 기준의 회수율을 평가하면 4 °C 또는 상온에서 0시간과 48시간에서 집락의 수가 3 로그 단위 감소보다 크면 부적합하다. 단, P. aeruginosa는 실온 방치에 대한 기준이 없고, 4°C 보관에 대한 기준만 있어 평가에서 제외하였다[3].

결 과

1. 균 흡수 및 배출에 대한 평가 결과

첫 번째 Safranin O를 이용한 균 흡수 및 배출에 대한 결과는 액체배지(S4, S5)의 flocked swab이 잘 배출되는 것을 확인하였고, standard swab에서는 반유동 배지(S1)가 다른 배지에 비하여 좋았으나, flocked swab보다는 좋지 않았다(Figure 1). 반유동 배지(S2, S3) swab 중 일부에서 Safranin O를 완전히 흡수되지 않는 경우가 있었지만 평가에 이용된 대부분 수송배지의 swab은 100 μL를 모두 흡수하였다.

Fig. 1.

In the absorption and release evaluation using Safranin O, the flock swabs (S4, S5) can be observed visually better than the standard swabs (S1, S2, S3).

Abbreviations: S1, AM608-2STM; S2, TransystemTM; S3, N-Swab transportTM; S4, eSwabTM; S5, RESTTM Swab transport.


두 번째 평가 결과를 보면 S. pyogenes는 농도별 기댓값에 비해 균수가 5∼10배 정도 낮았지만 반유동 배지(S1)와 액체배지(S4)에서 가장 우수한 결과를 보여 주었다. S. pneumoniae는 액체배지(S4, S5)가 타 배지보다 좋은 결과를 보였지만, 기댓값과 10배 정도 차이가 날 정도로 결과가 좋지 않았다. H. influenzae는 액체배지(S4, S5)를 제외한 나머지 배지는 기댓값에 비해서 집락 수가 10배 정도 차이가 있었으나, 액체배지(S4)는 기댓값과 거의 일치하였다. P. aeruginosa는 액체배지(S4)의 집락 수가 기댓값과 거의 일치하는 결과를 보였다(Table 3). 흡수 및 배출에 대한 평가 결과를 각 균마다 가장 우수한 결과를 보인 순서대로 순위를 매겨 확인한 결과 S. pneumoniae를 제외한 모든 균에서 액체배지(S4)가 가장 우수한 결과를 보였다(Table 4).

Absorption and release of microorganisms from five swab systems stored at room temperature

OrganismTransport systemConcentration of inoculation (CFU/mL)

1.5×105 (15,000)1.5×104 (1,500)1.5×103 (150)1.5×102 (15)1.5×101 (1.5)
S. pyogenesS1TNTC2202530
S219643610
S344135200
S4TNTC4604922
S547750600
S. pneumoniaeS1493000
S281000
S310513100
S44621011010
S58771582130
H. influenzaeS1TNTC1501320
S2TNTC102910
S330949500
S4TNTC1008200205
S5TNTC50210396
P. aeruginosaS1TNTC88610
S2TNTC911110
S325419510
S4TNTCTNTC123155
S5TNTC1921930

Abbreviations: TNTC, too numerous to count; CFU, colony forming unit.


Ranking of the evaluation results of absorption and release of five swab systems for each strain

OrganismSwab system

S1S2S3S4S5
S. pyogenes25413
S. pneumoniae45321
H. influenzae34512
P. aeruginosa43512
Rank34412

2. 균 생존 효율 평가 결과

24시간, 48시간 생존 효율 평가는 0시간을 기준으로 평가하였고, S. pyogenes는 모든 배지에서 48시간까지 생존하였다. 액체배지(S4)는 오히려 증식된 양상을 보였다. S. pneumoniae는 생존 효율이 좋지 않았고 반유동 배지(S3)에서 24시간까지 생존하였고, 액체배지(S4, S5)에서는 48시간까지 생존하였다. H. influenzae는 반유동 배지(S1, S3)에서 24시간, 48시간 생존하지 않았고, 반유동 배지(S2), 액체배지(S4, S5)에서 48시간까지 모두 생존하였다. P. aeruginosa는 5가지 배지 모두에서 48시간 모두 생존하였고 모두 과성장 되었다(Table 5).

Survival efficiency rate of microorganisms from five swab systems stored at room temperature

OrganismTransport systemSurvival efficiency rate of microorganisms (%)

0 hr24 hr48 hr
S. pyogenesS11007286
S210057
S31003423
S4100217217
S510012858
S. pneumoniaeS110000
S210000
S310080
S41001423
S51004925
H. influenzaeS110000
S2100210
S310000
S4100109115
S5100183
P. aeruginosaS110034675583
S210049817727
S31002407600
S4100658813
S51002473711

3. 균 회수율 평가 결과

S. pyogenes에서 액체배지(S4)는 균이 증식된 양상을 보였지만 모두 CLSI 기준에 적합하였다. S. pneumoniae는 48시간에 균이 자라지 않은 반유동 배지(S2, S3)를 제외하고, 반유동 배지(S1), 액체배지(S4, S5)는 기준에 부합하였다. H. influenzae는 48시간에 균이 자라지 않은 반유동 배지(S1, S3)를 제외하고 반유동 배지(S2), 액체배지(S4, S5)가 기준에 적합하였다(Table 6).

Recovery rate of microorganisms from five swab systems stored at room temperature

OrganismTransport systemBacterial recovery (CFU/mL)Log-unit changea

0 hr24 hr48 hr
S. pyogenesS1220160190-0.06
S24323-1.16
S335128-0.64
S4460100010000.34
S5506429-0.24
S. pneumoniaeS1311-0.48
S2100NA
S31310NA
S41011423-0.64
S51587839-0.61
H. influenzaeS115000NA
S2102210-1.01
S34900NA
S41008110411560.06
S55029016-1.50

The M40-A2 compliance criteria were no greater than a 3-log-unit decrease at 4°C or room temperature or a 1-log-unit increase for P. aeruginosa at 4°C only. The log-unit change was calculated as log (48 hr value)−log(time zero value).

Abbreviations: CFU, colony forming unit; NA, not applicable.


고 찰

흡수 및 배출에 대한 평가에서 액체배지(S4, S5)의 flocked swab이 상대적으로 standard swab보다 표면적이 넓어 더 잘 배출되는 것을 평가를 통해 확인하였다. Standard swab을 사용하는 3가지 반고체 배지는 0시간에서 적은 수의 균이 자랐고, flocked swab을 사용하는 2가지 액체배지는 높은 농도의 균이 성장하였다. 세균의 흡수 및 배출 효율은 액체배지와 flocked swab의 조합에서 우수한 결과를 보였다[10]. 이러한 결과는 swab 자체의 차이와 더불어 반유동 배지의 경우 배지에 많은 균들이 탈락되어 배출되지 못하여 결과에 영향을 주는 것으로 생각된다.

생존 효율 평가도 flocked swab과 액체 배지로 조합된 수송배지가 평가에서 가장 우수한 결과를 보여주었다. S. pneumoniae는 생존 효율이 좋지 않아 검체 배송이 지연되어 검체 접종이 이루어질 경우 액체배지(S4, S5)에 수송해야 양성률을 높이는데 유리할 것이다. H. influenzae 또한 생존 효율이 좋지 않아 반유동 배지(S2), 액체배지(S4)에 수송하는 것이 양성률을 높이는데 유리할 것이다. P. aeruginosa는 5종류 수송배지 모두에서 48시간 모두 생존하였고 모두 과성장 되었다[11]. 그중에서 액체배지(S4)는 과성장이 적어 우수한 결과를 보였다. 반대로 S. pyogenes는 액체배지(S4)에서 오히려 증식된 양상을 보였다[12, 13].

회수율에 대한 결과도 flocked swab과 액체배지로 조합된 수송배지가 평가에서 가장 우수한 결과를 보였다. S. pneumonia는 방치 시간에 따라 균수가 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 자가 용혈에 의한 것임을 의심할 수 있는 부분으로 상기도 및 하기도 폐렴의 원인균인 폐렴알균을 진단하기 위해서는 최대한 빠른 시간에 검체 접종이 이루어져야 하는 것을 이번 평가를 통해서 다시 한번 확인하였다. H. influenzae는 반유동 배지(S2), 액체배지(S4, S5)에서 회수율이 좋은 것으로 확인되었다. 공통점으로 동일 제조사의 배지 성분과 같은 재질의 swab과 액체배지를 사용한 것으로 확인되었다. Swab의 형태보다 재질(Rayon)이 더 중요한 역할을 하는 것을 추론해 볼 수 있고[14], 그리고 배지의 구성 성분이 H. influenzae 성장에 또 다른 역할을 하는 것으로 생각된다. 그래서 swab의 재질과 배지 조성에 따른 호흡기 계통의 감염 세균의 새로운 평가를 진행해 보았으면 한다.

본 평가에서와 같이 CLSI 기준 M40-A 기준 방법으로 상온 및 냉장 온도에서 수송배지를 0, 6, 24시간 및 48시간 동안 호기성 및 혐기성 미생물의 생존 효율을 비교한 결과에서도 액체배지(S4)와 유사하거나 동일한 제품이 다른 형태의 수송배지보다 우수한 결과로 본 평가와 동일한 결과를 보여 주었다[1, 9, 15].

이번 평가에서 많은 균주를 사용하지는 않았지만 배양 양성률을 높이고, 특히 2시간 이내에 검체 접종을 할 수 없는 경우 또는 검체가 방치되는 주말, 검체를 멀리까지 이동해야 하는 검사센터의 경우 현재 사용하고 있는 반유동 배지보다 가격적인 면에서 조금 비싸지만 검체의 질을 유지하고 세균배양 양성률을 높이고, 좋은 미생물 결과를 보고하기 위해서는 액체배지와 flocked swab으로 조합된 수송배지로 교체하여 사용하는 것이 필요할 것으로 사료된다. 이번 평가에서 일부 반유동 배지에서 균이 너무 자라지 않아 일부 재평가가 필요해 보인다. 그리고 추가적으로 혐기성 세균과 실질적으로 검사가 이루어지지 않는 경우, 검체를 보관하는 냉장 온도에 대한 평가도 함께 이루어져야 할 것이다.

요 약

5종류의 수송배지를 흡수 및 배출 능력, 생존 효율, 회수율을 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) M40-A2의 Swab elution method (Quantitative) 기준으로 평가하였다. 액체배지가 반유동 배지보다 3가지 평가에서 대부분 우수한 결과값을 보여주었다. Flocked swab이 standard swab 형태보다 균의 흡수 및 배출의 능력 또한 우수하였다. 생존 효율에 대한 평가 결과는 액체배지(S4)가 가장 우수한 결과값을 보였다. 성장이 좋지 않은 S. pneumoniae는 액체배지(S4, S5)에서 생존 효율과 회수율이 높았다. 균 회수율 평가 결과는 S. pyogenes는 모든 배지에서 CLSI 기준에 적합하였다. S. pneumoniae는 반유동 배지(S2, S3)에서 부적합하였고, 나머지 배지는 모두 기준에 적합하였다. H. influenzae는 반유동 배지(S1, S3)에서 부적합하였고, 반유동 배지(S2), 액체배지(S4, S5)에서 기준에 적합하였다. 호흡기 질환을 유발하는 S. pneumonia, H. influenzae의 생존 능력은 대부분의 배지에서 좋지 않았다. P. aeruginosa는 실온에서 과성장이 관찰되었다. 액체배지와 flocked swab의 조합이 3가지 평가 방법에서 가장 뛰어난 결과를 평가를 통해 확인하였다.

Acknowledgements

None

Conflict of interest

None

Author’s information (Position)

Ha SI1, M.T.; Suk HS1, M.T.; Shin JS1, M.T.; Heo W1, M.T.; Park KG2, M.T.; Park YJ3, M.D.

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