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Silymarin Attenuates Invasion and Migration through the Regulation of Epithelial-mesenchymal Transition in Huh7 Cells
Korean J Clin Lab Sci 2018;50:337-344  
Published on September 30, 2018
Copyright © 2018 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Do-Hoon Kim1, So-Jeong Park1, Seung-Yeon Lee1, Hyun-Seo Yoon2, and Chung Mu Park1

1Department of Clinical Laboratory Science, Dong-Eui University, Busan, Korea,
2Department of Dental Hygiene, Dong-Eui University, Busan, Korea
Correspondence to: Chung Mu Park Department of Clinical Laboratory Science, Dong-Eui University, 176 Eomgwang-ro, Busanjin-gu, Busan 47340, Korea Tel: 82-51-890-2685 Fax: 82-505-182-6877 E-mail: cmpark@deu.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC), a major type of hepatoma, is associated with high recurrence and mortality because of its uncontrolled metastatic feature. Silymarin is a polyphenolic flavonoid from Silybum marianun (milk thistle) and exhibits anti-carcinogenic activity through modulation of the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in several cancer cells. In this study, the inhibitory mechanism of silymarin against migration and invasion was investigated in the Huh7 HCC cell line. Wound healing and in vitro invasion assays were conducted to examine the effects of silymarin on migration and invasion. Western blot analysis was also applied to evaluate the inhibitory effects of silymarin on the EMT-related genes and their upstream signaling molecules. Silymarin inhibited the migratory and invasive activities of Huh7 cells. In addition, silymarin attenuated the protein expression levels of vimentin and matrix metalloproteinase (MMP)-9 as well as their transcription factors, Snail, and nuclear factor (NF)-κB, while the expression of E-cadherin was increased by the silymarin treatment. Among the upstream signaling molecules, the phosphorylation of Akt was inhibited by the silymarin treatment, which was confirmed by the selective inhibitor, LY294002. Consequently, silymarin inhibited the invasive and migratory activities in Huh7 cells through the modulation of EMT-related gene expression by the PI3K/Akt signaling pathway, which may have potential as a chemopreventive agent against HCC metastasis.

Keywords : Epithelial-mesenchymal transition, NF-kappa B, Silymarin, Snail family transcription factors
서론

원발암에서 전이를 시도하는 암세포의 중요한 특징 중 하나는 상피간엽전환(epithelial-mesenchymal transition, EMT)으로 상피세포가 간엽세포로 바뀌는 것을 말한다. 그 과정에서 상피세포는 세포간 부착능력을 잃고 유리세포로 바뀌면서 침투성을 동시에 얻어 간엽세포로 분화하게 된다[1]. EMT는 정상적인 조직의 발달과 염증의 유발, 암세포의 전이에 관련된 것으로 알려져 있다[2]. 특히, EMT는 전이가 발생하는 암의 진행 단계에서 나타나는 두드러진 특징으로 상피세포는 상피-상피간 혹은 상피-기질간 부착단백질이 존재하고 극성이 보이지만 중간엽세포는 개개의 세포로 떨어져서 움직이고 극성을 보이지 않는다. 이러한 중간엽 세포의 특성을 보이는 세포는 상피내암세포보다 항암제에 강한 저항성을 보이고 전이능 또한 높아지게 된다[3]. EMT의 중요한 과정 중 하나는 E-cadherin이 N-cadherin으로 전환되는 cadherin switch로 세포간 부착단백질인 E-cadherin이 소실되고 N-cadherin이 세포표면에 활성화된다. 그리고 cadherin의 활성화와 관련된 matrix metalloproteinase (MMP)-9과 중간엽줄기세포의 특징인 vimentin 또한 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다[4]. 이들의 발현 조절 과정에서 전사인자인 Snail과 nuclear factor (NF)-κB가 증가하였고, 특히 Snail은 E-cadherin을 억제하고 침윤도를 높이는 것으로 밝혀졌다[5]. 따라서 Snail과 NF-κB의 조절을 통해 EMT 관련 유전자의 발현을 조절하면 암세포의 전이능을 조절할 수 있을 것으로 생각된다.

실리마린은 엉겅퀴(Silybum marianun, milk thistle)에서 추출한 polyphenolic flavonoid로서 silybinin을 주성분으로 하며 기타성분으로는 silybin, dihydrosibilyn, silydianin, silychristin 등이 있는 것으로 알려져 있다[6-9]. Silymarin은 항산화효과, 지질과산화 억제효과 등으로 인해 간 보호효과가 있고, 간세포막의 독성물질이 수용체와 결합 후 세포막을 파괴하는 작용을 방해함으로써 세포를 안정시켜 간세포를 보호하기도 하며 혈중지단백의 대사를 정상화함으로써 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 효과가 있는 것으로 보고되었다[10]. 특히, silymarin은 non-small cell lung carcinoma, prostate cancer, bladder cancer 등 다양한 암세포에서 EMT 조절을 통해 항암효과를 보이는 것으로 보고되었으나 간세포암에서는 그 효과가 보고되지 않았으므로 본 논문에서는 그 활성을 분석하고자 하였다[7, 9, 11].

재료 및 방법

1. 세포배양 및 시료

실험에 사용한 Huh7 cell (human hepatocellular carcinoma)은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양 받았고, 10%의 fetal bovine serum (FBS, Hyclone, South Logan, UT, USA), Penicillin/Streptomycin (Hyclone)이 포함된 DMEM배지를 사용하여 37°C, 5% CO2, 가습된 조건에서 배양하였다. Silymarin, dimethyl sulfoxide (DMSO), and sodium dodecyl sulfate (SDS)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Western blot을 위한 E-cadherin (clone 24E10, mAb), vimentin (clone D21H3, mAb), MMP-9 (clone D6O3H, mAb), Snail (clone C15D3, mAb), p-p65 (clone 93H1, mAb), phospho-Akt (clone D9E, mAb), Akt (clone C67E7, mAb), phospho-extracellular signal-regulated kinase (p-ERK, clone D13.14.4E, mAb), ERK (clone 137F5, mAb), phospho-c-Jun NH2-protein kinase (p-JNK, clone 81E11, mAb), JNK (pAb), phospho-p38 (clone D3F9, mAb), p38 (clone D13E1, mAb), actin (clone 13E5, mAb)등에 대한 1차 항체는 토끼를 호스트로 하여 제조된 것을, 2차 항체인 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG는 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)에서 모두 구입하여 1:1,000의 비율로 희석하여 분석에 사용하였다.

2. 세포독성 평가

세포생존율은 EZ-Cytox cell viability assay kit (Daeil lab service, Seoul, Korea)을 사용하여 측정하였다. Huh7 cell을 24 well plate에 1×105 cell/well의 농도로 파종한 후 24시간동안 배양하고 silymarin을 농도별로 처리하였다. 그 후 24시간 배양하고 EZ-Cytox 시약 10 μL를 첨가하여 1시간 동안 배양한 후 microplate reader (Benchmark Plus, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 480 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. Western blot 분석

Huh7 cell은 100 mm dish에 5×106 cells/dish의 농도로 파종하고 24시간동안 배양한 후 silymarin을 농도별로 처리한 후 다시 24시간동안 배양하였다. 시료 처리가 끝난 세포는 PBS로 2회 세척하고 0.5 mL의 단백질 추출 용액(PRO-PREP, Intron Biotechnology, Seongnam, Korea) 으로 수확한 후 얼음에 10분동안 정치하여 세포를 용해하였다. 용해된 세포가 포함된 단백질 추출 용액은 13,000 ×g에서 5분동안 원심분리한 후 분리된 상층을 새 튜브로 옮겨 분석에 사용하였다. 단백질 농도는 Bradford법으로 정량하였다. 분리한 단백질 50 μg이 포함된 시료를 준비하여 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후 polyvinylidene fluoride membrane (PVDF, Bio-rad)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 PVDF membrane은 5% 탈지분유를 TBST에 녹인 용액으로 1시간동안 실온에서 블로킹을 진행하였다. 블로킹 반응이 끝난 membrane은 1:1,000으로 희석한 1차 항체와 섞은 후 4°C에서 24시간동안 보합반응을 하였다. 1차 항체와의 보합반응이 끝난 membrane은 TBST로 3회 세척 후 다시 1:1,000으로 희석한 2차 항체와 실온에서 2시간동안 보합반응을 하였다. 2차 항체까지 반응이 끝난 후 enhanced chemiluminescence solution (ECL, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)을 이용하여 반응을 유도한 후 ECL sensitive film에 감광시켜 단백질의 발현 변화를 측정하였고 Gel Doc EQ system (Biorad)으로 정량 분석하였다.

4. Wound healing 분석

Huh7 cell을 6 well plate에 3×105 cell/well의 농도로 파종 후 24시간동안 배양하여 세포가 plate에 부착되도록 하였다. 그 후 10 μL pipet tip을 이용하여 plate의 바닥을 일자로 긁어 wound를 만들었다. Silymarin을 농도별로 처리한 후 24, 48시간동안 배양하면서 시간별로 세포가 이동한 정도를 현미경으로 관찰하여 결과를 비교하였다.

5. In vitro invasion 분석

Huh7 cell을 invasion이 가능한 용기의 transwell (8 μm pore, Corning Inc, Corning, NY, USA) 위쪽에 silymarin과 함께 1×105 cell/well의 농도로 분주 후 24시간동안 배양하였다. 24시간 후 위쪽에 남아있는 세포는 면봉으로 제거 후 transwell membrane의 하단으로 침투한 세포는 crystal violet으로 염색하여 확인하였다.

6. 통계 분석

3회 반복 시행한 모든 실험 결과는 SPSS 통계 프로그램(version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균± 표준편차(mean ±SD)로 나타내었다. 실험군 간의 유의성 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였고, Duncan’s multiple range test 방법으로 사후 검증을 시행하였다. 대조군과 실험군 사이의 비교에는 t-test를 사용하였고, P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

결과

1. Silymarin에 의한 Huh7 cell의 cell migration 억제 효과

Silymarin이 간세포암 세포주인 Huh7 cell의 침윤과 전이에 미치는 영향을 알아보기 위하여 silymarin이 cell migration에 미치는 효과를 분석하였다. 먼저 silymarin이 Huh7 cell에 미치는 세포 독성 효과를 알아본 결과 Figure 1에서 보는 바와 같이 silymarin을 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 24시간 처리했을 때 50, 100 μg/mL에서 10, 20%가량 세포생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 wound healing assay, in vitro invasion assay의 silymarin 50, 100 μg/mL 실험군에는 Huh7 cell을 10, 20% 더 파종하여 세포독성에 의한 효과를 상쇄하고자 하였다. Huh7 cell은 세포 자체가 가지는 침윤ㆍ전이능으로 인해 강한 cell migration과 invasion activity를 보였다 [12]. Huh7 cell이 파종된 6-well plate에 pipet tip으로 scratch를 만든 후 silymarin을 처리한 결과 Figure 2A에서 보는 것과 같이 Huh7 cell의 migration에 의해 24시간, 48시간이 경과함에 따라 wound healing이 이루어졌으나 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 silymarin을 처리한 세포의 경우에는 migration이 현저히 떨어져 wound healing이 제대로 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 이 결과를 바탕으로 in vitro에서 침윤을 억제하는 효과가 있는지의 여부를 8 μm의 pore size를 가진 transwell membrane을 이용하여 분석하였다. Figure 2B에서 보는 바와 같이 시료를 처리하지 않은 세포의 경우 transwell membrane을 통과하여 chamber의 아래쪽으로 많은 수의 세포가 이동한 것과 달리 silymarin을 처리한 세포의 경우 이동한 세포의 수가 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 미루어보아 silymarin은 Huh7 cell의 cell migration과 in vitro에서의 침윤을 억제할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1.

Cytotoxic effect of silymarin in Huh7 cells. Huh7 cells were treated with indicated concentrations of silymarin for 24 hours. Cell viability was estimated by a WST assay. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. *P<0.05 vs untreated control.


Fig. 2.

Inhibitory effect of silymarin on cell migration (A) and in vitro invasion (B) in Huh7 cells. Wound healing (A) and in vitro invasion (B) assays were conducted with indicated concentrations of silymarin for 24 and 48 hours in Huh7 cells.


2. Silymarin에 의한 EMT 관련 유전자 발현 조절

Wound healing assay와 in vitro invasion assay 결과, silymarin은 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 활성이 있는 것으로 판단할 수 있었다. 그러므로 silymarin이 EMT 관련 유전자의 조절을 통해 이러한 활성을 보이는지를 확인하기 위하여 Huh7 cell내에서 발현되는 관련 단백질의 발현을 western blot analysis를 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 EMT 관련 유전자 중 세포 표면 단백질인 E-cadherin, 세포외 기질을 분해하는 효소인 MMP-9과 중간엽세포의 지표인 vimentin을 분석하였다. E-cadherin은 인접한 세포의 E-cadherin 분자와 부착하여 세포간 강한 결합을 유지하고 세포의 극성을 유지하는 역할을 한다. 그러나 종양세포에서 EMT과정이 진행되면 E-cadherin의 발현이 줄어들고 상피세포간 이음부가 느슨해지면서 MMP의 활성에 의해 세포외기질이 분해됨에 따라 상피세포가 간질로 이동할 수 있게 된다[13]. 더불어 EMT가 진행될수록 종양세포는 상피세포보다 전이에 유리한 줄기세포의 특성을 강하게 보이게 되고 이 때 특징적으로 발현되는 단백질이 vimentin이다[14]. 이들을 분석한 결과 Figure 3에서 보는 바와 같이 silymarin의 처리에 의해 농도의존적으로 E-cadherin의 발현은 증가하고 vimentin은 감소하는 결과를 볼 수 있었다. 또한, 세포외기질을 분해하여 종양세포의 전이를 돕는 MMP-9의 활성 또한 silymarin의 처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 세포 내 여러 전사인자 중 Snail과 NF-κB는 EMT가 진행되는 동안 활성이 증가함으로써 종양세포의 침윤과 전이활성을 높이는 것으로 보고되고 있고[5], 본 실험에서 이 두 전사인자의 활성은 silymarin에 의해 유의적으로 억제되었다(Figure 4). 이러한 결과로 미루어보아 silymarin은 E- cadherin 증가와 vimentin의 활성을 억제하여 Huh7 cell의 EMT 유도를 효과적으로 저해하고, 종양세포 주변 세포외기질의 재구성에 관여하는 효소인 MMP-9의 활성을 억제함으로써 종양세포의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 이러한 EMT 관련 유전자들의 발현 조절은 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성 억제를 통한 것임을 알 수 있었다.

Fig. 3.

Silymarin inhibited expression of E-cadherin, vimentin, and MMP-9 in Huh7 cells. Panel A shows the protein expression levels of E-cadherin, vimentin, and MMP-9 by silymarin. All signals were normalized to the protein level of actin, an internal control, and expressed as a ratio (Panel B). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. *P<0.05, **P<0.005 vs untreated control.


Fig. 4.

Silymarin inhibited the expression of Snail and p-p65 in Huh7 cells. Panel A shows the protein expression levels of Snail and p-p65, one subunit of NF-κB, by silymarin. All signals were normalized to the protein level of Actin, an internal control, and expressed as a ratio (Panel B). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range tests. *P<0.05, **P<0.005 vs untreated control.


3. 상위신호전달체계의 조절을 통한 Silymarin의 EMT 유전자 발현 조절

다양한 세포외부의 자극을 세포 내부로 전달하는 역할을 하는 신호전달 물질 중 mitogen activated protein kinases (MAPKs)와 PI3K/Akt는 세포의 증식, 분화, 사멸을 포함한 여러가지 세포의 활성을 매개하는 serine/threonine kinase이다. 특히 이들은 leptin으로 유도된 간세포암의 성장, 침윤과 전이에 관련된 것으로 보고되기도 하였다[15]. 따라서 본 연구에서는 Huh7 cell의 EMT관련 유전자 조절에 어떤 신호전달물질이 관여하고, silymarin에 의해 조절되는지의 여부를 분석하였다. 실험 결과 Figure 5에서 보는 바와 같이 silymarin이 ERK, JNK, p38의 인산화에는 영향을 주지 못하였으나 Akt의 인산화는 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 silymarin이 PI3K/Akt 신호전달경로를 통해 EMT 관련 유전자를 조절하는지 검증하기 위하여 PI3K의 선택적 저해제인 LY294002를 20 μM로 처리한 후 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현정도를 분석한 결과 Figure 6에서 보는 것과 같이 EMT 관련 유전자들의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자를 조절함으로써 Huh7 cell의 전이와 침윤을 억제하는 것으로 생각된다.

Fig. 5.

Silymarin inhibited phosphorylation of Akt in Huh7 cells. Panel A shows the protein expression levels of p-Akt, p-ERK, p-JNK and p-p38 by silymarin. All signals were normalized to protein levels of Akt, ERK, JNK and p38, internal controls, and expressed as a ratio (Panel B). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. *P<0.05, **P<0.005 vs untreated control.


Fig. 6.

Silymarin inhibited EMT-related genes expression depends on PI3K/Akt signaling pathway in Huh7 cells. Twenty microliters of a selective inhibitor of PI3K was treated in Huh7 cells(A). Protein expression of E-cadherin, vimentin, and MMP-9 was analyzed by Western blot analysis. The data are representative of three independent experiments. (B) The relative induction of EMT-related genes expression was quantified by densitometry and actin was used as an internal control. The data represent the mean±standard deviation of triplicate experiments. *P<0.05, **P<0.005 vs untreated control.


고찰

우리나라에서 발생하는 악성 신생물 중 간암은 인구 10만명당 30.9명이 발생하여 6위에 해당하지만, 사망률은 폐암에 이어 두번째로 높은 21.5명에 이르는 것으로 보고되고 있다[16]. 조직학적으로는 간암 전체 발생 건수 가운데 암종이 96.6%, 육종이 0.2%를 차지하고 암종 중에서 간세포암이 76.2%로 가장 많았다[17]. 특히 간세포암은 간 절제술 등의 치료 후에 높은 재발율로 인해 예후가 매우 불량한 것으로 알려져 있다[18]. 이러한 높은 재발율은 간암의 전치절제 후 남아 있는 간조직에서 발생하고 이렇게 발생한 암은 전체 재발 암의 75%를 차지한다. 절제 후 초기에 재발하는 암은 주로 간내 전이로부터 발생되고 후기 재발 암은 다발성 발암과정으로 인해 발생하는 것으로 보고되고 있다[19, 20]. 따라서, 본 연구에서는 간염의 치료에 효과적인 것으로 알려진 silymarin이 EMT 조절을 통해 간세포암의 침윤과 전이를 억제하는지를 밝히고자 하였다. 분석 결과 Huh7 cell의 운동성에 의해 시간이 경과함에 따라 wound healing이 이루어졌으나 silymarin을 처리한 세포는 운동성이 현저히 떨어져 wound healing이 제대로 일어나지 않았다. In vitro invasion assay에서도 silymarin을 처리한 세포의 이동이 현저히 억제되는 것을 볼 수 있었고 이 결과를 바탕으로 silymarin이 HCC인 Huh7 cell의 세포 운동성을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다. 그리고 silymarin에 의해 억제된 Huh7 cell의 운동성이 침윤과 전이를 억제하는지를 확인하기 위하여 EMT와 관련된 전이와 침윤 단백질의 발현을 분석하였다. EMT의 중요한 과정 중 하나는 E-cadherin이 N-cadherin으로 전환되는 cadherin switch로서 세포간의 부착을 유도하는 세포표면단백질인 E-cadherin이 소실되면서 N-cadherin이 활성화되는 과정이다. 이 cadherin switch를 조절하는데 MMP의 활성이 중요한 것으로 알려져 있고, E-cadherin의 활성을 잃은 암줄기세포 유사 세포는 MMP에 의해 분해된 세포외기질을 통해 간질로 이동할 수 있게 된다[13]. MMP는 종양미세환경 조절에 중요한 역할을 하는 효소로서 세포외기질을 분해하여 조직내에서 종양세포가 움직일 수 있는 공간을 확보하고, 세포간 부착단백질인 E-cadherin을 분해하여 종괴에서 종양세포가 떨어질 수 있도록 할 뿐만 아니라 integrin을 활성화하여 다른 조직에 부착할 수 있는 능력을 높이는 역할을 한다. 암줄기세포(cancer stem cell)의 기원은 정확하게 알려져 있지 않지만, 상피세포를 tumor growth factor (TGF)-β 자극하여 EMT를 유도하였을 때 종양줄기세포와 유사한 표현형을 보이므로 EMT의 진행이 암줄기세포의 생성에 관여되어 있는 것으로 생각하고 있다 [21]. 또한 중간엽줄기세포의 주요한 특성 중 하나이고 상피세포에서는 발현되지 않는 것으로 알려져 있는 vimentin은 흑색종에서 처음으로 과발현과 암의 전이가 관련이 있음이 보고된 이후 유방암, 자궁경부암, 신장암, 전립선암, 간세포암에서도 동일한 결과가 보고되었다[22]. EMT 과정에서 발현되는 vimentin은 세포골격 단백질인 actin과 다른 중간섬유들과의 상호 작용을 통한 연속적인 형태 변화와 재구성에 필수적인 단계로 이해되고 있고, 이러한 이유로 인해 vimentin이 전이능과 관련이 있을 것으로 생각된다[14].

EMT가 유도될 때 발현이 증가되는 전사인자로 Snail, Twist, zinc-finger E-box-binding (ZEB)이 있고 이들은 상피세포의 표현형인 E-cadherin을 억제하고 중간엽세포의 표현형인 vimentin을 활성화 할 뿐만 아니라 종양주변의 ECM을 재구성하는데 관여하는 MMP의 활성도 촉진하는 것으로 보고되고 있다[5]. 뿐만 아니라 염증과 관련된 인자들을 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 NF-κB 또한 EMT과정에서 상기의 전사인자들과 같은 역할을 하는 것으로 알려지고 있다[4]. 특히, Hsieh 등[12]의 연구에 의하면 간세포암세포주에서 NF-κB와 activator protein (AP)-1의 조절을 통해 MMP-9의 활성을 억제함으로써 침윤과 전이를 억제한다고 보고하였다. 본 연구에서 E-cadherin과 vimentin을 분석한 결과 silymarin에 의해 농도의존적으로 E-cadherin은 증가하고 vimentin과 MMP-9는 억제되었다. 그리고 이들의 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성 또한 silymarin에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 silymarin은 Huh7 cell의 EMT 유도와 MMP-9의 활성을 조절함으로써 HCC의 침윤을 억제하였고 이것은 Snail과 NF-κB를 통한 것임을 알 수 있었다.

MAPKs는 현재까지 비교적 잘 알려진 신호 전달기전으로 ERK, JNK, p38 MAPK 세 효소들이 superfamily에 포함된다. 이들 MAPKs는 세포의 증식, 분화, 침윤, 전이와 세포 사멸등과 같은 다양한 세포외 자극을 세포 내부의 반응으로 전달하거나 매개하는 역할을 한다. 최근의 연구에서는 암세포의 전이와 침윤을 조절과 관련있는 것으로 보고되기도 하였다[23, 24]. 특히 silymarin의 주요 활성 성분 중 하나인 silibinin은 human lung cancer cell인 A549 cell line, human breast cancer cell인 MCF-7 cell line, human osteosarcoma cell인 MG63 cell line, prostate cancer cell 등의 다양한 암세포주에서 MAPKs 조절을 통해 전이와 침윤에 영향을 주는 여러 단백질들의 활성을 억제하는 결과를 보여왔다[6, 25, 26]. Silymarin의 침윤과 전이 억제 기전을 분석한 결과 Akt의 인산화가 억제되는 것을 확인하였고 이는 선택적 저해제를 활용한 분석에서 검증되었다. 이 결과로 미루어보아 silymarin은 E-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현과 이들의 전사인자인 Snail과 NF-κB의 활성을 억제하여 간세포암인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 저해하는 것으로 나타났다. 그리로 이들의 상위신호전달물질을 분석한 결과 PI3K/Akt 신호전달체계로 인한 것임을 알 수 있었다.

요약

발생하는 간암 중 가장 주요한 형태인 간세포암은 강한 전이특성으로 인해 높은 재발율과 사망률을 보인다. Silymarin은 엉겅퀴에서 추출한 플라보노이드 성분으로 여러 암세포주에서 상피간엽전환(epithelial mesenchymal transition, EMT) 조절을 통해 항암효과를 보이는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 silymarin이 EMT의 조절을 통해 간세포암 세포주인 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는지를 분석하고자 하였다. Huh7 cell의 침윤과 전이 활성을 분석하기 위하여 wound healing assay와 in vitro invasion assay를 시행하였고 EMT 관련 유전자와 상위 신호전달물질의 발현 분석을 위해 Western blot assay를 실시하였다. 그 결과 silymarin은 농도 의존적으로 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하였다. EMT 관련 유전자 중 세포 부착 단백질인 E-cadherin은 증가하였으나, 중간엽세포의 지표인 vimentin, 종양미세환경 조절에 관여하는 MMP-9의 발현은 억제되었고 이들의 활성에 관여하는 전사인자인 Snail과 nuclear factor (NF)-κB 또한 농도 의존적으로 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상위신호전달물질 중 silymarin은 phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt의 인산화 억제를 통해 EMT 관련 유전자들을 조절하는 것으로 나타났고 이것은 selective inhibitor인 LY294002의 처리 결과로 확인할 수 있었다. 결과적으로, silymarin은 PI3K/Akt 경로를 통해 EMT 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 Huh7 cell의 침윤과 전이를 억제하는 것으로 생각된다. 이를 통해 silymarin이 간세포암의 전이 억제에 효과적인 항암물질의 후보가 될 수 있는 잠재력을 가진 후보물질이 될 수 있음을 보여주었다.

Acknowledgements

The research was supported by Undergraduate Research Program through the Korean Foundation for the Advancement of Science and Creativity funded by the Ministry of Education in 2017.

Conflict of interest

None

References
  1. Zeisberg M, and Neilson EG. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions. J Clin Invest 2009;119:1429-1437.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  2. Thiery JP, Acloque H, Huang RY, and Nieto MA. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell 2009;139:871-890.
    Pubmed CrossRef
  3. van Zijl F, Zulehner G, Petz M, Schneller D, Kornauth C, and Hau M et al. Epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma. Future Oncol 2009;5:1169-1179.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  4. Lamouille S, Xu J, and Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol 2014;15:178-196.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  5. Kim SM, Han JH, and Park SM. The role of epithelial-mesenchymal transition in the gastroenterology. Kor J Gastroenterol 2010;56:69-77.
    CrossRef
  6. Chen PN, Hsieh YS, Chiou HL, and Chu SC. Silibinin inhibits cell invasion through inactivation of both PI3K-Akt and MAPK signaling pathways. Chem Biol Interact 2005;156:141-150.
    Pubmed CrossRef
  7. Cufí S, Bonavia R, Vazquez-Martin A, Corominas-Faja B, Oliveras-Ferraros C, and Cuyàs E et al. Silibinin meglumine, a water-soluble form of milk thistle silymarin, is an orally active anti-cancer agent that impedes the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in EGFR-mutant non-small-cell lung carcinoma cells. Food Chem Toxicol 2013;60:360-368.
    Pubmed CrossRef
  8. Deep G, and Agarwal R. Antimetastatic efficacy of silibinin: molecular mechanisms and therapeutic potential against cancer. Cancer Metastasis Rev 2010;29:447-463.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  9. Deep G, Gangar SC, Agarwal C, and Agarwal R. Role of E-cadherin in antimigratory and antiinvasive efficacy of silibinin in prostate cancer cells. Cancer Prev Res (Phila) 2011;4:1222-1232.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Skottova N, Krecman V, and Simanek V. Activities of silymarin and its flavonolignans upon low density lipoprotein oxidizability in vitro. Phytother Res 1999;13:535-537.
    CrossRef
  11. Wu K, Ning Z, Zeng J, Fan J, Zhou J, and Zhang T et al. Silibinin inhibits ?-catenin/ZEB1 signaling and suppresses bladder cancer metastasis via dual-blocking epithelial-mesenchymal transition and stemness. Cell Signal 2013;25:2625-2633.
    Pubmed CrossRef
  12. Hsieh MJ, Lin CW, Yang SF, Chen MK, and Chiou HL. Glabridin inhibits migration and invasion by transcriptional inhibition of matrix metalloproteinase 9 through modulation of NF-κB and AP-1 activity in human liver cancer cells. Br J Pharmacol 2014;171:3037-3050.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Guarino M, Rubino B, and Ballabio G. The role of epithelial-mesenchymal transition in cancer pathology. Pathology 2007;39:305-318.
    Pubmed CrossRef
  14. Hu L, Lau SH, Tzang CH, Wen JM, Wang W, and Xie D et al. Association of vimentin overexpression and hepatocellular carcinoma metastasis. Oncogene 2004;23:298-302.
    Pubmed CrossRef
  15. Saxena NK, Sharma D, Ding X, Lin S, Marra F, and Merlin D et al. Concomitant activation of the JAK/STAT, PI3K/AKT, and ERK signaling is involved in leptin-mediated promotion of invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells. Cancer Res 2007;67:2497-2507.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  16. National Cancer Information Center (KR). Cancer statistics. Cancer incidence in 2015 [Internet]. Goyang: National Cancer Information Center; 2015. [Cited 2018 June 04]
    Available from: https://www.cancer.go.kr/lay1/S1T639C641/contents.do
  17. National Cancer Information Center (KR). Cancer statistics. Liver cancer incidence by histology group in 2015 [Internet]. Goyang: National Cancer Information Center; 2015. [Cited 2018 June 04]
    Available from: https://www.cancer.go.kr/lay1/program/S1T211C216/cancer/view.do?cancer_seq=3317&menu_seq=y3322
  18. Tang ZY. Hepatocellular carcinoma--cause, treatment and metastasis. World J Gastroenterol 2001;7:445-454.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  19. Lee HS, Choi GH, Hwang HK, Kang CM, Choi JS, and Lee WJ. The risk factors for extrahepatic recurrence after curative resection of hepatocellular carcinoma. Ann Hepatobiliary Pancreat Surg 2010;14:227-234.
  20. Portolani N, Coniglio A, Ghidoni S, Giovanelli M, Benetti A, and Tiberio GA et al. Early and late recurrence after liver resection for hepatocellular carcinoma: prognostic and therapeutic implications. Ann Surg 2006;243:229-235.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  21. Mani SA, Guo W, Liao MJ, Eaton EN, Ayyanan A, and Zhou AY et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell 2008;16:704-715.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  22. Gilles C, Polette M, Zahm JM, Tournier JM, Volders L, and Foidart JM et al. 1999. Vimentin contributes to human mammary epithelial cell migration. J Cell Sci 1999;112:4615-4625.
    Pubmed
  23. Huang C, Jacobson K, and Schaller MD. A role for jnk-paxillin signaling in cell migration. Cell Cycle 2004;3:4-6.
    Pubmed CrossRef
  24. Huang C, Jacobson K, and Schaller MD. Map kinases and cell migration. J Cell Sci 2004;117:4619-4628.
    Pubmed CrossRef
  25. Hsieh YS, Chu SC, Yang SF, Chen PN, Liu YC, and Lu KH. Silibinin suppresses human osteosarcoma MG-63 cell invasion by inhibiting the ERK-dependent c-Jun/AP-1 induction of MMP-2. Carcinogenesis 2007;28:977-987.
    Pubmed CrossRef
  26. Lee SO, Jeong YJ, Im HG, Kim CH, Chang YC, and Lee IS. Silibinin suppresses PMA-induced MMP-9 expression by blocking the AP-1 activation via MAPK signaling pathways in MCF-7 human breast carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun 2007;354:165-171.
    Pubmed CrossRef

September 2018, 50 (3)
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