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DNA Breakage by Salvianolic acid B in the Presence of Cu (II)
Korean J Clin Lab Sci 2018;50:205-210  
Published on June 30, 2018
Copyright © 2018 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Pyeongjae Lee1, Cheol Moon2, Yoon Seon Choi3, and Hyun Kyu Son4

1School of Industrial Bio-pharmaceutical Science, Semyung University, Jecheon, Korea,
2Department of Clinical Laboratory Science, Semyung University, Jecheon, Korea,
3Department of Cosmetic Science, Semyung University, Jecheon, Korea,
4Department of Natural Medicine Resources, Semyung University, Jecheon, Korea
Correspondence to: Pyeongjae Lee
School of Industrial Bio-pharmaceutical Science, Semyung University, 65 Semyung-ro, Jecheon 27136, Korea Tel: 82-43-649-1411 Fax: 82-43-649-1729 E-mail: pjlee1@semyung.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

Salvianolic acid B, which is a compound in the Salvia miltiorrhiza, has diverse biological activities, In particular, the antioxidative effects were reported to be involved in the protection of hepatocytes, neurons, and various cell types. On the other hand, some phenolic compounds, such as ferulic acid, which is regarded as an antioxidant, plays a pro-oxidative role in the specific transitional metal environment, which could explain the anticancer effect. This study examined the pro-oxidative effects of salvianolic acid B in the presence of Cu2+. Treatment with both salvianolic acid B and Cu2+ induced the transition of supercoiled DNA to the open circular or linear form but not in the sole salvianolic acid B or Cu2+ treatments. Salvianolic acid B reduced the Cu2+ to Cu+ using neocuproine, a Cu+ specific chelator. In addition, catalase, an enzyme that breaks down the H2O2 to water and molecular oxygen, inhibited the DNA breakage. H2O2, a reactive oxygen species, has detrimental effects on biological molecules, particularly DNA. Overall, the reduction of Cu2+ by salvianolic acid B could lead to the production of H2O2 followed by DNA breakage. These results suggest that the pro-oxidative effects could be the one of the anti-cancer mechanisms of salvianolic acid B, which remains to be explained.

Keywords : Antioxidant, Copper ion, Hydroxyl radical, Pro-oxidant, Salvianolic acid B
서론

산소는 세포에서 ATP를 생성하기위한 호흡기능에 필수적 요소이다. 미토콘드리아에서 전자전달계를 거친 전자는 최종적으로 산소가 수용하는데 전자전달계를 이탈한 전자는 산소와 반응하여 superoxide radical (·O2−), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (·OH) 등 반응성이 강한 활성산소종(Reactive Oxygen Species: ROS)을 생성하게 된다. 때로는 이와 다른 화학적 반응을 통해 ROS를 생성하기도 하는데 이렇게 생성된 활성산소종은 세포를 구성하는 핵산, 단백질, 지질의 구조를 변화시키고 이는 세포의 기능에 심각한 손상을 줄 수 있다. 이를 oxidative stress (OS) 라 부르며 퇴행성질환 및 노화에 있어 주요한 원인으로 여겨지고 있다. 생명체는 ROS를 방어하는 시스템을 구축하여 대응한다. Superoxide dismutase (SOD)와 catalase 등의 효소시스템은 생성된 ROS를 안전한 H2O로 변환시키며 체내 ROS를 제거 하는 항산화 물질을 가지고 있기도 하다[1-2].

ROS가 세포에 부정적 영향을 주기도 하지만 생명체는 ROS를 유용하게 이용하기도 한다. DNA, 단백질, 지질의 변형을 가져오는 ROS는 외부로부터 침입한 병원체 등을 제거하기 위한 자기생체방어시스템으로서의 역할을 수행하기도 하고 세포간의 신호전달물질로서의 역할을 하기도 한다[3].

OS로 인한 질병의 발생과 노화를 예방 혹은 치료를 위해 그동안 생명체의 방어시스템을 강화시키거나 혹은 ROS를 소거하는 항산화효능을 가지는 소재에 대해 연구되어 보고되어 왔다. 하지만 항산화효능이 뛰어나다고 알려진 물질도 Cu2+과 같은 산화형의 전이금속이 있는 환경에서 오히려 pro-oxidant로서 ROS를 만들어 낼 수 있음(Figure 1)이 알려져 있고[4-5] 이것이 암세포를 사멸시키는 기전 중에 하나라고 보고 있기도 하다[6-8]. 이는 물질이 가지는 다양한 면을 보여주고 있는 것으로 때론 항산화물질로서 때론 pro-oxidant로 유용하게 이용할 수도 있음을 보여주고 있다고 생각한다.

Fig. 1.

Mechanism of hydroxyl radical formation mediated by Cu2+.



단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 중앙ㆍ서아메리카, 중앙ㆍ동 아시아에 분포하는 꿀풀과에 속하는 다년생 초본식물로서 뿌리를 약용으로 사용한다. 단삼에 포함되어있는 주요 성분은 diterpene 화합물에 포함되는 tanshinone I, IIA, IIB 등 과 phenolic 화합물에 포함되는 danshensu, protocatechuic aldehyde, salvianolic acid B 등이 알려져 있다[9]. 이전 연구에 따르면 단삼에 포함되어있는 주요 성분 중 Salvianolic acid B는 간보호, 혈관보호, 신경세포보호 등의 생리활성 기능과 함께 superoxide radical과 hydroxyl radical를 소거하는 항산화 효과를 가지고 있다[10-14]. 위에서 설명했듯이 phenolic compounds 들이 pro-oxidant로 작용하여 ROS 중 특히 hydroxyl radical을 생성한다고 보고가 있으며 이를 phenolic compound의 항암 작용의 하나의 기전으로 설명하기도 한다. 본 실험에서는 단삼의 주요한 생리활성 물질이며 항산화 효과가 있다고 알려진 salvianolic acid B를 대상으로 pro-oxidant로서의 기능하는지 확인하는 실험을 진행하였다.

재료 및 방법

1. 실험재료

본 실험에 사용한 3-(2-Pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4- triazine-4`,4``-disulfonic acid sodium salt (Ferrozine), neocuproine, salvianolic acid B, Calf DNA는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입한 제품을 사용하였고, pBR322 (Plasmid)는 New England Biolabs (NEB)에서, FeSO4와 CuSO4는 Samchun Chemical에서 구입한 제품을 사용하였다.

2. DNA nicking assay

pBR322가 hydroxyl radical에 의해 절단이 일어나는 현상에 salvianolic acid B가 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 실행하였다. pBR322 (250 μg/mL), FeSO4 혹은 CuSO4, salvianolic acid B를 혼합 한 후 phosphate buffer (pH 7.4)를 이용하여 총부피를 20 μL로 맞추었다. 실험에 따라 catalase 혹은 EDTA를 넣어 20 μL로 맞추었다. Heating block을 이용하여 37°C에서 60분간 반응 시킨 후 TAE buffer (1X)로 만든 1% agarose gel을 만들어 전기영동 시킨 후 gel image analysis system을 사용하여 밴드의 위치를 확인하였다.

3. Calf DNA break assay

Calf DNA가 hydroxyl radical에 의하여 절단이 일어나는 현상에 대하여 salvianolic acid B가 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 실행하였다. Calf DNA (0.4 mg/mL in phosphate buffer), FeSO4 (2 mM), salvianolic acid B (200 μM, 10 μM, 100 μM, 200 μM)을 혼합 한 후 H2O를 이용하여 총부피를 40 μL로 맞추었다. Heating block을 이용하여 37 °C에서 60분간 반응시킨 후 TAE buffer (1X)로 만든 1% agarose gel을 만들어 전기영동 시킨 후 gel image analysis system을 사용하여 결과를 확인하였다.

4. Neocuproine assay

Salvianolic acid B에 의해 Cu2+가 Cu+로 변환되는지를 확인하기 위해 Cu+과 특이적으로 결합하는 neocuproine를 이용하였다. CuSO4 (100 μM), neocuproine (400 μM), salvianolic acid B (1, 5, 10, 100, 200 μM)를 혼합한 후 phosphate buffer (pH 7.4)를 이용하여 400 μL로 맞추었다. 실온에서 10분간 반응 시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. Iron 킬레이팅 assay

Salvianolic acid B가 Fe2+에 대하여 chelating 효과가 있는지 확인하기 위해 실행하였다. FeSO4 (200 μM), ferrozine (200 μM), salvianolic acid B (10 μM, 100 μM, 200 μM)를 혼합한 후 H2O를 이용하여 총부피를 400 μL로 맞추었다. 실온에서 10분간 반응 시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6. 통계 분석

실험은 독립적으로 3회 반복하였다. 분석한 실험 결과 값의 통계처리는 평균값±표준편차로 나타내었으며, 실험 결과 값의 통계적 유의성은 대조군과 각각의 시료처리 군의 실험 결과 값으로부터 Student’s t-test를 통하여 검증하였다. P-value< 0.05 인 것을 통계적으로 유의한 것으로 하였다.

결과

1. Fe2+ 이온 조건에서 salvianolic acid B의 DNA 절단 억제 효과

플라스미드는 circular 형태로 supercoiled 되어 있다. 플라스미드 DNA에 절단이 일어나면 supercoiled (form I)에서 open circular form (form II)이 되었다가 더 절단이 일어나게 되면 linear form (form III)이 되어 agarose gel에서 그 위치가 변한다. 따라서 DNA분해를 일으키는 물질을 처리했을 때 겔에서의 DNA 위치를 관찰하면 DNA 절단 정도를 확인할 수 있다. 단삼이 함유하고 있는 여러 물질 중에 salvianolic acid B는 주요한 생리활성효능을 보이는 물질로서 항산화 효과가 보고된 바 있다[14]. 본 실험에서는 환원형 금속 이온인 Fe2+환경에서 salvianolic acid B의 항산화 효과를 확인하였다. FeSO4 200 μM을 플라스미드에 처리했을 때 DNA가 절단되어 supercoiled 형태가 사라지고 open circular 형태와 일부 linear 형태를 확인할 수 있었다. FeSO4 200 μM을 salvianolic acid B와 같이 처리했을 때 처리 농도를 증가 할수록 linear 형태가 사라지고 supercoiled 형태가 증가함을 알 수 있다(Figure 2A). DNA를 플라스미드대신 Calf DNA로 바꾸었을 때 salvianolic acid B가 Fe2+에 의한 DNA 절단 억제를 좀 더 뚜렷이 알 수 있다(Figure 2B). 항산화 효과를 측정하는 방법으로 Fe2+ 킬레이팅능을 측정하는데 본 실험에서 salvianolic acid B는 Fe2+과 ferrozine의 복합체 형성을 억제하지 못하였다(Figure 3). 이는 salvianolic acid B가 Fe2+를 킬레이팅능이 뛰어나지 않음을 의미하며 Zhao 등[14]의 내용과 부합하는 결과이다.

Fig. 2.

Inhibitory effect of salvianolic acid B on nicking and breakage of plasmid (A) or calf DNA (B). Electrophoresis was performed on 1% agarose gel. Form I, supercoiled form: Form II, open circular form: Form III, linear form.


Fig. 3.

Complex of ferrozine and Fe2+ has the absorbance on 562 nm. Salvianolic acid B had no effect on binding of ferrozine on Fe2+. Values represent mean±SD of three independent measurements. ***P<0.001; significantly different from the mixture of ferrozine and Fe2+ by Student’s t-test.


Fig. 4.

Induction of DNA breakage by salvianolic acid B in the presence of CuSO4 (A and B). Electrophoresis was performed on 1% agarose gel. Form I, supercoiled form: Form II, open circular form: Form III, linear form.



2. Cu2+ 이온 환경에서 salvianolic acid B의 DNA 절단

CuSO4를 단독으로 200 μM 처리했을 때, FeSO4처리와 달리 supercoiled 형태의 변화를 관찰 할 수 없었다. CuSO4를 200 μM로 고정하고 salvianolic acid B의 처리 농도를 증가할 때 1 μM에서 open circular 형태를 관찰할 수 있었으며 100 μM에서는 linear 형태가 보이고 200 μM에서는 linear 형태위치에서부터 smearing 형태를 관찰 할 수 있었다(Figure 4A). Salvianolic acid B 처리 농도에 비례하여 DNA의 절단 정도가 심해짐을 알 수 있다. Salvianolic acid B를 10 μM로 고정하고 CuSO4의 처리 농도를 증가 할 경우 20 μM에서 open circular 형태를 관찰 할 수 있었고 100 μM에서는 완전히 open circular 형태만을 관찰 가능하며 200 μM에서는 100 μM처리 때와는 달리 더 이상의 DNA 분해는 관찰 되지 않았다(Figure 4B). CuSO4와 salvianolic acid B 단독 처리에서는 DNA 절단을 확인할 수 없었으나 같이 처리 했을 때는 DNA의 절단을 확인할 수 있었다. 이는 Cu2+와 salvianolic acid B의 반응으로 DNA 절단 하는 물질을 생성했음을 의미한다. 환원된 형태의 금속은 용액 내 산소와의 반응을 통해 ROS을 생산한다(Figure 1). 특히 hydroxyl radical은 가장 반응성이 큰 ROS로서 DNA 절단의 주요한 원인이 된다[15]. Cu2+는 산화형태로서 salvianolic acid B에 의해 Cu2+가 환원되어 Cu+가 되고 이는 산소와의 반응을 통해 hydroxyl radical 생성되어 DNA를 절단 하였다고 가정해 볼 수 있다.

3. Cu2+ 이온 환경에서 salvianolic acid B에 의한 DNA 절단 기전

이 실험에서 DNA 절단의 원인이 hydroxyl radical임을 확인하기 위해 중간단계 생성물로 여겨지는 H2O2를 제거하는 catalase를 처리하여 DNA 절단을 관찰하였다. CuSO4와 salvianolic acid B의 처리농도를 각각 100 μM과 10 μM로 고정하고 catalase처리 농도를 증가 할수록 open circular 형태가 사라짐을 관찰 할 수 있다(Figure 5A). 이는 catalase로 인해 H2O2가 제거되어 이 후 hydroxyl radical의 생성이 억제되었음을 추론해 볼 수 있다.

Fig. 5.

Preventive effect of catalase (A) and EDTA (B) on DNA breakage in the presence of salvianolic acid B and CuSO4.Electrophoresis was performed on 1% agarose gel. Form I, supercoiled form: Form II, open circular form: Form III, linear form.



Cu2+는 DNA의 특정 위치에 결합하여 ROS를 생성함으로서 DNA의 절단이 용이해지며 EDTA는 전이금속 킬레이터로서 Cu2+의 DNA 결합을 억제한다[16]. 본 실험에서 CuSO4와 salvianolic acid B의 처리농도를 각각 100 μM과 10 μM로 고정하고 EDTA를 처리하여 DNA 절단을 관찰하였다. EDTA 처리 농도를 증가시킬수록 open circular 형태가 줄어드는 것을 관찰 할 수 있었다(Figure 5B). 이는 본 실험에서 Cu2+가 DNA에 결합하고 salvianolic acid B와의 상호작용을 통해 H2O2를 생성하고 최종적으로 hydroxyl radical을 생성하였다고 생각해 볼 수 있다.

4. Cu+의 생성

Cu2+는 산화형으로 hydroxyl radical을 생성하기 위해 환원형으로 바뀌어야한다. Salvianolic acid B가 Cu2+를 Cu+로 변환시키는지 알아보기 위해 Cu+에만 특이적으로 결합하는 킬레이터인 neocuproine를 넣어 흡광도 측정하였다. Cu+와 neocuproine의 결합은 흡광도를 증가시킨다. Salvianolic acid B를 처리 농도를 증가할수록 농도 의존적으로 흡광도 증가하였다(Figure 6). 이는 salvianolic acid B에 의해 Cu2+가 Cu+로 변환됨을 의미한다. 위 결과를 종합하여 보면 Cu2+가 DNA에 결합하고 salvianolic acid B에 의해 Cu+로 환원되고 환원된 Cu+는 산소와의 반응을 통해 H2O2를 거쳐 hydroxyl radical를 생성하며 이것이 DNA절단의 원인이 됨을 추론해 볼 수 있다.

Fig. 6.

Transition of Cu2+ into Cu+ by salvianolic acid B. Neocuproine is Cu2+-specific chelator. Values represent mean±SD of three independent measurements. ***P<0.01, ***P<0.001; significantly different from the mixture of buffer and neocuproine without salvianolic acid B by Student’s t-test.


고찰

본 실험에서 환원형태의 Fe2+는 DNA 절단을 일으키지만 salvianolic acid B는 플라스미드와 Calf DNA에서 절단을 억제하였고 산화형태의 Cu2+는 단독으로 DNA 절단을 일으키지 않으나 salvianolic acid B를 첨가함으로서 DNA의 절단을 확인하였다. Catalase 및 EDTA 처리는 플라스미드의 절단을 억제하였고 neocuproine를 처리했을 때 흡광도가 증가함을 확인하였다. 이를 종합해 보면 Cu2+가 DNA와 결합하고 salvianolic acid B와의 산화환원 반응을 통해 Cu+로 변환된 후 산소와의 일련의 반응을 통해 H2O2를 거쳐 hydroxyl radical을 생성한다고 볼 수 있다. 즉 산화형의 금속이 존재할 때 전자를 부여하는 능력이 산화형의 금속을 환원시키면 hydroxyl radical의 생성을 늘리며 이것이 DNA을 절단한다고 생각되어진다. 이는 항산화능력이 있다고 여겨지는 물질도 주위 금속 이온의 환경에 따라 pro-oxidant로서 기능을 수행함을 의미한다. 항산화 물질이 pro-oxidant로서 기능을 수행한다는 것이 유용하게 활용되어 질 수 있는데 특히 항암효과를 나타내는 기전으로 여겨진다. 정상세포와 암세포의 차이점으로 구리이온의 증가한다는 보고[17]는 구리이온이 증가된 암세포의 경우 phenolic compounds 등이 pro-oxidant로서 세포 사멸에 기여할 수 있음을 의미한다. 최근 salvianolic acid B의 항암 효과를 보고한 논문이 발표되었다. Wu 등[18]은 salvianolic acid B가 acute lymphoblastic leukemia 세포에 대해 독성이 있고 Guo 등[19]은 약물저항성을 갖는 colorectal 암세포에서 salvianolic acid B가 ROS를 증가시켜 apoptosis를 유발한다고 보고하였다. 즉 salvianolic acid B의 pro-oxidant 기능이 암세포를 사멸시키는데 기여했다는 것이다. 본 연구에서는 salvianolic acid의 pro-oxidant 기능을 시험관내 실험으로 확인한 것일 뿐 암세포 및 동물실험에서 확인한 것은 아니다. 따라서 이런 salvianolic acid B의 DNA 절단 효과가 생체 내에서 나타날 것이라 할 수 없다. 다만 이런 결과는 salvianolic acid B의 항암효과를 설명하는 하나의 기전으로 ROS 생성을 고려해 볼 수 있다고 생각한다. 앞으로 다양한 암세포에 대한 salvianolic acid B의 독성효과와 그 기전을 설명하는데 있어 전이 금속상태와 ROS 생성 관계를 면밀히 살펴볼 필요가 있다고 생각한다.

요약

단삼의 성분인 salvianolic acid B는 다양한 생리활성이 알려져 있다. 특히 항산화 효과는 간세포, 신경세포를 포함한 다양한 세포유형에서 보호효과가 있다고 보고되었다. 하지만 ferulic acid와 같이 항산화제로 여겨지는 몇몇 페놀성 물질은 특정 전이 금속이 있으면 산화작용을 하며 이것이 항암 효능을 설명하기도 한다. 본 실험에서 salvianolic acid B가 Cu2+ 환경에서 산화작용을 하는지 알아보았다. salvianolic acid B와 Cu2+를 동시 처리하면 supercoilded 형태의 DNA가 open circular 혹은 linear 형태로 바뀌었으나 salvianolic acid B 혹은 Cu2+를 단독처리 했을 때는 그렇지 않았다. Cu+에만 특정적인 킬레이터 neocuproine을 이용하여 salvianolic acid B가 Cu2+를 Cu+로 환원시킴을 알았으며 H2O2를 물과 산소로 분해하는 catalase를 처리하면 DNA 분해가 일어나지 않았다. 활성산소종 중 하나인 H2O2는 생체분자 특히 DNA를 공격하여 정상기능을 수행하지 못하게 한다. 정리하면 salvianolic acid B에 의한 Cu2+의 환원은 H2O2를 생성하며 H2O2는 DNA 분해를 일으킨다. 이런 결과는 salvianolic aicd B의 항암효과가 salvianolic acid의 H2O2 생성 때문일 수 있다는 작은 단서를 줄 수 있으며 이는 좀 더 실험이 이뤄져야 한다.

Acknowledgements

This paper was supported by the Semyung University Research Grant of 2016.

Conflict of interest

None

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September 2018, 50 (3)
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