종양 내에서 암세포는 면역세포(immune cells), 버팀질세포(stromal cells), 내피세포(endothelial cells), 암연관섬유모세포(cancer-associated fibroblasts) 및 세포바깥바탕질(extracellular matrix) 등으로 구성된 미세환경(microenvironment)과 끊임없이 교신 및 상호작용을 통해 증식 및 전이 그리고 항암제에 대한 저항성을 획득한다[1, 2]. 특히, 암연관섬유모세포는 종양 미세환경을 구성하는 주요한 세포로써 세포바깥바탕질의 생성 및 재구성을 통해 암의 전이를 돕거나 성장인자를 분비하여 혈관발생(angiogenesis)을 유도하고, 면역세포들과의 상호작용을 통해 면역억제(immunosuppression)를 유도하는 것으로 알려져 있다[3]. Fibroblast activation protein (FAP), periostin, platelet-derived growth factor receptor, fibroblast-specific protein 1, palladin, twist, vimentin, tenascin C, CD90, galectin 1 등 다양한 암연관섬유모세포 표지자(marker)들 중 FAP는 약 97 kDa 분자량을 가지는 제2형 막경유 세린 단백분해효소(type II transmembrane serine protease)로써 다이펩타이드분해효소(dipeptidyl peptidase)와 펩타이드내부분해효소(endopeptidase) 활성을 가지고 있다[4, 5]. FAP는 정상세포에서는 거의 발현이 되지 않지만 활성화된 암연관섬유모세포 및 경화증(cirrhosis), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 섬유증(fibrotic diseases), 종양 등에 과발현 되어 있는 것으로 보고되어 있다[6, 7]. 특히, FAP는 폐암, 유방암, 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 전립선암 등 고형암의 버팀질에 과발현 되어있어 종양의 치료와 진단 및 진행 정도를 판단하는 종양표지자로써 역할과 유용성을 높이 평가받고 있다[8, 9].

최근 FAP와 특이적으로 결합하는 다양한 FAP 저해제(FAP inhibitor, FAPI)들이 개발되고 있으며, 특히 민감도가 높고 3차원적 영상으로 해석이 가능한 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography, PET)에 도입하기 위하여 fluorine-18 (¹⁸F), gallium-68 (⁶⁸Ga) 등 방사성동위원소를 표지한 FAPI 기반 방사성의약품들이 개발되어 여러가지 질환에서 이들의 임상적 유용성을 평가하고 있다[10, 11]. FAP를 타깃으로 한 첫 임상적용은 1994년 전이성대장암환자를 대상으로 실시한 iodine-131 표지 F19 항체였으나, 항체의 특성상 분자량이 크고 생체 내 배출이 느려 영상제제로는 많은 한계점을 보였다[12, 13]. 하지만 이후 N-(4-quinolinoyl)-Gly-(2-cyanopyrrolidine) 구조물을 기반으로 한 저분자 화합물(small-molecule)이 개발되었고[14], 이를 개량한 FAPI-02, FAPI-04, FAPI-34, FAPI-46, FAPI-74 등 퀴놀린 기반(quinoline-based) FAPI가 개발되어 방사성의약품으로 응용되고 있다[15, 16].

⁶⁸Ga은 germanium-68/gallium-68 (⁶⁸Ge/⁶⁸Ga) 제너레이터에서 손쉽게 용출할 수 있고 유지비가 들지 않으며 수용액상태에서 킬레이트제(chelator)와 안정적으로 결합할 수 있는 장점이 있어 ⁶⁸Ga 표지 방사성의약품의 사용빈도가 증가하고 있다[17]. ⁶⁸Ga 표지 방사성의약품은 다양한 킬레이트제를 사용하는데 FAPI의 경우 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)를 가장 많이 도입하여 사용하고 있다. 하지만 DOTA는 ⁶⁸Ga과의 결합반응 시 수소이온농도지수(pH)에 의존적이기 때문에 FAPI와 합성반응은 pH에 따라 표지효율이 달라지며, FAPI 전구물질의 양과 반응온도도 표지효율에 영향을 줄 수 있어 최적화된 표지기술을 개발하는 것이 필요하다. 현재까지 개발된 다양한 FAPI 기반 방사성의약품들 중 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04는 다양한 종류의 종양에서 섭취율이 높고 전이를 구분할 수 있으며, 종양 대 배후방사능 비(tumor-to-background ratio)가 우수하여 임상적 유용성을 인정받고 있다[18]. 이에 본 연구에서는 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 임상적용을 위해 카세트기반(cassette-based) 방사성의약품 자동합성장치를 사용하여 합성하는 방법을 개발하고자 하였다.

1.장비 및 시약

본 연구에서 사용한 FAPI-04 (HY-128643)는 MedChem-Express사에서 구매하였고, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)는 GERBU Biotechnik GmbH사에서 구매하여 별도의 정제과정 없이 사용하였다. Sep-Pak^Ⓡ C18 Plus Short (WAT020515) 카트리지는 Waters사의 제품을 사용하였고, 사용 전 5 mL의 에탄올로 흘려 준 후 10 mL의 주사용수로 전처리를 한 후 사용하였다. ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터는 Eckert & Ziegler Medical사의 IGG-100 1.85 GBq (50 mCi) 제품을 사용하였다. 멸균필터는 Supor^Ⓡ AEF 0.2 μm Intravenous Filter (AEF1NTE)는 Pall Medical사 제품을 사용하였고, filtered venting needle은 International Medical Industries사에서 구매하여 사용하였다. 고순도 염산과 에탄올(200 Proof, United States Pharmacopeia grade)은 Sigma-Aldrich사에서 구매하였고, 내화학성 HENKE-JECT^Ⓡ는 Henke-Sass Wolf GmbH사 제품을 사용하였다. 0.9% 생리식염수와 주사용수는 중외제약사에서 구매하여 사용하였다.

2.[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 합성

[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04는 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터로부터 용출한 [⁶⁸Ga]GaCl₃를 별도의 농축과정 없이 FAPI-04 전구체와 직접 표지하는 분획법(fraction collection method)을 적용하여 합성하였다(Figure 1). [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지반응은 카세트기반 자동합성장치 BIKBox^Ⓡ (BIK Therapeutics)를 사용하였다(Figure 2). BIKBox^Ⓡ 장치용 카세트는 세 개의 매니폴드(manifold)로 구성되어 있으며, 매니폴드A에는 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터로부터 ⁶⁸Ga을 용출하기 위한 0.1 N 염산 6 mL와 시약을 운반하기 위한 20 mL 주사기, 주사용수, FAPI-04 전구물질이 포함된 바이알, HEPES 버퍼가 포함된 바이알을 장착하였다. 매니폴드B에는 Sep-Pak^Ⓡ C18 카트리지와 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04를 용출하기 위한 1 mL 에탄올·0.9% 생리식염수 혼합액(1:1, v/v)이 포함된 바이알을 장착하였고, 매니폴드C에는 9 mL 생리식염수를 담고 있는 20 mL 주사기를 장착하였다.

Fig. 1. Schematic illustration for the radiosynthesis of [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04.
Abbreviation: HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid.

Fig. 2. BIKBox^Ⓡ synthesizer equipped with cassette for the labelling of [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04 and screenshot of the user software interface of BIKBox^Ⓡ synthesizer.
Abbreviations: 68Ge/⁶⁸Ga, germanium-68/gallium-68; HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; FAPI, fibroblast activation protein inhibitor.

1)시약준비

BIKBox^Ⓡ 장치용 카세트 매니폴드A에 장착된 20 mL 주사기를 사용하여 FAPI-04 전구물질과 HEPES 버퍼가 들어있는 바이알에 공기압을 불어넣은 후 압력차를 이용하여 반응기(reactor)로 각각 전구물질과 버퍼를 이동하였다. 이후 주사용수를 흘려주어 카세트 내부를 세척하여 잔류되어있는 시약을 제거하였다.

2)⁶⁸Ga의 용출

매니폴드A에 장착된 0.1 N 염산을 주사기 펌프를 사용하여 분당 2 mL의 속도로 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터에 흘려주어 두 번에 나누어 용출하였다. 첫 번째 용출시 1.7 mL의 0.1 N 염산을 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터에 흘려준 후 용출된 [⁶⁸Ga]GaCl₃는 폐기하였고, 두 번째 용출시 2.5 mL을 흘려주어 획득된 [⁶⁸Ga]GaCl₃는 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지반응에 사용하기 위하여 반응기로 이동시켰다. 이후 10 mL의 주사용수를 흘려주어 카세트 내부에 잔류되어있는 [⁶⁸Ga]GaCl₃를 제거하였다.

3)[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04 합성 및 분리정제

[⁶⁸Ga]GaCl₃ 용출액과 FAPI-04 전구물질 및 HEPES 버퍼가 들어있는 반응기를 25℃, 50℃, 100℃에서 10분간 반응시킨 후 압축공기를 사용하여 40℃로 식힌 다음 3 mL의 주사용수로 반응액을 희석하였다. 그리고 매니폴드A에 장착된 20 mL 주사기를 사용하여 반응액을 매니폴드B에 장착된 Sep-Pak^Ⓡ C18 카트리지 통과시킨 후 주사용수를 5 mL씩 두 번 Sep-Pak^Ⓡ C18 카트리지에 흘려주어 반응하지 않은 [⁶⁸Ga]GaCl₃, 잔류 HEPES 및 염산용액을 제거하였다.

4)[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 멸균 및 포장

Sep-Pak^Ⓡ C18 카트리지에 흡착된 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04는 에탄올·0.9% 생리식염수 혼합액을 통과시켜 매니폴드A에 장착된 20 mL 주사기에 용출한 후 매니폴드C에 장착된 생리식염수 9 mL로 희석하였다. [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04 혼합용액은 주사기 펌프를 사용하여 0.22 μm 멸균필터에 통과시킨 후 멸균 바이알에 충전하였다. 표지효율을 최적화하기 위하여 각 합성은 3회 이상 실시하였고, 합성 후 방사화학적 수율(radiosynthesis yield)은 반감기를 보정한 붕괴 보정 수율(decay corrected yield)로 표기하였다.

3.[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리

제조 완료된 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리는 유럽 약전(European Pharmacopoeia)에 명시된 Ga-68 에도트레오타이드([⁶⁸Ga]Ga-DOTATOC) 주사액(monograph No. 2482) 및 Ga-68 전립선특이막항원-11 주사액([⁶⁸Ga]Ga-PSMA-11)의 지침(monograph No. 3044)에 의거하여 품질관리를 시행하였다[19]. 성상은 육안으로 관찰하였고, 방사화학적 순도는 방사능-박층크로마토그래피(radio-thin layer chromatography)로 평가하였다. 방사능-박층크로마토그래피는 instant thin-layer chromatography on silica gel impregnated glass fiber sheets (ITLC-SG) (SGI0001; Agilent Technologies Inc.) 박층판에 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04를 점적한 후 1 M ammonium acetate·methanol 혼합액(1:1, v/v) 및 0.1 M sodium citrate을 전개용매로 각각 전개한 후 방사능-박층크로마토그래피 스캐너 AR-2000 (Eckert & Ziegler Medical)으로 분석하였다. 이핵종 분석은 다중채널분석기 ORTEC^Ⓡ DigiBASE (AMETEK Inc.)를 사용하였고, 반감기는 CRC^Ⓡ-25PET (Mirion Technologies) 방사능측정기를 사용하여 10분간 방사능을 측정한 후 반감기를 계산식으로 산출하였다. pH는 pH시험지(pH test strips pH 0-14; Sigma-Aldrich) 및 pH 측정기 SevenCompact™ S220 (Mettler Toledo)을 사용하여 측정하였다. 엔도톡신시험은 Endosafe^Ⓡ nexgen-PTS™ (Charles River Laboratories)를 사용하여 실시하였고, 무균시험은 직접법으로 액상티오글리콜산배지 및 대두카제인소화배지(Becton, Dickinson and Company)에 접종 후 호기성균, 혐기성균 및 진균의 증식을 14일간 관찰하였다.

1.HEPES 농도에 따른 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터에 0.1N 염산을 사용하여 용출한 두 번째 분획의 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 방사능 양은 1.15±0.06 GBq (31.1±1.5 mCi)이었다. HEPES 농도가 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율에 미치는 영향을 확인하기 위해 25 μg FAPI-04 전구체를 1, 1.5, 2, 2.5 M HEPES와 각각 섞은 후 2.5 mL의 [⁶⁸Ga]GaCl₃와 100℃에서 10분간 반응하였다. HEPES의 농도에 따른 FAPI-04 반응액의 pH는 HEPES 1 M일 경우 3.4, 1.5 M은 3.6, 2 M은 3.85, 2.5 M은 4.0이었다. [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율은 HEPES 1 M을 사용할 경우 80.0%±1.25%, 1.5 M의 경우 89.4%±1.56%, 2 M의 경우 96.1%±1.14% 그리고 2.5 M을 사용할 경우 90.0%±1.33%이었다 (Figure 3A). 2 M HEPES를 사용하여 pH 3.85에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었으므로 이후 반응은 2 M HEPES를 사용하여 최적화 하였다.

Fig. 3. Effect of different reaction conditions on the radiochemical yield of [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04. (A) Concentration of HEPES buffer, (B) reaction time, (C) amount of FAPI-04 precursor, (D) reaction temperature of the reaction mixture. Data are presented as the mean± standard deviation. Statistical analysis was performed by Student’s t-test, *P<0.05, ***P<0.001.
Abbreviations: HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; FAPI, fibroblast activation protein inhibitor.

2.반응시간에 따른 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

반응시간에 따른 표지효율을 확인하기 위해 25 μg FAPI-04 전구체와 2 M HEPES를 [⁶⁸Ga]GaCl₃와 100℃에서 각각 3, 5, 10분간 반응하였다. 3분간 반응할 경우 전체 합성시간은 25.3분이 소요되었고 5분간 반응 시 28분이 소요되었고 10분간 반응할 경우 32.4분이 소요되었다. 3분간 반응할 경우 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율은 85.2%±0.33%이었고, 5분간 반응할 경우 85.4%±0.40%로 반응시간 3분과 5분간에는 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(P<0.05). 하지만 10분간 반응할 경우 96.1%±1.14%로 표지효율이 가장 높았다(Figure 3B).

3.전구체 양에 따른 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

FAPI-04 전구체 양에 따른 표지효율을 확인하기 위해 5, 10, 25, 50 μg의 FAPI-04 전구체를 2 M HEPES 및 [⁶⁸Ga]GaCl₃와 100℃에서 10분간 반응하였다. 5 μg의 FAPI-04 전구체로 반응할 경우 표지효율은 87.1%±1.05%이었고, 10 μg으로 반응할 경우 89.0%±0.36%, 25 μg으로 반응할 경우 96.1%±1.14%, 50 μg으로 반응할 경우 92.0%±1.71%이었다(Figure 3C).

4.반응온도에 따른 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율 변화

반응온도에 따른 표지효율을 확인하기 위해 25 μg의 FAPI-04 전구체와 2 M HEPES를 [⁶⁸Ga]GaCl₃와 섞은 후 25℃, 50℃, 100℃에서 각각 10분간 반응하였다. 25℃에서 반응할 경우 표지효율은 3.5%±0.30%이었고, 50℃에서 반응할 경우 49.3%±0.46%, 100℃에서 반응할 경우 96.1%±1.14%이었다(Figure 3D). [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04 표지반응은 분획법을 적용하여 반응액의 총 부피가 4 mL이므로 상온에서는 매우 낮은 표지효율을 보이지만 100℃의 열을 가할 경우 유의하게 높은 결합효율을 보였다(P<0.001).

5.[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리

최종 생산된 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 품질관리 시 유럽 약전에 명시된 지침의 모든 평가기준을 만족하였다(Table 1). 성상 평가를 위해 육안으로 관찰 시 ⁶⁸Ga-FAPI-04는 맑고 투명하며 부유입자는 관찰되지 않았다. 방사화학적 순도는 방사능-박층크로마토그래피로 측정 시 99% 이상으로 확인되었다. ITLC-SG에서 1 M ammonium acetate·methanol 혼합액(1:1, v/v)으로 전개 시 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 머무름 인자(retention factor, R_f)는 0.8∼1.0이었고, 0.1 M sodium citrate을 전개용매로 전개 시 R_f는 0.1∼0.2이었다(Figure 4A). [⁶⁸Ga]GaCl₃의 경우 1 M ammonium acetate·methanol 혼합액(1:1, v/v)으로 전개 시 R_f는 0.1∼0.2이었고, 0.1 M sodium citrate로 전개 시 R_f는 0.8∼1.0로 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04와 반대로 나타났다(Figure 4B). 다중채널분석기를 사용한 방사성핵종 순도시험 시 511 KeV 및 1,077 KeV 이외의 피크는 검출되지 않았고, 방사능측정기로 측정된 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 반감기는 67.0±0.2분으로 ⁶⁸Ga의 반감기 기준인 62∼74분을 만족하였다. pH는 5.5∼5.7으로 기준범위인 pH 4.0∼8.0을 만족하였다. 엔도톡신시험에서 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 엔도톡신은 175 EU/V 미만으로 검출되었으며, 무균시험에서 미생물이나 진균의 증식은 발견되지 않았다.

Table 1

Data summary of the QC for [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04

QC test	Method	Acceptance criteria	Results	Guideline
Appearance	Visual inspection	Clear, colorless	Pass	KP, EP
pH	pH meter	4.0∼8.0	5.5∼5.7	EP
Radionuclidic identity	Half-life	Ga-68: 62∼74 min	67 min	EP
	Gamma spectroscopy	511, 1,077 KeV	511 KeV
Radiochemical purity	Radio-ITLC	>95%	>99%	EP
Radionuclidic purity	Gamma spectroscopy	511 keV>99.9%	>99.9%	KP, EP
Chemical purity	Spot test	HEPES<20 μg/mL	Pass	EP
Membrane filter integrity	Bubble point test	SuporⓇ AEF (Pall Medical)≥46 psi	Pass	EP
Foreign insoluble matter	Visual inspection	No particles	Pass	KP, EP
Bacterial endotoxin	Limulus amebocyte lysate test	17.5 EU/Vmax	<5.0 EU/mL	KP, EP
Sterility	Tryptic soy broth at 20℃∼25℃	No growth observed after 14 days	Sterile	KP, EP
	Fluid thioglycolate medium at 30℃∼35℃

Abbreviations: QC, quality control; KP, Korean Pharmacopoeia: EP, European Pharmacopoeia; ITLC, instant thin-layer chromatography; HEPES, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid; EU, entotoxin units; V_max, maximum recommended volume in millilitres.

Fig. 4. ITLC chromatograms of (A) [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04 and (B) [⁶⁸Ga]GaCl₃ using ITLC-silica gel plates as a stationary phase, and a 0.1 M sodium citrate (left) and a 1 M NH₄OAc/MeOH (1:1, v/v) (right) as a mobile phase.
Abbreviations: ITLC, instant thin-layer chromatography; NH₄OAc, ammonium acetate; MeOH, methanol; R_f, retention factor.

FAP는 정상세포에는 거의 발현되지 않지만 90% 이상의 고형암에 과발현 되어있고 종양의 침투, 발달 및 전이와도 밀접한 관련이 있어 FAP에 특이적으로 결합하는 FAPI를 이용한 방사성의약품은 암진단제로서 잠재력을 높이 평가받고 있다[20]. 핵의학에서 종양의 진단, 병기판정 및 치표평가는 [¹⁸F]-fluorodeoxyglucose ([¹⁸F]FDG) PET을 가장 많이 사용하고 있지만 [¹⁸F]FDG는 포도당 대사물질로써 감염성 질환이나 염증에서도 섭취되므로 종양에 특이적이지는 않다[21]. 하지만 FAPI는 포도당대사에 의존하지 않기 때문에 FAPI 기반 방사성의약품은 뇌, 간, 심근, 위장관, 골수 등 생리적으로 포도당의 섭취가 높은 장기에서 [¹⁸F]FDG보다 상대적으로 섭취가 낮고 종양 특이적으로 결합하여 다양한 암에서 [¹⁸F]FDG보다 임상적으로 유용성이 높은 것으로 보고되고 있다[22, 23]. 이에 iodine-125, fluorine-18, gallium-68, lutetium-177, indium-111 등 진단용 및 치료용 방사성동위원소를 FAPI에 표지하기 위해 다양한 합성법들이 개발되고 있다[24]. 진단용 방사성의약품에 가장 많이 사용되는 ¹⁸F의 경우 aluminium-[¹⁸F]fluoride ([¹⁸F]AlF)를 활용하여 FAPI 기반 진단용 방사성의약품으로 개발되었으나 ⁶⁸Ga 합성법에 비해보다 표지수율이 낮고 합성법이 복잡하며 사이클로트론 시설을 갖추어야 하는 단점이 있다[25]. 하지만 ⁶⁸Ga은 제너레이터를 사용하여 손쉽게 얻을 수 있고 킬레이트제를 사용하여 높은 표지수율로 합성할 수 있기 때문에 ⁶⁸Ga 표지 FAPI 기반 진단용 방사성의약품이 임상에서 가장 활발히 연구되고 있다.

⁶⁸Ga 표지 진단용 방사성의약품의 합성은 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터로부터 [⁶⁸Ga]GaCl₃를 용출하여 후처리 하는 방법에 따라 분획법과 농축법(pre-concentration and purification method)으로 분류할 수 있다[26]. 분획법은 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터를 염산으로 용출 시 용출되는 [⁶⁸Ga]GaCl₃ 용출액 중 가장 많은 방사능을 포함하는 부분만 사용하는 방법이고, 농축법은 용출되는 ⁶⁸Ga 용출액을 양이온 혹은 음이온 교환수지를 사용하여 ⁶⁸Ga만 포획한 후 용출액의 부피를 크게 줄여서 합성하는 방법이다. 농축법은 작은 부피로 표지하므로 전구체의 양도 줄일 수 있고 표지효율도 높일 수 있지만 농축과정이 포함되므로 분획법보다 복잡한 표지과정을 거쳐야 하고, 합성시간이 늘어나는 단점이 있다. 하지만 분획법은 표지반응 시 반응액의 부피가 늘어나 표지효율이 떨어질 수 있으나 합성방법이 간단하여 카세트를 사용한 자동화합성장치에 적용하기가 쉽다. 최근 EasyOne (Trasis), GaSy synthesizer (Synthra GmbH), GallElut (Scintomics GmbH) 등 다양한 ⁶⁸Ga 표지 방사성의약품 합성용 자동합성장치들이 출시되었다[19]. 하지만 대부분의 자동합성장치는 분획법을 적용한 카세트기반 합성장치로 1회용 카세트를 사용하기 때문에 사용이 간편하고 제조 후 세척과정이 필요하지 않으며 준비과정에서 불필요한 오염을 줄일 수 있어 의약품 제조 및 품질관리기준(good manufacturing practice)에 적합하게 생산할 수 있는 장점이 있다. 또한 다양한 ⁶⁸Ga 표지 FAPI 기반 방사성의약품이 개발됨에 따라 자동합성장치를 사용하여 이들의 합성방법을 최적화하는 연구 또한 활발히 진행되고 있다[27, 28]. 이에 본 연구에서는 국내에서 출시된 카세트기반 자동합성장치를 사용하여 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04를 합성하는 방법을 개발하고자 하였다.

DOTA는 pH 3.5∼5에서 [⁶⁸Ga]GaCl₃와 표지효율이 가장 높은 것으로 알려져 있다[29]. ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 제너레이터에 0.1 N 염산을 사용하여 용출한 [⁶⁸Ga]GaCl₃의 pH는 0∼1이므로 ⁶⁸Ga을 높은 표지효율로 DOTA와 결합하기 위해 완충액을 사용하여 pH를 3.5∼4로 조절해야 한다. ⁶⁸Ga 표지 방사성의약품 합성에 가장 많이 사용하는 완충액은 sodium acetate, ammonium acetate 및 HEPES 등이 있다[30]. 그 중 HEPES는 양이온성과 음이온성을 모두 갖고 있는 양쪽성 완충제(zwitterionic buffer)로 금속과 복합체를 잘 형성하지 않고 고온에서 합성반응 시 콜로이드(colloid) 형성을 감소시켜 ⁶⁸Ga 표지에 많이 사용된다[29]. 본 실험에서는 pH가 표지효율에 가장 큰 영향을 미치므로 먼저 HEPES의 농도에 따른 ⁶⁸Ga-FAPI-04의 표지효율을 확인한 결과 2 M HEPES를 사용할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었고(P<0.05), 표지반응을 10분간 반응하였을 때 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있다. 전구체 양에 따른 표지효율의 변화를 확인한 결과 25 μg의 FAPI-04 전구체를 사용할 경우 표지효율이 가장 높았고, 반응온도는 100℃에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었다(P<0.001). 이에 본 연구결과를 바탕으로 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 최적 표지조건은 25 μg의 FAPI-04 전구체를 2 M HEPES의 완충액을 사용하여 100℃에서 10분간 반응하는 것으로 확립할 수 있었다. 표지반응 후 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 멸균을 위하여 0.2 μm Supor^Ⓡ AEF 멸균필터에 통과하였을 때 멸균필터 내 2.6%±0.10%의 방사능이 잔존하였고, [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 안정성을 평가하기 위해 유효기간인 6시간동안 안정성을 확인한 결과 방사화학적 순도는 99% 이상으로 유효기간까지 안정한 것으로 확인하였다. [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 총 합성시간은 약 32.4분이었으며, 최종 생산된 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04는 모든 품질관리기준을 만족하였다. 다만, 최근 연구에 따르면 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04와 구조가 유사한 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46의 표지반응 시 아스코르브산(ascorbic acid)을 첨가하여 표지효율을 더 증가시킨 방법이 보고됨에 따라 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지효율에 끼치는 영향에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다[26].

본 연구를 통해 FAP를 표적으로 하는 FAPI 기반 방사성의약품 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 표지방법을 카세트기반 자동합성장치를 사용하여 최적화 할 수 있었다. 이에 본 연구에서 개발한 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04 표지법은 안정적으로 추후 임상에서 환자의 진단을 위한 FAPI 기반 방사성의약품을 공급하는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04는 암세포에 과발현 되어 있는 fibroblast activation protein (FAP)에 특이적으로 결합하는 FAP 저해제(FAP inhibitor, FAPI)에 방사성동위원소 ⁶⁸Ga을 표지한 방사성의약품이다. 본 연구에서는 국내에서 제작된 카세트기반 자동합성장치를 사용하여 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04를 제조하는 방법을 개발하였다. [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 합법을 개발하기 위해 완충액 HEPES의 농도, 반응시간, FAPI-04 전구체 양, 반응온도에 따른 표지효율을 확인하였다. [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04는 2 M HEPES를 사용하여 pH 3.85에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었고, 반응시간이 10분일 경우와 25 μg의 FAPI-04 전구체를 사용할 경우 및 100℃에서 반응할 경우 가장 높은 표지효율을 획득할 수 있었다. 또한 최종 합성된 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04는 모든 품질기준을 만족하여 본 연구를 통해 개발된 [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04의 합성법은 FAPI 기반 방사성의약품생산에 활용도가 높을 것으로 예상된다.

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Park JY, Clinical laboratory technologist; Kang WJ, Professor.

-Conceptualization: Kang WJ.

-Data curation: Park JY.

-Formal analysis: Park JY.

-Methodology: Park JY.

-Software: Park JY.

-Validation: Park JY.

-Investigation: Park JY.

-Writing - original draft: Park JY.

-Writing - review & editing: Kang WJ.

This article does not require IRB/IACUC approval because there are no human and animal participants.