
전 세계가 빠르게 고령화 사회로 접어들면서 노인인구의 증가와 함께 파킨슨병을 포함한 뇌졸중, 치매와 같은 퇴행성 뇌질환의 발병율이 날로 증가하고 있다. 파킨슨병은 WHO에 의하면 1990년에는 300만 명이었으나 2015년에는 620만 명으로 증가하였으며, 2040년에는 1,420만 명으로 증가된다[1]. 이에 비하여, 아직까지 질환의 완쾌를 위한 독성기전이나 적절한 치료법 및 효과적인 치료제 개발이 미흡한 상태이다. 더욱이, 환경오염에 따른 미세먼지나 중금속, 수질오염과 같은 외부적 요인들에 의하여 질환에 대한 이환율이 점차 높아지고 있으며, 중금속 중 황산철(FeSO4)은 파킨슨병의 원인물질로 알려져 있다[2]. 파킨슨병(Parkinsonism)은 치매나 루게릭질환과 같은 신경퇴행성질환으로 진전(tremor)을 비롯한 근경직(rigidity), 운동부전(akinesia)과 같은 3가지를 주 증상으로 하는 난치성 뇌병변으로, 1817년 영국 의사인 제임스 파킨슨(James Parkinson)에 의해 발견되어 명명된 질환이다[3]. 파킨슨병의 직접적인 요인으로는 내부적 요인에 의한 흑질내 도파민계 신경세포의 소실에 기인하며, 간접적으로는 환경적 요소에 의해 도파민신경세포의 손상이나 퇴화에 의한다고 알려져 있다[4]. 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환은 현재까지 효과적인 치료방법이나 치료약제도 많지 않아 완치에 많은 어려움이 따르고 있다. 파킨슨병의 치료로는 수술적 요법으로 시상하핵(subthalamic nucleus)에 대한 전극법과 시상파괴술을 실행하는 방법이 있는데 이 경우 모두 후유증이 심하다는 단점이 있다. 그러므로 주로 약물요법을 시행하는데, 현재 미국 FDA 승인을 받은 레보도파나 트리핵시페니딜(trihexyphenidyl)과 같은 항콜린성 약제가 사용되고 있다[5]. 최근 연구동향은 화합물, 항체, 줄기세포, 유전자 등에서 치료약제가 개발되고 있다[6]. 그렇지만 이들 약제들도 장기간 투여 시 독성으로 인한 부작용이 심하기 때문에 독성이 없으면서도 치료적 효능이 높은 대체물질의 개발이 시급해졌다. 최근, 중금속인 철(Fe)이 파킨슨병의 유발물질 하나로 알려지면서 이에 대한 연구가 시도되고 있다. 즉, 철화합물이 도파민계의 신경세포에 산화적 손상을 유발하여 세포를 퇴행케 함으로서 파킨슨병을 초래한다고 제시된 바 있다[2]. 따라서, 본 연구에서는 이를 근거로 철화합물에 의한 신경독성이 도파민계 신경세포가 아닌 타 신경세포에서도 산화적 손상과 관련된 신경독성을 나타내는가를 알아보기 위하여 아교세포(neuroglial cell)의 일종인 배양 C6 glioma 세포주를 재료로 철화합물의 독성을 조사하였다. 이 같은 가능성의 하나로서, 납을 비롯한 카드뮴이나 알루미늄과 같은 몇몇 중금속화합물들이 붕괴되면서 자유라디칼을 생성하고, 생성된 자유라디칼의 독성이 산화적 손상과 관련이 있다고 제시된 바 있다[7]. 한편, 각종 식물에는 항산화를 비롯한 항바이러스, 항균, 항독에 유익한 활성성분들을 다량 함유하고 있다고 밝혀지면서 이들 성분들을 이용한 병변의 치료적 접근을 시도하고 있다[8]. 식물 중 물매화(
본 실험에 사용한 시약으로 FeSO4, quercetin, alcohol, pyrogallol, nitroblue tetrazolium (NBT), phosphate buffered saline (PBS), dimethyl sulfoxide (DMSO), hydrogen peroxide (H2O2), HCl, xanthine, Tris-HCl buffer 및 2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-caboxanilide, disodium salt (XTT)는 Sigma사(St Luios. MO, USA)에서 구입하였다. 또한, FeSO4의 제조는 소태아혈청(FBS: fetal bovine serum, Gibco, USA)이 없는 최소필수배지(MEM: minimum essential medium, Gibco, USA)을 사용하여 50, 100, 150, 200 μM의 각 저장액을 만들어 사용하였다. XTT (50 μg/mL) 저장액은 PBS에 희석하여 사용하였다.
전북 익산에 있는 야산에서 8∼9월에 전초를 채취하여 햇볕에서 말린 다음 시료를 냉동 보관하여 사용하였다. 추출을 위해 시료 80.6 g과 약 280 mL의 증류수를 1,000 mL 환저플라스크에 넣어 3시간 동안 가열한다. 이 과정을 3회 반복하여 얻은 액을 모아 3,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 감압농축시켜서 수율이 2.9%인 2.3 g의 시료를 얻었다. 상기 시료를 필요시 실험목적에 맞도록 희석 사용하였다.
C6 glioma 세포주(ATCC, CCL 107)의 배양은 trypsin 효소를 사용하여 분리하였으며 분리된 세포는 혈청함유 배양액에서 잘 섞은 다음 1×105 cells/well의 밀도로 96-well 배양용기에 분주하였다. 분주한 후 72시간 동안 36℃, 5% CO2의 항온기에서 배양하였으며, 배양 세포에 농도별로 약제를 처리한 후 세포생존율을 분석하였다. 세포생존율 분석은 Mosmann [14]의 방법으로 약제를 처리한 세포에 각 well당 XTT (50 μg/mL) 10 μL를 넣고 4시간 동안 항온기에서 배양하였다. 배양완료 후 DMSO로 처리한 다음 ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, USA) 450 nm에서 흡광도를 측정해서 대조군과 비교 조사하였다.
Pyo 등[15]의 연구결과를 바탕으로 배양 C6 glioma 세포에 FeSO4가 30∼70 μM의 농도로 포함된 배양액에서 각각 48시간 동안 처리한 후에 세포생존율에 대한 XTT50값을 측정하였다.
Chung 등[16]의 연구결과를 바탕으로 QU의 항산화능 조사를 위해 25 μM H2O2를 배양 세포에 처리전, QU 35 μM과 QU 45 μM의 각각의 농도를 2시간 동안 처리하여 이에 대한 영향을 세포생존율로 조사하였다. 또한, FeSO4에 대한 QU의 영향을 파악하기 위해 XTT50 농도의 FeSO4 처리전에 QU 35 μM과 45 μM을 2시간 동안 처리하고 각각의 세포생존율을 조사하였다.
PP 추출물의 독성 조사를 위하여 90∼150 μg/mL 각각 농도의 추출물을 배양 세포에 48시간 동안 처리 후 세포생존율 조사하였다. 조사결과에서 추출물의 최대허용한계농도를 확인하고 한계농도 바로 이하의 두개의 농도를 분석에 사용하였다. 또한, FeSO4에 대한 PP 추출물의 영향조사는, XTT50 농도의 FeSO4 처리전, 110 μg/mL와 130 μg/mL의 추출물을 2시간 동안 처리하고 세포생존율로 각각의 영향을 조사하였다.
폴리페놀(polyphenol)분석은 A.O.A.C. [17]에 의한 방법에 따라, 0.2 mL 추출시료와 phenol reagent 0.2 mM을 같이 3분간 반응시킨 후 0.4 mL sodium carbonate로 1시간 처리하여 ELISA reader로 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약은 Tannic acid로 하여 검량곡선을 작성하였다. Flavonoid 분석은 Nieva Moreno 등[18]에 의한 방법에 준해, 25℃에서 시료용액 0.1 mL, 10% aluminum nitrate, 에탄올 4.7 mL, 1 M potassium acetate 혼합물 0.2 mL를 40분 동안 반응시킨 후 ELISA reader로 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약을 rutin으로 하여 검량곡선을 작성하였다.
SOD-유사 활성은 Marklund와 Marklund [19]에 의한 방법에 의해, 10 mM pyrogallol과Tris-HCl buffer를 시료에 처리하여 25℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응 후 HCL로 처리한 다음 ELISA reader로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사 활성은 대조군에 대한 백분율로 표시하였으며, SOD-유사능은 QU를 양성대조군으로 하여, SOD-유사능(%)=[(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100]‒100으로 나타냈다.
SAR-소거 활성의 측정은 nitroblue tetrazolim (NBT)의 방법에 따라 시료용액 0.1 mL, 0.4 mL potassium phosphate buffer (pH 7.5), 0.4 mM xanthine에 NBT를 가하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응이 완료되면 1 N HCl 1 mL를 가한 후 ELlSA reader, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. SAR-소거 활성은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다. SAR-소거능은 QU를 양성대조군으로 하여, SAR-소거능(%)=100‒[(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100]으로 나타냈다.
결과값은 SPSS/WIN (20.0) 프로그램을 이용하여 Mean±SD로 표기하였으며, 군간의 비교는 one way ANOVA로 분석하였고, 사후 분석은 Tukey HSD으로 하였다. 유의수준은
FeSO4의 독성을 확인하기 위하여 배양 C6 glioma 세포에 FeSO4를 30∼70 μM 농도로 각각 포함된 배양액에서 48시간 동안 배양한 결과, 처리농도에 따라 세포생존율의 유의한 감소를 나타냄으로서 독성을 보였다(
The cytotoxicity of FeSO4 by XTT assay
Concentrations of FeSO4 (μM) | XTT assay (450 nm) | (%) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|---|
Mean±SD | |||||
Controla | 0.42±0.02 | 100 | 208.53 | <.001 | a>b>c>d |
30b | 0.31±0.02 | 73.8 | |||
50c | 0.27±0.02 | 64.3 | |||
70d | 0.18±0.01 | 42.9 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviation: FeSO4, ferrous sulfate.
QU에 대한 항산화능 조사를 위해 25 μM H2O2를 배양 세포에 처리하기 전에 QU 35 μM과 QU 45 μM을 각각 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, H2O2의 처리에서는 대조군에 비하여 세포생존율이 38.0% (0.19±0.01)로 나타난 반면, 35 μM과 45 μM의 QU의 처리에서는 각각 72.0% (0.36±0.02)와 76.0% (0.38±0.02)로 나타났다. 이는 H2O2 단독처리와 달리 모두 세포생존율이 유의하게 증가하였다(
The antioxidative ability of QU on the H2O2 in cultured C6 glioma cells
Concentrations of QU (μM) | XTT assay (450 nm) | (%) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|---|
Mean±SD | |||||
Controla | 0.50±0.03 | 100 | 417.61 | <.001 | a>d>c>b |
25 H2O2b | 0.19±0.01 | 38.0 | |||
35/25 H2O2c | 0.36±0.02 | 72.0 | |||
45/25 H2O2d | 0.38±0.02 | 76.0 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: QU, quercetin; H2O2, hydrogen peroxide.
FeSO4의 세포독성에 대한 항산화제인 QU의 영향은 XTT50 농도의 FeSO4를 배양 세포에 처리하기 전에 QU 35 μM과 QU 45 μM을 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, FeSO4의 처리에서는 세포생존율이 대조군에 비하여 35.1% (0.20±0.03)로 나타났으나 35 μM과 45 μM CA의 처리에서는 각각 47.4% (0.27±0.01)와 59.6% (0.34±0.02)로 나타났다(
The effect of QU on the cytotoxicity induced by FeSO4 in cultured C6 glioma cells
Concentrations of QU (μM) | XTT assay (450 nm) | (%) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|---|
Mean±SD | |||||
Controla | 0.57±0.03 | 100 | 393.15 | <.001 | a>d, c>b |
FeSO4 (XTT50)b | 0.20±0.03 | 35.1 | |||
35/FeSO4 (XTT50)c | 0.27±0.01 | 47.4 | |||
45/FeSO4 (XTT50)d | 0.34±0.02 | 59.6 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: QU, quercetin; FeSO4, ferrous sulfate.
PP 추출물의 독성분석은 각각 90∼150 μg/mL 농도의 추출물을 넣은 배양액에서 세포를 노출시킨 결과 90 μg/mL와 110 μg/mL 농도에서 세포생존율이 대조군에 비하여 97.4% (0.38±0.02)와 94.9% (0.37±0.02)로 각각 나타났다. 또한, 130 μg/mL와 150 μg/mL 농도에서 세포생존율은 각각 92.3% (0.36±0.03)와 89.7% (0.35±0.01)로 나타났다(
The cytotoxicity of PP extract on cultured C6 glioma cells by XTT assay
Concentrations of PP extract (μg/mL) | XTT assay (450 nm) | (%) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|---|
Mean±SD | |||||
Controla | 0.39±0.03 | 100 | 5.07 | .002 | a>e |
90b | 0.38±0.02 | 97.4 | |||
110c | 0.37±0.02 | 94.9 | |||
130d | 0.36±0.03 | 92.3 | |||
150e | 0.35±0.01 | 89.7 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviation: PP,
PP 추출물성분 중 polyphenol의 함량은 42.8 mg/g으로, flavonoid 함량은 32.9 mg/g으로 각각 나타났다(Figure 2).
FeSO4의 세포독성에 대한 PP 추출물의 영향은 XTT50 농도의 FeSO4를 배양 세포에 처리하기 전에 각각 110 μg/mL와 130 μg/mL의 추출물을 처리한 결과, FeSO4의 처리를 한 세포생존율은 대조군에 비하여 39.4% (0.13±0.01)로 나타난데 비하여 110 μg/mL 추출물 처리에서는 51.5% (0.17±0.01)로 나타났다. 또한 130 μg/mL 추출물 처리에서는 60.6% (0.20±0.01)로 나타나 FeSO4의 처리와 달리 유의한 증가를 보였다(
The protective effect of PP extract on the cytotoxicity induced by FeSO4 in cultured C6 glioma cells
Concentrations of PP extract (μg/mL) | XTT assay (450 nm) | (%) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|---|
Mean±SD | |||||
Controla | 0.33±0.002 | 100 | 293.71 | <.001 | a>d>c>b |
FeSO4b | 0.13±0.001 | 39.4 | |||
110/FeSO4 (XTT50)c | 0.17±0.01 | 51.5 | |||
130/FeSO4 (XTT50)d | 0.20±0.001 | 60.6 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: PP,
SOD-유사 활성을 측정하기 위하여 PP 추출물 시료 110 μg/mL와 130 μg/mL 농도를 처리하여 분석하였다. 110 μg/mL 농도 결과는 활성이 대조군에 비하여 113.6%로 나타났으며, 130 μg/mL의 처리에서는 118.4%로 나타났다(Table 6). 110 μg/mL와 130 μg/mL 농도에서 SOD-유사 활성능은 각각 13.6%와 18.4%로 이는 모두 대조군보다 유의한 유사 활성능의 증가를 나타냈다. 특히, 130 μg/mL 농도에서는 양성대조군인 QU의 소거능인 63.2 (
The SOD-like activity of PP extract determined at a wavelength of 420 nm
Concentrations of PP extract (μg/mL) | SOD-like activity (420 nm) | (%) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|---|
Mean±SD | |||||
Controla | 0.38±0.02 | 100 | 241.19 | <.001 | a>c, d>b |
45 μM QUb | 0.62±0.02 | 163.2 | |||
110c | 0.43±0.02 | 113.6 | |||
130d | 0.45±0.02 | 118.4 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: PP,
PP 추출물에 대한 SAR-소거 활성의 정도를 측정하기 위하여 추출물 시료 110 μg/mL와 130 μg/mL를 각각 분석한 결과 110 μg/mL 추출물의 처리에서는 80.4%로 나타났으며, 130 μg/mL의 처리에서는 67.4%로 나타났다(Table 7). 따라서, SAR-소거능은 110 μg/mL와 130 μg/mL에서 각각 19.6% (
The SAR scavenging activity of PP extract at a wavelength of 560 nm
Concentrations of PP extract (μg/mL) | SAR-scavenging activity (560 nm) | (%) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|---|
Mean±SD | |||||
Controla | 0.46±0.01 | 100 | 622.49 | <.001 | a>c>d>b |
45 μM QUb | 0.14±0.02 | 30.4 | |||
110c | 0.37±0.01 | 80.4 | |||
130d | 0.31±0.02 | 67.4 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: PP,
파킨슨병은 치매와 마찬가지로 질환에 이환될 경우 정상적인 일상생활이 어려울 뿐만 아니라 인간으로서의 삶의 영위가 위협받게 된다. 특히, 환경이 오염되면서 미세먼지나 중금속 및 오염된 대기와 수질로 인해 파킨슨병과 같은 난치성 질환이 높은 빈도로 발병하고 있다[20]. 특히, 중금속 중 황산철(FeSO4)은 파킨슨병의 유발물질로 알려지면서 이의 신경독성에 대해 많은 관심이 집중되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 FeSO4의 신경독성을 산화적 손상 측면에서 알아보기 위하여 C6 glioma 세포를 배양하여 조사하였다. 이를 위해, 배양중인 세포에 30∼70 μM 농도의 FeSO4를 각각 48시간 동안 처리한 결과 농도의존적으로 세포생존율을 유의하게 감소시킴으로서 세포독성을 나타냈다. 또한 이 과정중에 XTT50값이 63.3 μM에서 나타남으로서 Borenfreund와 Puerner [21]의 독성판정기준에 의하여 고독성(highly-cytotoxic)인 것으로 나타났다. 본 결과는 Pyo 등[15]이 피부세포에 대한 FeSO4의 세포독성을, Jung [13]이 섬유아세포에 대한 FeSO4의 세포독성을 보고한 연구 결과와 일치하였다. 이같이 FeSO4가 C6 glioma 세포에 신경독성을 보인 것은 FeSO4가 카드뮴 화합물처럼 세포내 DNA합성을 방해하였거나[22], 또는 세포내 단백질합성계에 영향을 주었을 가능성을 배제할 수는 없지만[23], 그 보다는 FeSO4의 산화적 손상에 기인한 가능성이 클 것으로 생각된다. 따라서, 본 연구에서는 FeSO4의 독성에 산화적 손상이 관여되었는지를 알아보기 위하여 배양 세포에 FeSO4를 처리하기 전에 항산화제의 하나인 35 μM과 45 μM 농도의 QU를 각각 처리한 결과, 세포생존율이 FeSO4만을 처리한 경우인 35.1%에 비하여 각각 47.4%와 59.6%로 FeSO4만을 처리한 것과 달리 모두 세포생존율이 유의하게 증가하였다. 본 결과는 항산화제인 QU가 FeSO4의 독성을 방어한 것으로서 이는 FeSO4의 독성은 산화적 손상이 연관되어 있음을 증명하고 있다. 본 연구는 항산화제인 vitamin E가 FeSO4의 독성을 방어하였다는 연구 보고와도 일치하였다[13]. 한편, FeSO4의 독성에 대한 PP 추출물의 방어효과에 대한 조사에 있어서, 배양 세포에 FeSO4를 처리하기 전에 추출물 110 μg/mL와 130 μg/mL 농도를 2시간 동안 사전 처리한 결과 FeSO4만의 처리인 세포생존율 39.4%에 비하여 51.5%와 60.6%로 FeSO4만의 처리에 비하여 모두 유의한 증가를 보였다. 본 결과는 PP 추출물이 FeSO4의 독성을 방어한 것으로서 이는 PP 추출물처럼 flavonoid 성분들을 함유하고 있는 청미래덩굴(
본 연구는 배양 C6 glioma 세포를 재료로 파킨슨병의 유발물질인 황산철(FeSO4)의 신경독성과 이에 대한 물매화(
This paper was supported by Wonkwang Health Science University in 2022.
None
Seo YM1, Professor; Yang SB2, Professor.