광역학 치료(Photodynamic therapy, PDT)의 세포내 작용기전은 광물리학적 현상으로 이해되는데 투여된 광감작제는 groud state에서 특정 파장의 빛으로 활성화시켜 단일항상태나 삼중항 상태로 되는 excited state가 되는 데 다시 groud state로 되려고 할 때 방출되는 에너지가 산소와 반응하여 활성산소(O₂⁻)를 생성시키거나(Type II 반응) 광감작제가 전자전달계에 관여하는 경우 자유라디칼이 형성되어(Type I 반응) 세포파괴가 일어난다[1, 2]

표재성 피부질환들은 빛을 조직에 직접 조사하여 치료를 하고 체내에 있는 심재성 질환들은 파이브 카테터를 이용하여 치료하고자하는 장기까지 도달시킨 후 빛을 조사하여 치료를 하고 있다. 광역학치료에 주로 사용되는 레이저광원은 직진성을 갖는 광선이며 치료 효과 면에서는 탁월하고 좋은 재료로서 손색이 없지만 고가이기 때문에 사용하기가 쉽지는 않는 실정이다. 그래서 많은 연구자들은 저가의 light emitting diode (LED)에 많은 관심을 가지게 되었고 국소적 부위에 조사할 수 있는 레이저보다 넓은 부위의 병소에 조사할 수 있고 빛의 단위 면적당 세기도 적게 받는다는 장점을 가지고 있어서 체외적인 광역학 치료연구를 위해 광원으로써 많이 사용되고 있다[3, 4]. 광역학 치료는 암치료방법 중 하나로 알려져 있고 임상치료에 사용되고 있지만 임상미생물인 세균과 곰팡이류 등의 치료효과에는 활발한 연구가 이루어지지 않고 있는 상태이다[5]. 박테리아 PDT는 1900년, 독일 뮌헨에서 의대생이던 Oscar Raab이 acridine dye를 실험하던 중 acridine red에 착색된 짚신 벌레가 빛에 노출되어 죽게 되는 것을 발견한 후 체외적인 방법으로 시도를 시작하여 오늘날까지 많은 연구들이 다양한 광감작제를 이용한 연구들이 이루어지고 있다[6, 7].

5-aminolevulinic acid (ALA)는 천연 광감작제로 대상 세포안에서 protoporphyrin IX (PPIX)로 전환되는 전구물질이다. ALA는 몇 가지 유리한 특성을 가지며 헴(Heme) 생합성 경로에서 α-리놀렌산은 표적 세포로부터 빠르게 제거될 수 있는 천연 중간생성물이다[8]. ALA는 실제 감광제 PPIX의 전구물질로서 세포 주변의 매트릭스를 관통하여 표적세포에 축적될 수 있을 만큼 작다[9].

마지막으로, ALA의 광역학적 효과는 광원의 제한된 침투로 인해 표면 병변(1∼2 mm)으로 제한된다[10]. 이러한 특성은 빛 차단시간을 단축할 수 있으며, 조직 손상을 줄이고 PDT의 효능을 개선하며, 이 모든 것이 임상 적용에서 PDT의 안전성과 유효성을 보장한다.

최근 몇 년 동안, 조명 장치에 사용되는 레이저 및 발광 다이오드(LED)가 다양한 유형의 박테리아와 효모에 대해 고무적인 결과를 보여주고 있다[11-15]. 본 연구에서도 세균을 치료하기 위한 항생제의 대안인 광역학치료법을 적용하여 적절한 파장(빨강)의 빛과 ALA를 활성화시켜 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성으로 이어지며 이는 표적세포에서 치명적으로 작용하는 점을 이용하여 Pseudomonas aeruginosa (녹농균)와 Enterococcus faecalis (장알균)에 치료효과를 증명하고자 하였다[16].

P. aeruginosa는 병원감염 10%정도의 원인과 지역감염의 원인이 되는 균이다. P. aeruginosa의 감염은 종종 중증으로 생명을 위태롭게 하거나 치료의 어려움을 주는 치료동안 항생제 내성의 출현이 고위험을 유발한다. 따라서 심각한 결과를 초래하는 균이다[17, 18]. 또한 P. aeruginosa는 상처감염을 일으키는 대표적인 균이며 피부상처치료에는 전신 항생제 및 국소적 드레싱, 수술 등의 치료법이 사용되고 있으나 시간, 비용, 자연 내성 및 바이오 필름 형성으로 인한 내성 등에 관한 단점이 있다.

그리고 반코마이신내성 장알균(vancomycin resistant enterococci, VRE)은 의료관련 감염의 대표적인 병원체로 1986년 유럽에서 처음 보고된 이래 현재에 이르기까지 30여년 동안 전 세계적으로 분리 빈도가 증가하여 중요한 의료관련 감염균으로 자리 잡고 있다[19].

본 연구의 목적은 치료의 어려움이 있는 P. aeruginosa와 E. faecalis를 대상으로 ALA를 이용한 PDT의 항균 효과를 통해 감염치료의 가능성을 탐색하고자 하였다.

1. 대상균주 및 배양

P. aeruginosa (ATCC 27853) 표준균주를 50% glycerol-brain heart infusion broth에 접종하여 −70°C 냉동고에 보관하였고, MacConkey agar에 계대하여 37°C 산소성 배양기(Vision Scientific, Daejeon, Korea)에서 하룻동안 배양하여 사용하였다. E. faecalis (ATCC 29212) 표준균주는 trypticase soy agar에 계대배양하여 사용하였다.

2. 광원과 광감작제

본 연구에 사용된 광감작제 5-aminoluvulinic acid hydrochloride (Sigma Chemical Company, St Louis, Mo)는 dulbecco’s phosphate buffered saline (Hyclone, USA)에 100 mg/mL로 녹여 만든 뒤 0.2 μm filter로 여과하여 사용하였다.

광원은 LED를 자체 제작하여 사용하였다. 사용된 LED는 5Φ의 원통모양으로 시험관에 조사하기 위해 LED array를 제작하였다. 630 nm LED array는 가로 120 mm×세로 180 mm로, 총 384 (16×24)개의 LED가 장착되었다. LED의 회로 연결은 직렬과 병렬을 병합하여 사용하였고, 직류 전원을 사용하였다. LED의 수명 연장과 손상을 방지하기 위하여 안정적으로 저항을 150 Ω으로 하였으며 LED array의 광량은 전원 공급장치(Hanil, Korea)의 전류를 조절하여 10.0 mW/cm²가 되도록 하였다. LED array와 조사받는 테스트 튜브와의 거리를 100 mm로 하고 균주부유액이 고루 조사 받도록 페트리디쉬에 사면으로 기울여 12.0 V, 0.4 A의 전압과 에너지 밀도 10.0 mW/cm²의 630 nm LED를 30분 동안 조사하였다. 최종 에너지는 18 J/cm²이였다.

3. P. aeruginosa의 CFU (colony forming units) 측정

MacConkey agar에 계대배양된 P. aeruginosa 균주를 Muller-Hintone broth로 탁도계(Densicheck plus, bio-meriex, USA)를 이용하여 McFarland No. 0.5로 맞춘 후 1.5×10⁴ cells/mL가 되도록 12×75 mm polyethylene cap tube (SPL Life Sciences, Korea)에 균주부유액을 만들었다. ALA는 균주부유액과 함께 희석되어 최종농도 10, 5, 2.5, 1.25 mg/mL가 되도록 한 후 혼합하였다. 그 후 알루미늄 호일을 이용하여 빛을 차단시키고 37°C 배양기(Thermo Forma, 47502-3362)에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 630 nm의 LED 광원 출력 장비를 사용하여 10 mW/cm²로 30분 동안 빛을 조사하였다. LED 조사가 끝난 후 혼합기로 혼합 후 MacConkey agar에 각 군별로 50 μL씩 분주 후 스프레더를 이용하여 접종한 후 18시간 배양시킨 후 생성된 집락의 수를 세었다. 각 그룹 당 6회 측정하였으며, 100개 이상되는 집락에 대해서는 멸균된 식염수로 희석하여 집락 수를 세었다. 평균값과 표준편차를 산출하였다.

4. E. faecalis의 CFU (colony forming units) 측정

Trypticase soy agar에 계대배양된 E. faecalis 균주를 Enterococcosel broth로 탁도계(Densicheck plus, bio-meriex, USA)를 이용하여 McFarland No. 0.5로 맞춘 후 1.5×10⁵ cells/mL가 되도록 12×75 mm polyethylene cap tube (SPL Life Sciences, Korea)에 균주부유액을 만들었다. ALA는 균주부유액과 함께 희석되어 최종농도 5, 2.5, 1.25, 0.625 mg/mL가 되도록 한 후 혼합하였다. 그 후 알루미늄 호일을 이용하여 빛을 차단시키고 37°C 배양기(Thermo Forma, 47502-3362)에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 630 nm의 LED 광원 출력장비를 사용하여 10 mW/cm²로 30분 동안 빛을 조사하였다. LED 조사가 끝난 후 혼합기로 혼합 후 tryp-ticase soy agar에 각 군별로 50 μL씩 분주 후 스프레더를 이용하여 접종한 후 18시간 배양시킨 후 생성된 집락의 수를 세었다. 각 그룹 당 4회 측정하였으며, 100개 이상되는 집락에 대해서는 멸균된 식염수로 희석하여 집락수를 세었다. 평균값과 표준편차를 산출하였다.

1. P. aeruginosa의 CFU측정

P. aeruginosa는 대조군인 control과 LED만 조사한 것에서는 평균 415, 245의 집락이 형성되었고 광역학 치료군인 ALA의 농도 10, 5, 2.5, 1.25 mg/mL에서 109, 225, 297, 285개의 집락이 형성되었다(Figures 1, 2).

Fig. 1. The colony counted to P. aeruginosa after photodynamic therapy (PDT) with 5-aminolevulinic acid (ALA) concentrations each 10, 5, 2.5, 1.25 mg/mL with irradiated 630 nm LED on suspensions. P-L-; Not treated bacterial suspensions, P-L+; Only irradiated to LED, 10~1.25; ALA concentrations each 10∼1.25 mg/mL with LED irradiated to bacterial suspensions.

Fig. 2. The photography are colony forming image of P. aeruginosa on MacConkey agar after photodynamic therapy (PDT) and control groups. (A) No treated, (B) LED only, (C∼F) 5-aminolevulinic acid (ALA) concentrations each 10, 5, 2.5 and 1.25 mg/mL with irradiation to 630 nm LED.

2. E. faecalis의 CFU측정

E. faecalis는 대조군인 control은 평균 8750개, LED만 조사한 군은 평균 8,000개의 집락이 형성되었다. 이와 반해 광역학 치료군인 ALA의 농도 5 mg/mL에서는 집락형성이 없었고, ALA의 농도 2.5, 1.25, 0.625 mg/mL에서는 2,350, 4,825, 7,475개의 집락이 형성되었다(Figures 3, 4).

Fig. 3. The colony counted to E. faecalis after PDT with 5-aminolevulinic acid (ALA) concentrations each 5, 2.5, 1.25, 0.625 mg/mL with irradiated 630 nm LED on suspensions.
P-L-; Not treated bacterial suspensions, P-L; Only irradiated to LED, 5~0.625; ALA concentrations each 5~0.625 mg/mL with LED irradiated to bacterial suspensions.

Fig. 4. The photograpy are colony forming image of E. faecalis on trypticase soy agar after photodynamic therapy (PDT). (A) No treated, (B) LED only, (C∼F) 5-aminolevulinic acid (ALA) concentrations each 10, 5, 2.5 and 1.25 mg/mL with irradiation to 630 nm LED.

광역학적 치료는 최근 코로나 바이러스 대유행과 맞물려 메틸렌블루 매개치료기반으로 COVID-19의 호흡기 감염에 사용될 수 있다는 제안을 한 연구자도 있다[20]. 광역학치료는 미생물 감염을 제거하기 위해 사용되는 유망한 새로운 방법이며, 피부 상처를 치료하기 위한 중요한 혁신적인 대체 치료법이다. 피부 궤양, 피부 농양, 피부 축농증 등 감염성 피부 상처에 대한 치료는 진전됐지만 PDT가 치유를 유도하는 메커니즘은 여전히 불분명하다.

그람 음성균인 P. aeruginosa 감염은 치료하기 어렵다. P. aeruginosa는 심각한 피부 상처와 비뇨기 및 호흡기 감염에 흔한 병원체이다. Tan 등[21]은 ALA을 이용한 PDT가 플랑크톤성 및 생존 가능한 바이오필름 관련 P. aeruginosa 세포를 죽이고, 바이오필름 구조를 파괴하고, 바이러스 인자 분비를 감소시키며, 유전자 발현에 영향을 줄 수 있다고 보고하였다. 또한 피부 상처로 인한 P. aeruginosa 감염의 발생률이 증가하고 있다. 따라서 본 연구에서는 일차적으로 치료의 가능성여부를 탐색하고자 P. aeruginosa에 대한 ALA를 이용한 PDT의 억제효과를 검증하였고, 630 nm의 적색의 LED 빛만 조사하였을 경우에도 대조군 평균 415개의 집락형성과 비교하였을 때, 평균 245개의 집락이 형성된 점을 보면 광역학치료군 중 ALA의 농도 5 mg/mL에서 225개의 집락이 나와 저농도 광역학치료군과 비슷한 항균효과가 있는 것으로 판단되며, 향후 LED 빛조사 만으로도 항균효과가 있는 것은 에너지 밀도별 비교실험과 메커니즘 연구가 필요할 것이다. 그리고 E. faecalis 또한 대조군 평균 8,750개의 집락이였고 LED 빛만 조사하였을 경우에도 8,000개의 집락이 형성되어 P. aeruginosa보다는 다소 떨어지지만 일부 억제가 되는 것으로 사료된다.

2013년, Reena과 Karthika [22]에 의하면 광역학치료는 3가지의 인자인 광감작제, 광원과 산소가 필요하며 여드름치료에 사용되는 광감작제는 ALA가 대부분이며, 새로운 광감작제로 indocyanine green (ICG)와 indole-3-acetic acid를 제시하였다. 이와 같이 P. aeruginosa와 E. faecalis의 치료에도 다양한 계열의 광감작제와 광원을 적용하여 최대효과를 낼 수 있는 광범위한 실험이 필요할 것으로 사료된다.

2011년, Kwon [23]은 Vancomycin-resistant Enterococci에 대한 100% 사멸을 porphyrin 계열인 photogem과 LED 광원을 이용하여 증명하였다. 같은 광원으로 photogem 50 μg/mL인점을 감안할 때 이번 연구에서 볼 때 ALA를 이용한 PDT는 10 mg/mL 고농도에도 P. aeruginosa는 완전 사멸효과를 볼 수 없었으나, E. faecalis는 5 mg/mL에서 완전 사멸하였고 2.5 mg/mL에서 평균 4,075개의 집락을 보였다. 이런 결과로 미루어 porphyrin 계열인 photogem보다 효과가 더 미약함을 알 수 있었다.

그리고 세균의 광역학치료에는 1990년대에는 그람양성균과 그람음성균 사이에는 광역학치료의 감수성이 기본적으로 그람양성균은 일반적인 중성이나 음성광감작제 분자와 효과적으로 결합하고 광역학적 비활성이 일어나는 반면에 그람음성세균의 외막은 거의 대부분이 적은 범위에 결합하기 때문에 그람양성보다 광역학적 치료가 어려운 것으로 알려져 있다.

2004년 Hamblin MR 등[7]의 선행연구에서 보듯이 기존의 포르피린 계열의 광감작제로 박테리아를 광비활성화하려는 시도에서 얻은 중요한 관찰 중 하나는 광역학적 불활성화에 대한 그람양성균의 상대적 민감도 뛰어난 반면 그람음성균주는 훨씬 더 내성이 높았다. 그람양성균은 생리적이거나 세포막의 pep-tidoglycan이나 lipoteichoic acid와 같은 비교적 투과성이 좋은 층으로 둘러싸여 있어서 감수성이 높은 것으로 설명된다[24, 25].

본 연구의 ALA를 이용한 PDT 결과에서도 그람음성균인 P. aeruginosa 보다 E. faecalis의 효과가 더 좋은 것으로 나왔다. 광역학치료의 메커니즘을 보기 위한 ROS 측정 및 광감작제의 축적시험 등이 이뤄지지 않았으나 일차적인 항균효과에 대한 것은 검증되었다. 앞으로 추가 연구를 통해 다양한 광감작제의 치료효과, 에너지밀도별 효과 및 메커니즘 연구가 이뤄져야 할 것으로 사료된다.

본 연구의 목적은 630 nm light emitting diode (LED)와 광감작제인 5-aminolevulinic acid (ALA)를 이용하여 병원균에 대한 광역학치료의 효과를 평가하는 것이었다. 1.5×10⁴ cells/mL의 세균 현탁액을 ALA 농도의 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 mg/mL로 희석하여 30분간 배양 후 LED (energy density 18 J/cm²)빛을 조사하였다 그 결과는 P. aeruginosa 에서는 광감작제를 처리하지 않은 군과 LED 빛만을 쬔 것은 각 평균 415, 245개가 형성되었다. 이에 반해 광역학 치료군인 ALA의 농도 10, 5, 2.5, 1.25 mg/mL에서 평균 109, 225, 297, 285개의 집락이 형성되었다. E. faecalis에서는 대조군인 광감작제를 처리하지 않은 군은 평균 8,750개의 집락을 형성하였고 빛만 쬔 군은 평균 8,000개의 집락을 형성하였다. 이에 반해 광역학 치료군인 ALA의 농도 5, 2.5, 1.25, 0.625 mg/mL에서 평균 0, 2350, 4825, 7475개의 집락이 형성되었다. 결론적으로 그람음성균이 P. aeruginosa 보다 E. faecalis에서 더 좋은 광역학 치료효과를 보였으며, ALA와 630 nm LED를 이용한 광역학 치료의 가능성을 증명하였다.

This paper was supported by Wonkwang Health Science University in 2021.

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Kwon PS, Professor.