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Effects of Saccharomycopsis fibuligera Fermentation on the Antioxidant and Anti-inflammatory Activity of Kerria japonica Flower Extract
Korean J Clin Lab Sci 2022;54:209-216  
Published on September 30, 2022
Copyright © 2022 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Sang-Nam Park1, Ok Hee Lee2

1Department of Clinical Laboratory Science, Kyungdong University, Wonju, Korea
2Department of Health Management, Kyungdong University, Wonju, Korea
Correspondence to: Ok Hee Lee
Department of Health Management, Kyungdong University, 815 Gyeonhwon-ro, Munmak-eup, Wonju 26495, Korea
E-mail: loh1126@kduniv.ac.kr
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5049-3996
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
The effect of Saccharomycopsis fibuligera fermentation on the antioxidant and anti-inflammatory activity of Kerria japonica (K. japonica) extracts was studied. First, the antioxidant activity of the fermented extract was measured using the 2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azinobis (3-ethylbenzthiazoline 6-sulfonic acid (ABTS) methods. Also, the quantification of polyphenols and flavonoids, which are representative components with antioxidant activity, was performed. The results of the DPPH and ABTS assays showed an increase in the antioxidant activity by 14.39% and 21.74%, respectively, due to fermentation. The polyphenol concentration increased by 10.5%, and the flavonoid concentration increased by 100.0%. In the cell experiment, a cytotoxicity test and a nitric oxide (NO) production inhibitory test were performed using RAW 264.7 cells. Both the control group and the fermentation group showed no cytotoxicity. In the NO production inhibition experiment, the fermentation group showed a 6.85% higher inhibition of NO production compared to the control group. When the inhibitory effects of the extracts on inflammatory cytokine production were assessed, the fermentation group showed 12.4% and 23.5% higher inhibition of interleukin (IL)-1β and IL-6 production, respectively, compared to the control group. In conclusion, due to its potential for inhibiting NO and inflammatory cytokine production, fermented K. japonica extracts could be considered a source of anti-inflammatory compounds.
Keywords : Antioxidant, Cytokine, Fermentation, Inflammation
서 론

평균수명의 증가와 동시에 삶의 질을 추구하는 경향이 강해지며, 건강하게 늙는 것에 중점을 두는 생활 방식인 “well-aging”에 대한 관심이 증가하고 있다. 이러한 관심에 따라 생물학적인 노화와 노화를 최대한 늦추는 “anti-aging”에 대한 관심이 증가하고 있다. 일반적으로 말하는 인간의 노화는 개체노화(organismal aging)에 해당되며, 개체노화의 주원인으로는 세포노화(cellular senescence)가 있다[1]. 세포의 노화는 DNA의 손상, telomere의 단축, 종양유전자의 활성화, 세포 소기관 스트레스 등의 이유로 시작되며, 이들의 암의 예방, 조직의 재생 등에 밀접하게 관련되어 있다[2]. 이러한 세포의 노화에서 가장 중요한 요소는 free radical, 즉 다른 분자와 쉽게 반응하는 물질들로[3], 대표적으로는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)이 있다[4]. 이러한 free radical은 DNA를 비롯하여 여러 세포 내의 macromolecule을 산화시켜 제 역할을 하지 못하게 만들고, 이러한 손상이 누적되는 과정을 노화 과정이라 할 수 있다[5].

노화로부터 세포를 보호하기 위한 방법 중에서 가장 대표적인 것은 세포에서 과도하게 생성된 활성산소를 제거하는 것이다[6]. 세포에서 활성산소가 생성되는 요인으로는 미토콘드리아의 문제와 염증이 대표적이다[7, 8]. 특히 염증에 의한 노화를 의미하는 염증성 노화(inflammaging)에 대한 관심이 높아지고 있다[9, 10]. 염증반응은 pathogen, toxin, xenobiotic와 같은 세포에 유해한 영향을 주는 물질을 소거하기 위한 반응으로 활성산소의 생성을 통해 유해물질을 소거하여 세포를 지킨다. 하지만 과도하게 생산된 활성산소는 오히려 세포 및 조직을 손상시킬 수 있다[11, 12].

이러한 이유로 염증성 노화를 막기 위해 다양한 항산화 물질과 항염 물질이 연구되어지고 있다. 대표적인 연구 대상인 식물 유래 추출물에는 polyphenol과 flavonoid, anthocyanin, chlorophyll 등 다양한 항산화 물질 및 항염 물질이 존재하는데 이러한 성분들을 phytochemical이라고 하며 식물이 지니고 있는 다양한 phytochemical의 특성이 연구되고 있다[13].

본 연구에서 다루는 황매화(Kerria japonica)는 동아시아 3국에서 관상용으로 흔히 재배되는 식물로 높이는 2 m 내외이고 꽃은 4∼5월에 황색으로 잎과 같이 피고 가지 끝에 달린다. 황매화에는 항염 작용이 있는 flavonoid가 있다고 보고되었다[14]. 이러한 식물의 polyphenol 및 flavonoid의 경우 일부 작용기에 당이 결합되어 있는 배당체인 경우가 많으며 해당 성분 역시 배당체로 밝혀졌다. 이러한 배당체의 경우 비배당체에 비해 피부 침투 및 흡수, 활성이 낮아 당 결합을 제거하여 비배당체로 사용하는 경우가 많으며, 이 결합을 제거하는 방법 중 하나가 발효이다[15]. 본 연구의 목적은 미생물의 효소를 통해 황매화의 물질 전환을 위한 발효에 해당되며, 이는 일반적으로 biotransfor-mation에 해당된다[16]. 황매화에는 linariin과 isolinariin과 같은 배당체 형태의 flavonoid가 존재하며[14], 이를 비배당체로 전환할 경우 pectolinarigenin으로 전환되어 더 높은 효과를 나타낼 것으로 예상된다.

발효에는 Saccharomycopsis fibuligera를 사용하였다. S. fibuligera는 대표적인 효모인 Saccharomyces cerevisiae에 비해 S. fibuligera의 경우 α-amylase, glucoamylase, acid protease, β-glucosidase 등 다양한 분해 효소를 생산하며, 이런 분해 효소는 식물세포의 분해하여 추출을 도울 뿐만 아니라 추출 물질의 분자 구조를 변환하는데 사용되어 추출 물질의 활성을 증가시킬 수 있다[17]. 이에 황매화 추출에 있어 S. fibuligera 발효가 기존 황매화 추출물의 항산화능 및 항염능을 증가시켜 황매화의 상업적 이용 가능성을 증가시킬 수 있는지에 대해 연구를 실시하였다.

재료 및 방법

1. 발효 및 추출 방법

실험에는 경기도 양주시에서 채집된 황매화의 꽃 부위를 실온의 증류수로 세척 후 10°C 내외의 온도에서 직사광선이 닿지 않는 곳에서 건조하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 황매화는 실험 전 121°C, 15분간 멸균과정을 거쳐 발효 과정에서 S. fibuligera 외의 균이 혼입되는 것을 방지하였다.

발효 균주로는 생물자원센터에서 분양받은 S. fibuligera KCTC 7806을 사용하였다. 한편 추출용매로는 yeast malt broth (YM broth) (yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L, peptone 5 g/L, glucose 10 g/L, distilled water 1 L) (BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였다.

황매화 추출을 위해 황매화와 YM broth를 4% (w/v)로 혼합하였다. 대조군으로는 균을 접종하지 않은 황매화를 넣은 YM broth을 사용하였으며, 실험군으로는 황매화를 넣은 YM broth에 전배양된 S. fibuligera (O.D 600 nm 1.0)를 1% 농도로 접종하여 사용하였다. 일반 추출 및 발효 추출은 1일간 27°C에서 30 rpm으로 진탕하여 추출과정을 진행하였다.

대조군 및 실험군을 Whatman qualitative filter paper, Grade 2 (Whatman, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 황매화 및 S. fibuligera를 제거하였으며 걸러진 용액은 동결건조를 이용하여 용매를 제거하였다.

2. Polyphenol 함유량 측정

Polyphenol 함유량 측정은 Folin-Ciocalteu 시약(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용한 방법으로 실시하였다[18]. 황매화 추출물 1.0 mL와 Folin-Ciocalteu 시약 1.0 mL를 혼합한 후 5분 동안 반응시켰다. 그 후 7% CaCO3 용액(w/v) 1.0 mL와 증류수 0.4 mL를 혼합한 뒤 30분 동안 반응시켰다. 그 후 765 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

한편 polyphenol 농도를 확인하기 위해 동일한 방법으로 gallic acid (Tokyo chemical industry, Tokyo, Japan)를 농도별로 측정하여 standard curve를 작성한 뒤 이를 기준으로 환산하였다.

3. Flavonoid 함유량 측정

Flavonoid와 알루미늄이 반응하였을 때 진한 갈색으로 반응하는 것을 이용하여 flavonoid 측정을 하였다[18]. 황매화 추출물 1.0 mL와 5% NaNO2 용액(w/v) 0.3 mL를 혼합 후 5분 동안 반응시켰다. 그 후 2% AlCl3 용액(w/v) 0.5 mL를 시료와 혼합한 뒤 6분 동안 반응시켰다. 마지막으로 1 M NaOH 0.5 mL를 혼합하였다. 그 후 10분 동안 반응 후 510 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

한편 flavonoid 농도를 확인하기 위해 동일한 방법으로 quercetin (Tokyo chemical industry, Tokyo, Japan)을 농도별로 측정하여 standard curve를 작성한 뒤 이를 기준으로 환산하였다.

4. DPPH 라디컬 소거능 측정

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 소거능 측정에는 Blois [19]의 방법을 이용하였다. DPPH 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 70% ethanol로 녹인 뒤 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디컬의 감소율 계산이 용이하도록 흡광도가 1.00이 되도록 70% ethanol로 추가 희석하여 실험에 사용하였다. 일정한 농도로 희석한 황매화 추출물 또는 황매화 발효 추출물 0.1 mL를 DPPH 용액 1.0 mL와 혼합하였다. 30분 동안 반응시킨 후 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

대조군과 실험군, ascorbic acid (Tokyo chemical industry, Tokyo, Japan)의 EC50 기준으로 항산화능을 비교하였다.

5. ABTS 라디컬 소거능 측정

2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 소거능 측정은 Re [20]의 방법을 이용하였다. ABTS 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 발색 전 7 mM ABTS 용액에 2.45 mM potassium persulfate를 녹여 초록색으로 발색되도록 하였다. 혼합 후 반응이 충분히 일어나도록 24시간 이상 반응시킨 뒤 734 nm에서의 흡광도를 측정하여 흡광도가 0.7이 되도록 희석하여 사용하였다. 정한 농도로 희석한 황매화 추출물 또는 황매화 발효 추출물 0.5 mL와 ABTS 용액 1.0 mL를 혼합 후 30분간 반응시켰다. 그 후 734 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군과 실험군, ascorbic acid의 EC50을 기준으로 항산화능을 비교하였다.

6. 세포 독성 측정

세포 독성 실험에는 RAW 264.7 cell을 사용하였다. 세포의 배양에는 DMEM broth (GE healthcare, Chicago, IL, USA) 445 mL와 fatal bovine serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 50 mL, antibiotics (100×) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 5 mL를 사용하였다.

세포 독성 측정 방법으로는 MTT assay를 사용하였다. 먼저 RAW 264.7 세포주를 96 well plate에 well 당 배양액 200 μL, 세포 1×104 cell이 들어가도록 농도를 조절하여 주입한 뒤, 37°C, 5% CO2 환경에서 24 시간 동안 세포가 well plate에 부착되도록 배양하였다. 배양이 끝난 후 황매화 추출물을 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 48 시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 제거하고 MTT 용액(5 mg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 넣어 MTT의 결정이 생성되도록 하였다. 각 well에 생성된 결정은 DMSO로 녹여 흡광도를 측정하였다.

7. NO 생성 억제능 측정

염증에 의한 NO (nitric oxide) 생성을 측정하는 데에는 동일한 RAW 264.7 cell을 사용하였다. 염증의 유도에는 LPS (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하였다.

염증에 의한 NO 농도 측정에는 griess reagent (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 먼저 RAW 264.7 세포주를 96 well plate에 well 당 배양액 200 μL, 세포 1×104 cell이 들어가도록 농도를 조절하여 주입한 뒤, 37°C, 5% CO2 환경에서 24 시간 동안 세포가 well plate에 부착되도록 배양하였다. 배양이 끝난 후 황매화 추출물을 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 48 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 각 well에서 배양액 100 μL 씩 다른 well plate로 옮긴 뒤 griess reagent 100 μL를 주입하여 NO의 농도에 비례하여 발색됨을 확인한 뒤 540 nm 파장에서의 흡광도를 확인하였다. 이때 LPS 처리군과 황매화 추출물 및 발효 추출물 처리군의 NO 생성양을 비교하여, 염증 억제능을 측정하였다.

8. 염증성 cytokine 측정

염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6 cytokine 통해 염증 반응의 일부 기전을 확인하였다. 염증에 의한 IL-1β, IL-6 cytokine 생성을 측정하는 데에는 동일한 RAW 264.7 cell을 사용하였다.

염증성 cytokine 측정은 IL-1β, IL-6 ELISA kit (Koma biotech, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 세포의 배양 및 염증 유도는 ‘NO 생성 억제능 측정’에서 사용된 방법과 동일한 방법을 사용하였으며, 최종 세포 배양액을 ELISA kit의 사용법에 맞추어 pre-coated 96 well ELISA plate에 0.1 mL씩 처리한 뒤 2시간 반응시킨 후 wash buffer를 이용해 세척하였다. 그 후 detection antibody를 0.1 mL 처리 후 다시 2시간 반응시킨 후 세척을 진행하였다. 그 후 streptavidin-horseradish peroxidase (HRP)를 0.1 mL 처리 후 30분 반응시킨 후 세척을 진행하였으며, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 0.1 mL 주입하여 3분간 반응시킨 후 stop solution으로 반응을 정지시킨 뒤 450 nm 파장에서 흡광도를 확인하였다. 실험 결과는 해당 kit에 포함된 표준물질을 통해 정량하였다.

9. 결과 처리

본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 진행하였으며, Minitab 18.1 (Minitab, State College, PA, USA)을 이용하여 평균 및 표준편차를 계산한 뒤, 2 sample t-test를 통해 통계적 유의성을 확인하였다. EC50의 계산에는 Chen 등[21]의 방법을 사용하였다.

결 과

1. 추출 수율

대조군의 추출용액과 발효 황매화군의 추출용액을 건조하여 건조 중량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 대조군의 경우 10.0 mg/mL로 나타났으며, 발효군의 경우 11.2 mg/mL로 나타났다. 추출 수율은 각각 대조군은 25.0%, 발효군은 28.0%로, 대조군은 250 mg/g, 발효군은 280 mg/g으로 수율을 나타낼 수 있으며, 발효군의 실험 결과가 높게 나타났다.

Dry weight and yield of K. japonica extract

Extract dry weight (mg/mL) Yield (%)
NFK 10.0±1.2 25.0±3.0
FK 11.2±1.1 28.0±2.7

Data are presented as mean±SD.

Abbreviations: NFK, not fermented K. japonica; FK, fermented K. japonica.



2. 총 polyphenol 함량

황매화 대조군과 발효군의 polyphenol 함량을 계산한 결과는 Figure 1과 같다. 대조군의 경우 polyphenol 함량을 gallic acid로 환산하였을 때 91.50±2.10 mg/g으로 나타났다. 한편 발효군의 경우 polyphenol 함량을 gallic acid로 환산하였을 때 101.09±3.32 mg/g으로 나타났다. 대조군과 발효군을 t-test를 통해 검정한 결과 P 값은 0.024으로 유의적인 차이를 나타냈다.

Fig. 1. Total phenolic contents of K. japonica. Abbreviations: See Table 1. *P<0.05.

3. 총 flavonoid 함량

황매화 대조군과 발효군의 flavonoid 함량을 계산한 결과는 Figure 2와 같다. 대조군의 경우 flavonoid 함량을 quercetin으로 환산하였을 때 2.4±0.8 mg/g으로 나타났다. 한편 발효군의 경우 flavonoid 함량을 quercetin으로 환산하였을 때 4.8±0.9 mg/g으로 나타났다. 대조군과 발효군을 t-test를 통해 검정한 결과 P 값은 0.041으로 유의적인 차이를 나타냈다. 한편 대조군에 비해 발효군의 flavonoid 함량이 증가하였다. 이는 polyphenol에서 보인 경향과 유사하다.

Fig. 2. Total flavonoid contents of K. japonica. Abbreviations: See Table 1. *P<0.05.

4. DPPH 라디컬 소거능

황매화 대조군과 발효군의 DPPH 라디칼 소거능은 Figure 3과 같다. 항산화 물질의 기준 물질로 선택한 ascorbic acid의 EC50 수치는 42.2 μg/mL였다. 한편 대조군과 발효군의 경우 0.25∼4 mg/mL로 희석하여 실험을 진행하였으며, 대조군은 0.25 mg/mL 에서 5.32±0.86%, 0.5 mg/mL에서 15.34±1.32%, 1 mg/mL에서 37.67±1.24%, 2 mg/mL에서 84.35±1.53%, 4 mg/mL에서 94.12±1.2%의 라디컬 소거능을 보였으며, 1.26 mg/mL에서 EC50 수치가 나타났다. 발효군은 0.25 mg/mL에서 7.45±0.97%, 0.5 mg/mL에서 19.35±1.32%, 1 mg/mL에서 46.11±1.37%, 2 mg/mL에서 93.46±1.62%, 4 mg/mL에서 94.65±1.34%의 라디컬 소거능을 보였으며, 1.08 mg/mL에서 EC50 수치가 나타났다. EC50에 가까운 1 mg/mL 농도에서 대조군과 발효군의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P 값은 0.004로 유의적인 차이를 나타냈다. 한편 발효 후 항산화능이 높아진 것은 polyphenol과 flavonoid 같은 유효성분의 추출이 증가하여 나타난 결과로 생각된다.

Fig. 3. DPPH radical scavenging rate of K. japonica. Abbreviations: See Table 1. *P<0.05, **P<0.01.

한편 0.25 mg/mL와 4 mg/mL의 경우 통계적 유의성이 나타나지 않았는데, 0.25 mg/mL에서는 수치에 비해 실험에 의한 표준편차가 높게 나타났기 때문이며, 4 mg/mL에서는 DPPH의 라디칼을 전부 소거하여 수치의 차이가 나타나지 않았기 때문이다.

5. ABTS 라디컬 소거능

대조군과 발효군의 ABTS 라디칼 소거능은 Figure 4와 같다. 항산화 물질의 기준 물질로 선택한 ascorbic acid의 EC50 수치는 35.1 μg/mL였다. 한편 대조군과 발효군의 경우 0.25∼4 mg/mL로 희석하여 실험을 진행하였으며, 대조군은 0.25 mg/mL 에서 5.64±0.63%, 0.5 mg/mL에서 17.28±0.63%, 1 mg/mL에서 41.17±0.43%, 2 mg/mL에서 66.26±0.59%, 4 mg/mL에서 92.25±0.54%의 라디컬 소거능을 보였으며, 1.35 mg/mL에서 EC50 수치가 나타났다. 발효군은 0.25 mg/mL 에서 8.57±0.58%, 0.5 mg/mL에서 22.45±0.71%, 1 mg/mL에서 48.00±0.74%, 2 mg/mL에서 82.33±0.69%, 4 mg/mL에서 96.89±0.78%의 라디컬 소거능을 보였으며, 1.06 mg/mL에서 EC50 수치가 나타났다.

Fig. 4. ABTS radical scavenging rate of K. japonica. Abbreviations: See Table 1. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

EC50에 가까운 1 mg/mL 농도에서 1 mg/mL 농도에서 대조군과 발효군의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P 값은 0.001로 유의적인 차이를 나타냈다. 한편 식 1을 통해 EC50을 바탕으로 비교했을 때, 발효를 통해 21.48%의 항산화능 개선 효과가 나타난 것으로 파악된다. 이는 DPPH에서 확인된 14.28%의 개선효과에 비해 높게 나타났다.

Improvement rate (%)=EC50NFKEC50FKEC50NFK×100

6. 세포 독성

대조군과 발효군의 세포 독성 측정을 위해 MTT assay를 이용한 세포독성을 측정, 계산한 결과는 Figure 5와 같다.

Fig. 5. Cytotoxicity of K. japonica. Abbreviations: See Table 1.

대조군의 경우 25 μg/mL 농도에서 97.12±2.47%, 50 μg/mL 농도에서 93.73±1.76%, 100 μg/mL 농도에서 89.57±2.79%, 200 μg/mL 농도에서 85.75±2.45%의 세포 생존율이 나타났으며, 발효군의 경우 25 μg/mL 농도에서 96.26±2.46%, 50 μg/mL 농도에서 95.90±2.24%, 100 μg/mL 농도에서 91.66±1.60%, 200 μg/mL 농도에서 86.45±1.56%의 세포 생존율이 나타났다.

일반적으로 세포 독성의 기준으로는 ISO 10993-5의 기준을 이용하며 80% 이상의 세포 생존율을 나타낸 경우 독성이 없음으로 판단한다. 본 실험 결과에 이러한 기준을 적용하였을 경우 발효 전과 후 모두 모든 실험 농도에서 세포독성이 나타나지 않은 것으로 판단할 수 있다.

7. NO 생성 억제능

대조군과 발효군의 염증 억제능 측정을 위해 NO 생성량을 측정한 결과는 Table 2와 같다.

NO inhibition rate of RAW 264.7 with K. japonica extract

Concentrate (μg/mL) NFK (%) FK (%)
25 5.23±2.27 8.19±3.35
50 13.64±3.08 18.48±2.81
100 27.56±3.73 34.59±4.31
200 40.57±2.15 47.43±2.09*

Data are presented as mean±SD.

*P<0.05.

Abbreviations: See Table 1.



대조군의 경우 25 μg/mL 농도에서 5.23±2.27%, 50 μg/mL 농도에서 13.64±3.08%, 100 μg/mL 농도에서 27.56±3.73%, 200 μg/mL 농도에서 40.57±2.15%의 NO 생성 억제율이 나타났으며, 발효군의 경우 25 μg/mL 농도에서 8.19±3.35%, 50 μg/mL 농도에서 18.48±2.81%, 100 μg/mL 농도에서 34.59±4.31%, 200 μg/mL 농도에서 47.43±2.09%의 NO 생성 억제율이 나타났다. 200 μg/mL 농도에서 대조군과 발효군의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P 값은 0.029으로 유의적인 차이를 나타냈다.

8. 염증성 cytokine 억제능

대조군과 발효군의 염증 억제능 측정을 위해 염증성 cytokine 생성량을 측정한 결과는 Table 3와 같다. 이를 바탕으로 식 2를 통해 염증성 cytokine의 억제율을 계산하였다.

Inflammatory cytokine inhibition rate of RAW 264.7 with K. japonica extract

Concentrate (μg/mL) LPS IL-1β (pg/mL) IL-6 (pg/mL)
NFK FK NFK FK
0 2.3±1.5 96.6±2.5
0 + 72.5±6.5 615.0±12.5
25 + 76.6±6.2 69.9±3.6 595.4±16.4 574.7±11.7*
50 + 66.4±4.1 62.3±2.9 572.8±12.9* 515.4±9.0**
100 + 60.7±5.8 51.1±3.5* 540.3±13.8** 464.2±13.4**
200 + 54.7±5.5* 37.6±4.5** 504.4±12.2*** 428.2±15.2***

Data are presented as mean±SD.

Compared with LPS positive control; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Abbreviations: See Table 1.



Cytokine inhibition rate (%)=Cccont.Ccexp.Cccont.×100

(Cc, cytokine concentration)


IL-1β 측정에서 대조군의 경우 25 μg/mL 농도에서 ‒5.7± 8.6%, 50 μg/mL 농도에서 8.4±5.7%, 100 μg/mL 농도에서 16.3±8.0%, 200 μg/mL 농도에서 24.6±7.6%의 IL-1β 생성 억제율이 나타났으며, 발효군의 경우 25 μg/mL 농도에서 3.6±5.0%, 50 μg/mL 농도에서 14.1±4.0%, 100 μg/mL 농도에서 29.5±4.8%, 200 μg/mL 농도에서 48.1±6.2%의 IL-1β 생성 억제율이 나타났다. 200 μg/mL 농도에서 대조군과 발효군의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P 값은 0.025으로 유의적인 차이를 나타냈다.

IL-6 측정에서 대조군의 경우 25 μg/mL 농도에서 3.2±2.0%, 50 μg/mL 농도에서 6.9±2.7%, 100 μg/mL 농도에서 12.1±2.1%, 200 μg/mL 농도에서 18.0±2.2%의 IL-6 생성 억제율이 나타났으며, 발효군의 경우 25 μg/mL 농도에서 6.6±0.0%, 50 μg/mL 농도에서 16.2±1.9%, 100 μg/mL 농도에서 24.5±1.5%, 200 μg/mL 농도에서 30.4±2.2%의 IL-6 생성 억제율이 나타났다. 200 μg/mL 농도에서 대조군과 발효군의 차이를 t-test를 통해 검정한 결과 P 값은 0.007으로 유의적인 차이를 나타냈다.

고 찰

추출수율의 경우 발효군에서 더 높은 추출수율을 나타냈다. S. fibuligera는 다양한 효소 그중에서도 cellulase와 organic acid를 생성할 수 있는데, 이들은 세포벽을 연화시킬 수 있고, 이에 세포 내 성분의 추출이 용이하게 되었을 것으로 보인다[17, 22]. 그 결과 대조군보다 높은 추출수율을 나타낸 것으로 보인다.

Polyphenol과 flavonoid 역시 발효군에서 더 높은 추출수율을 나타냈다. 이는 전술한 cellulase와 ethanol에 의한 추출이 주 이유로 예상된다. 그 예로 Martillanes 등[23]의 연구에서 cellulase를 첨가하여 약 4배의 polyphenol 추출 수율 증가를 나타내었으며, Huang 등[24]의 연구에서는 약 20%의 플라보노이트 추출 수율 증가를 나타내었다. 하지만 발효 균주 및 발효 기간, 발효 물질에 따라 산화적 대사과정에 의해 polyphenol 및 flavonoid가 감소하는 경우도 존재한다[25]. polyphenol 및 flavonoid의 감소에 의해 항산화능도 감소할 가능성이 있으나, 그 외의 항산화 물질의 추출 증가를 통해 polyphenol의 추출이 감소하였음에도 항산화능이 증가도 가능하다[26]. 본 연구에서 사용된 황매화의 flavonoid 중 linariin과 isolinariin에는 항염효과가 있다고 보고되었다[14].

한편 S. fibuligera를 이용한 발효에서는 S. fibuligera가 생산한 α-amylase, glucoamylase, acid protease, β-glucosidase외의 다양한 효소가 작용하여 flavonoid 배당체를 비배당체로 전환하여 flavonoid의 활성을 높일 수 있다[17, 22]. Zhang 등[27]의 flavonoid 배당체와 비배당체의 흡수와 관련된 연구에서 cyanidin, quercetin과 이 둘의 배당체의 흡수율을 비교한 결과 비배당체의 흡수율이 높은 것으로 나타났다. 이를 바탕으로 본 연구에서 발효한 황매화의 추출물은 추출 전에 비해 항산화능 및 세포 흡수율이 증가된 것으로 생각할 수 있다. 이러한 개선은 염증의 완화 효과의 증가로 나타났다. 항산화능과 마찬가지로 flavonoid 배당체의 경우 비배당체에 비해 높은 항염 활성을 가지고 있다[28].

최종적으로 S. fibuligera 발효가 황매화 추출물의 항산화 및 항염효과를 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 이에 플라보노이드의 정량 실험을 통해 linariin과 isolinariin과 같은 단일 성분의 변화를 추가로 분석해 보아야 한다. 이를 통해서 효모 뿐만 아니라 발효에 필요한 효소를 가진 세균을 이용한 발효 및 S. fibuligera와의 co-fermentation에 대한 가능성에 대해 향후 연구가 가능할 것으로 생각된다.

요 약

발효된 황매화의 상업적 사용 가능성을 확인하기 위하여 항산화능 실험과 세포 독성, 항염능 실험을 실시하였다. 항산화능 실험에는 DPPH 실험, ABTS 실험, polyphenol 농도 측정, flavonoid 농도 측정을 실시하였다. polyphenol과 flavonoid 농도 측정에서는 발효군이 대조군에 비해 높은 농도를 나타내어, 발효를 통해 추출물의 유효성분 및 추출 수율을 높인다는 것을 확인하였다. DPPH, ABTS에서는 대조군에 비해 발효군의 항산화능이 높은 것을 확인하였다. 이는 S. fibuligera가 발효 과정에서 생산해 낸 효소에 의해 황매화의 세포벽 연화와 유기산과 에탄올 생성에 의한 추출 수율 증가에 의한 요인으로 생각된다.

항염능 실험에서는 세포 독성과 항염능을 알아보았다. 세포독성의 경우 대조군과 발효군 모두 낮은 세포독성을 보였으며, 염증 전달 물질인 NO 생성 억제능의 경우 발효군이 대조군에 비해 통계적으로 유의한 수준의 항염능 증가를 보였다. 염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6의 농도를 측정한 결과 200 μg/mL 농도에서 각각 48.1±6.2%, 30.4±2.2%의 억제효과를 나타내었다. 이를 통해 발효 황매화가 염증 억제를 위한 물질로서 사용가능함을 보였다.

Acknowledgements

None

Conflict of interest

None

Author’s information (Position)

Park SN1, Professor; Lee OH2, Professor.

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