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Comparison of Laboratory Tests Applied for Diagnosing the SARS-CoV-2 Infection
Korean J Clin Lab Sci 2022;54:79-94  
Published on June 30, 2022
Copyright © 2022 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Chang-Gun Lee1, Dongsup Lee2

1Department of Medical Genetics, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea
2Department of Clinical Laboratory Science, Hyejeon College, Hongseong, Korea
Correspondence to: Dongsup Lee
Department of Clinical Laboratory Science, Hyejeon College, 19 Daehak 1-gil, Hongseong 32244, Korea
E-mail: eastern3547@naver.com
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4375-2731
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Due to the highly contagious nature and severity of the respiratory diseases caused by COVID-19, economical and accurate tests are required to better monitor and prevent the spread of this contagion. As the structural and molecular properties of SARS-CoV-2 were being revealed during the early stage of the COVID-19 pandemic, many manufacturers of COVID-19 diagnostic kits actively invested in the design, development, validation, verification, and implementation of diagnostic tests. Currently, diagnostic tests for SARS-CoV-2 are the most widely used and validated techniques for rapid antigen, and immuno-serological assays for specific IgG and IgM antibody tests and molecular diagnostic tests. Molecular diagnostic assays are the gold standard for direct detection of viral RNA in individuals suspected to be infected with SARS-CoV-2. Antibody-based serological tests are indirect tests applied to determine COVID-19 prevalence in the community and identify individuals who have obtained immunity. In the future, it is necessary to explore technical problems encountered in the early stages of global or regional outbreaks of pandemics and provide future directions for better diagnostic tests. This article evaluates the commercially available and FDA-approved molecular and immunological diagnostic assays and analyzes their performance characteristics.
Keywords : Laboratory tests, Molecular diagnostics tests, RT-qPCR, SARS-CoV-2, Serological assays
서 론

미국의 세계적인 바이러스 학자이자 전염병 분석 기업 메타바이오타(Metabiota) 창립자인 Nathan Daniel Wolfe는 2020년 6월 30일 서울 포럼 2020 (2020 Seoul Forum) 개막식 기조연설에서 “SARS-CoV-2는 우리가 상상할 수 있는 최악의 바이러스는 아니지만, 현재의 상황이 평균 50년 혹은 그 이상에 한 번 발생할 사건이라는 것은 분명하다. 다행인 점은 전 세계는 COVID-19를 통해 전염병의 위험성에 주목하고 있다는 사실이며, 미래에 또 다시 발생할 팬데믹(pandemic)에 대비할 수 있는 절호의 기회가 주어졌다. 세계가 앞으로 3∼5년을 어떻게 준비하느냐에 따라 인류의 미래는 달라질 것이다.”라며, 코로나19의 대유행 이후의 변화를 기회로 포스트 코로나에 대한 인류 미래의 과제에 대하여 조언하였다. 세계적으로 유행하는 전염병 등에 대하여 글로벌 연대로써 신속하게 대응하며, 실용성과 도덕적 가치를 아우르는 보편적 가치를 도입하여, 인류의 미래에 미칠 결과에 대한 예측이 이루어져야 한다는 의미이다.

2019년 12월 중국 후베이성 우한시(Wuhan, Hubei province, China)에서 인간에게 유행성 전염병(pandemic)인 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS)을 유발하는 코로나바이러스(coronavirus)가 출현하였으며, 빠르게 전 세계로 확산되었다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에서 2020년 2월 11일 그 바이러스를 SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coro-navirus 2)로, 그리고 그로 인한 질환을 coronavirus disease 2019 (COVID-19)라고 명명하였다[1].

2022년 4월 1일 COVID-19은 전 세계 225개국에서 4,800만 명 이상 확진되었고 600만 명 이상이 사망하였으며 치명률(fatality rate)은 1.34%였다(2022. 4. 1. WHO 자료). 백신접종은 1,100만 명 이상 접종받았다. 우리나라의 경우 1,300만 명 이상이 감염되었고, 17,000명 이상이 사망하여 0.12%의 치명률(질병관리청 코로나바이러스감염증-19 자료)을 나타내고 있으며, 백신 접종률은 2차 이상 접종한 국민이 86.7% (44,498,619명)였다. 우리나라는 국민들의 높은 백신접종률과 의료진의 헌신 그리고 신속하고 정확한 대규모 진단검사가 질병의 확산속도와 치명률을 낮추는데 중추적인 역할을 하였다. 특히 COVID-19의 확진검사에서 빠르고 정확한 진단검사를 위해 검체 채취에서 진단검사 그리고 안전관리 분야에 이르기까지 임상병리사들의 역할이 절대적이었다[2].

1. SARS-CoV-2 구조 및 genome

SARS-CoV-2의 genome 크기는 약 30 kb이며, 외피를 보유한 양성 단일가닥 RNA 바이러스(enveloped positive-sense single-stranded RNA virus)이다[3]. 베타코로나바이러스 속(genus beta-coronavirus)에 속하며 지름은 80∼120 nm이다. 코로나바이러스는 특징적으로 표면에 돌출된 스파이크 당단백질(spike glycoproteins)을 전자현미경으로 관찰하면 왕관과 유사하여 명명되어졌다. SARS-CoV-2 genome은 4가지 주요 구조 및 기능성 단백질인 스파이크(spike, S), 막(membrane, M), 외피(envelope, E), 그리고 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid proteins, N)을 암호화한다. S 단백질은 두 개의 S1과 S2 기능성 서브유닛(subunits)으로 구성되어 있으며, S1은 숙주세포에 존재하는 수용체인 angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)를 인식하고 결합하는 역할을 하고 S2는 막 융합을 매개한다. M 단백질은 바이러스의 형태를 나타내는 가장 풍부한 단백질이며, N 단백질은 바이러스 감염 동안 가장 많이 배출되는 바이러스성 단백질로 감염 후 첫 2주 이내에 혈청 및 소변 검체에서 검출될 수 있다. 가장 작은 주요 구조 단백질인 E 단백질은 바이러스의 조립(assembly) 및 발병과정(pathogenesis)에 관여한다(Figure 1) [1, 4, 5].

Fig. 1. SARS-CoV-2 structure, func-tional proteins, genome organization, and diagnostic targets.
Abbreviations: UTR, untranslated region; ORF, open reading frame; RdRp, RNA dependent RNA polymerase; S, spike protein; E, envelope protein; M, membrane protein; N, nucleocapsid protein; RBD, receptor-binding domain; RBM, receptor binding motif; FP, fusion peptide; HR, heptad repeat; TM, transmembrane domain; CP, cytoplasmic domain.
References [1, 4, 5].

2. SARS-CoV-2 핵산 진단을 위한 바이오마커(biomarker)

SARS-CoV-2 핵산 증폭검사(nucleic acid amplification test, NAATs)에는 WHO의 지침에 의해 E 단백질 유전자를 선별 검사(screening tests)로 포함하고 있으며, 확정검사(confirmation test)로는 SARS-CoV-2의 특이 유전자인 open reading frame 1b (ORF1b)의 RdRp (RNA dependent RNA polymerase) 유전자 부분을 권장하고 있다. ORF는 효소 등을 포함한 기능에 관련된 단백질을 주로 생성하며, ORFS, ORFE, ORFM, ORFN, ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8의 9개 하위 유전자로 구성되어 있다[5, 6]. 임상검체에서 비특이적(non-specific)이고 약한 증폭(weak amplification)이 관찰될 수 있으므로, 이 두 유전자가 양성인 경우 COVID-19 양성으로 판독한다[3, 7].

핵산 측정 검사(nucleic acid assays)는 특히 경증에서 급성감염의 경우 진단목적으로 이용된다. 이 검사의 경우 SARS-CoV-2 RNA 추출을 위하여 상부와 하부 호흡기관 검체는 비인두(nasopharyngeal, NP) 또는 구강인두(oropharyn-geal, OP) 표본, 객담(sputum), 기관내 흡인물(endotracheal aspirate), 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage, BAL) 또는 타액(saliva)에서 채취한다[8]. 분석의 민감도는 감염과정에서 바이러스 로드(viral load)에 의한 시간 프로필에 의해 영향을 받는다. 바이러스 로드는 증상이 나타나기 직전 또는 그 직후에 최고조(peaks)에 도달한 후 7일 동안 빠르고 단조롭게 감소한다[9, 10]. 또한 바이러스에 대한 항원을 채취할 시에 검체의 품질(quality)은 SARS-CoV-2의 핵산 측정 검사를 시행하는데 있어 감염의 초기 및 후기에 위음성(false negative)으로 나타날 수 있는 요인으로 작용할 수 있어, 검체의 확보에 있어 적절한 시기와 정확한 채취가 필요하다[11].

3. SARS-CoV-2 면역 기반 진단을 위한 바이오마커(biomarker)

SARS-CoV-2에 의해 유발되는 면역반응은 anti-SARS-CoV-2에 대한 면역글로불린 M (immunoglobulins M, IgM), 면역글로불린 G (immunoglobulins G, IgG), 그리고 면역글로불린 A (immunoglobulins A, IgA)의 3가지 면역글로불린이 분비된다. 이 면역글로불린들은 증상이 없거나 회복된 사람을 포함하여 COVID-19에 감염된 개인을 식별하기 위한 필수 바이오마커이다[3, 12].

IgM은 바이러스 감염 동안 첫 번째 방어선을 제공하며 반응은 감염 후 약 10일 정도에 다른 면역글로불린보다 일찍 생성되지만 20일 이후에는 급격히 감소하여 사라진다. 반면 IgG는 오랫동안 면역력과 면역학적 기억을 제공하며, 감염 후 13∼21일 이후부터 검출 가능하고 더 오랫동안 지속된다(Figure 2) [4, 8, 12-14]. 한편 그림에서 표시하지는 않았지만 혈액이나 타액 검체에서 IgA 레벨은 COVID-19 중증도(severity)와 상관관계가 있으므로 COVID-19 식별(identification)을 위한 생물학적 지표로 사용할 수 있다[15]. 그러나 감염 초기에 검출 가능한 항체가 부족하기 때문에 혈청학적 기반 면역측정법(serology-based immunoassays)은 활성 감염의 진단에는 적합하지 않다[16]. 하지만 혈청기반 검사는 COVID-19이 계속해서 확산됨에 따라 현재의 대유행의 역학을 이해하는 데 있어 점점 더 중요해지고 있다[16, 17].

Fig. 2. Timeline of diagnostic test for viral load, IgM and IgG at different phase of post SARS-CoV-2 infection.
Abbreviations: RT-qPCR, real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; IgM, immunoglobulin M; IgG, immunoglobulin G.
References [4, 8, 12-14].

4. SARS-CoV-2 검출을 위한 진단 검사(laboratory tests for the detection of SARS-CoV-2)의 분류

SARS-CoV-2 감염의 진단은 표준검사법으로 SARS-CoV-2 RNA의 특정 유전자를 검출하는 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time quantitative reverse transcription poly-merase chain reaction, RT-qPCR)이 이용되고 있다. 이 검사법은 개인의 감염 상태를 검출하고 대유행 제어 전략을 안내하는데 중요한 역할을 한다. 바이러스 항원을 동정하는 면역진단방법(immunodiagnostic methods)과 바이러스에 대한 면역반응을 인식하는 혈청학적 방법(serological testing)도 이용할 수 있다. 이 검사법은 COVID-19 질환에 대한 보호 면역을 가진 개인을 검출하고 피크 단계 후 업무에 복귀하는 정책을 안내할 수 있다[13, 14, 17].

Figure 3에는 일반적으로 사용되는 laboratory testing에 대한 요약이 제시되었다(Figure 3) [18].

Fig. 3. Laboratory test used for SARS-CoV-2 detection. Culture and microscopy are not used for laboratory tests but are used for research purposes.
Abbreviations: NAAT, nucleic acid amplification test; RT-PCR, reverse transcription-PCR; RT-RPA, reverse transcription-recombinase polymerase amplification; TMA, transcription-mediated amplification; NEAR, nicking enzyme-assisted reaction; RT-LAMP, reverse transcription–loop-mediated isothermal amplification; CRISPR-Cas, clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CRISPR associated (Cas); Ag-RDT, antigen rapid diagnostic test; LFIA, lateral flow immunoassay; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; CLIA, chemiluminescence immunoassay; FMI, fluorescent microparticle immunoassay; LFIA, lateral-flow immunoassay.
Reference [18].
본 론

1. 핵산증폭검사(nucleic acid amplification tests, NAATs)

WHO의 권고에 따라 상당수의 SARS-CoV-2의 핵산증폭검사 키트에는 E 단백질 유전자와 RdRp 유전자 또는 ORF1ab 유전자를 포함하고 있다[19]. 그 외 S 유전자, N 유전자 등 SARS-CoV-2의 다양한 유전자 부위를 표적으로 키트를 제조하였으며, FDA의 긴급사용승인을 받았다[4, 18, 19]. SARS-CoV-2와 같은 호흡기 바이러스의 경우 주로 비인두 검체(nasopharyngeal swab)를 상기도에서 채취한다.

1) 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR)

RT-qPCR은 현재 SARS-CoV-2 감염의 검출을 위한 검사법 중 가장 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 높으며, ‘gold standard’로써 표준화된 진단검사 방법이다[20, 21]. 감염의 정확한 검출은 인체의 해부학적 위치에서 적절한 검체의 채취가 필요하다. 분자진단법에서 환자의 기관지폐포 세정액(bronchoalveolar lavage fluid), 섬유 기관지경 브러시 생검(fiber bronchoscope brush biopsies), 객담(sputum), 비강 검체(nasal swabs), 인두도말 검체(pharyngeal swabs), 그리고 대변(feces), 또는 혈액(blood) 등 다양한 감염된 세포에서 SARS-CoV-2 RNA를 추출한다[22]. 특정 영역 당 2개의 프라이머(primer)를 제작하여 주기적으로 온도 변화를 이용한 PCR 과정으로 환자의 검체에서 RNA를 분리하여 역전사 과정을 통하여 cDNA로 합성한 핵산을 PCR 튜브로 옮긴 후 실시간 핵산증폭기기(real time thermal cycler 또는 real time PCR machine)에서 증폭한다. RdRp와 E 유전자의 보존 영역은 정량적 PCR에 의한 형광 프로브(fluorogenic probe)로 증폭된 sub-genomic 바이러스 부분이다. 실시간 PCR 기기는 cycle을 여러 회 반복하여 증폭 과정을 거치게 되는데, PCR 반응에서 유전자가 증폭되는 단계마다 형광물질이 부착된 프로브(probe)를 붙게 하여 증폭된 양을 정량적으로 측정할 수 있다[18-23].

현재 COVID-19 진단을 위해 상업적으로 이용 가능한 RT-qPCR 플랫폼이 채택되고 있으며 바이러스 RNA를 직접 검출하면 환자의 증상, 바이러스의 양(viral load), 그리고 항체 생성의 여부인 면역 반응에 상관없이 증폭 산물의 존재 유무에 따라 COVID-19를 검출할 수 있으므로 감염 초기의 진단에 가치가 있고, 대량으로 검사가 가능하다[22]. 분자진단방법의 진단 정확도는 면역진단방법 대비하여 높지만, RNA의 추출과 증폭 과정에서 면역진단방법에 비해 상대적으로 긴 소요시간(약 6시간)과, 전문적인 지식과 숙련된 검사실 인력 등을 필요로 하고 교차오염(cross-contamination)을 통해 특이성이 감소될 위험이 있다는 단점이 있다[10, 18, 23]. 또한 다양한 검체로부터의 RNA 추출이나 고가의 장비 등의 요인으로 인해 전문 진단설비를 갖춘 대형병원이나 임상검사실에서만 사용이 가능하다[22].

2020년 1월 12일 SARS-CoV-2의 유전자 서열이 공유된 이후 2020년 2월 4일 미국의 질병통제예방센터(Food and Drug Administration, FDA)는 허가된 검사실에서 SARS-CoV-2 진단검사의 긴급사용승인(emergency use authorization, EUA)을 허용하였다[24]. Table 1에서는 식품의약품안전처에서 승인받아 현재 국내에서 시판되고 있는 RT-qPCR 방법을 이용한 제품을 기술하였다[25]. 그리고 WHO의 권고에 따라 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control, CDC), 프랑스, 독일, 중국 CDC, 그리고 일본을 포함한 여러 국가 및 에서 개발하여 공개된 RT-qPCR의 표적 유전자(gene targets)와 증폭된 유전자의 크기(amplicon size, base pair) 등을 Table 2에 간략히 기술하였다[22].

List of COVID-19 diagnostic devices using RT-qPCR approved by Ministry of Foods and Drug Safety (MFDS) in Korea

Company Product Approved date
SD BIOSENSOR STANDARDTM M nCoV Real-Time Detection Kit 20.8.31
BioSewoom Inc. Real-Q 2019-nCoV Detection Kit 20.10.6
SEASUN BIOMATERIALS U-TOPTM COVID-19 Detection Kit Plus 20.10.8
CANCERROP Q-Sens COVID-19 Detection Kit 20.10.8
Kogene Biotech PowerChekTM SARS-CoV-2, Influenza A&B Multiplex Real-time PCR Kit 20.11.3
SEASUN BIOMATERIALS AQ-TOPTM COVID-19 Rapid Detection Kit Plus 20.11.23
Kogene Biotech PowerChekTM SARS-CoV-2 Real-time PCR Kit 20.11.26
Seegene Allplex SARS-CoV-2 Assay 20.12.7
CANCERROP Q-Sens COVID-19 Detection Kit V2 20.12.24
BioSewoom Real-Q Direct SARS-CoV2 Detection Kit 21.1.20
Seegene AllplexTM SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay 21.1.26
SML Genetree Ezplex SARS-CoV-2 Kit 21.1.29
invitesBioCore BioCore 2019-nCoV Real Time PCR Kit 21.3.12
LabGenomics LabGunTM COVID-19 ExoFast RT-PCR Kit 21.3.18
OPTOLANE Dr. PCRTM Di20K COVID-19 Detection Kit 21.3.23
SEASUN BIOMATERIALS U-TOPTM SARS-CoV-2 & Flu A/B 21.4.1
OSANG Healthcare GeneFiner COVID-19 Fast RealAmp Kit 21.4.26
BioSewoom Real-Q Direct SARS-CoV2 Detection Kit 21.4.26
BIONEER AccuPower RV1 Real-Time RT-PCR Kit (RV1-1111) 21.4.30
Roche cobas SARS-CoV-2 & Influenza A/B 21.5.4
PaxGenBio PaxView SARS-CoV-2 real-time RT-PCR Kit 21.5.12
BIONEER AccuPower RV1 Multiplex Kit 21.5.26
Genomictree AccuraDTectTM COVID-19 RT-qPCR Kit 21.6.17
SML Genetree Ezplex SARS-CoV2/RV Fast Kit 21.6.21
SMSBIO A+CheQ COVID-19 RT-qPCR Detection Kit 21.6.22
Genematrix NeoPlexTM FluCOVID Kit 21.7.1
SolGent DiaPlexQTM Novel Coronavirus (2019-nCoV) Detection Kit 21.7.22
Genematrix NeoPlexTM COVID-19 Detection 21.8.27
BIONEER AccuPower COVID-19 Multiplex Real-Time RT-PCR Kit (NCVM-1211) 21.9.13
MiCo BioMed Veri-Q COVID-19 Multiplex Detection Kit 21.10.20
KHMedical RADI COVID-19 Detection Kit 21.11.8
iNtRON BIOTECHNOLOGY LiliFTM COVID-19 Multi Real-time RT-PCR Kit 21.12.10
SD BIOSENSOR STANDARDTM M10 SARS-CoV-2 21.12.21
BIOMÉRIEUX BioFire Respiratory Panel 2.1plus (RP2.1plus) 22.2.14
Genes Laboratories GCdiaTM COVID-19 Fast Detection Kit 22.3.14
YD Diagnostics Real Time COVID-19 22.4.4
MiCo BioMed Veri-Q COVID-19 & Flu A/B Multiplex Detection Kit 22.4.13
Abbott Alinity m SARS-CoV-2 AMP Kit 22.4.14
Genes Laboratories GCdiaTM SARS-CoV-2 Detection Kit 22.5.3

Reference [25].


Comparison for gene targets, gene locations and amplicon sizes of disclosed RT-qPCR

Institute Gene targets Amplicon size (bp)
US CDC N1, N2, and N3 gene 71 bp, 67 bp, and 72 bp, respectively
Institute Pasteur, Paris, France RdRp (nCoV IP2 gene), RdRp (nCoV IP4 gene), and E gene 108 bp, 107 bp, and 125 bp, respectively
Charité, Germany RdRp gene and E gene NR
China CDC ORF1ab gene and N gene NR
National Institute of Infectious Diseases, Japan N gene NR

Abbreviations: CDC, Centers for Disease Control; bp, base pair; N, nucleocapsod; RdRp, RNA dependent RNA polymerase; IP, Institut Pasteur; E, enveloped; NR, not reported.

Reference [22].



2) 등온증폭검사(isothermal amplification tests, IATs)

COVID-19의 진단을 위하여 RNA 검출을 위한 분자기반 검사(molecular-based tests)인 RT-qPCR는 대표적인 검사실 기반 검사(laboratory-based assays)이다. 하지만 최근에 휴대용(portable) 및 빠른 진단검사를 위해 single-step RT-PCR을 이용한 다른 핵산 증폭방법(nucleic acid amplification methods)인 등온증폭검사(isothermal amplification tests, IATs) 방법들이 개발되었다[26]. IATs의 원리는 핵산의 온도 또는 효소적 변성에 이어서 핵산 증폭의 반응이 이어진다. 일정한 온도에서 수행되므로 유전자증폭기(thermocycler)와 같은 고가의 장비가 필요치 않다[27]. 등온증폭방법은 RT-qPCR이 비해 소형 장비를 사용하고, 신속한 검사가 가능하다는 점에서 현장검사법(point of care testing, POCT)에서 사용하기에 적합한 분자 기법이 개발될 수 있게 되었다. 하지만 선별검사로서 상대적으로 민감도가 낮다는 단점이 있다[26, 27]. 대부분의 IATs 방법에는 DNA가 적용되지만 RT-LAMP와 RT-RPA은 RNA 증폭에 적용할 수 있으며, RT-qPCR과 동일 검체를 사용하여 RNA를 추출한다[18].

(1) 역전사 재조합 중합효소 증폭(reverse transcription-recombinase polymerase amplification. RT-RPA)

RT-RPA는 SARS-CoV-2 검출에 사용할 수 있는 대표적인 등온 핵산 증폭 기법(isothermal nucleic acid amplification technique)으로 DNA의 이중가닥 구조를 분리하지 않고도 DNA를 증폭시킬 수 있는 검사법이다. PCR과 같이 DNA 중합효소(DNA polymerase)를 사용하여 포워드(forward) 및 리버스(reverse) 프라이머를 확장하고 각 DNA 가닥을 복제한다. 그러나 역전사(reverse transcription)에서 생성된 DNA 가닥을 풀고 복제하기 위해서 RPA는 가닥 치환 DNA 중합효소(strand displacement DNA polymerase)의 활성 뿐 아니라 재조합효소 복합체(recombinase complex)의 ATP 의존적 표적화 활성이 필요하다[28].

RPA는 일반적으로 37∼42°C에서 반응이 이루어진다. 재조합 효소와 로딩인자가 각 포워드 및 리버스 프라이머에 결합함으로써 반응이 시작된다. 이 recombinase/loading factor/oligonucleotide 복합체는 duplex DNA를 침범하여 ATP 의존성 반응에서 D-loop라고 불리는 구조를 형성하며, 여기에 dsDNA가 풀리고 상보적 서열(complementary sequence)에 프라이머가 결합된다. 그 후 재조합효소와 로딩인자가 분해되어 다른 목적 인식의 다른 라운드를 시작하기 위해 방출된다. 포워드 및 리버스 프라이머가 결합된 후 이 프라이머는 가닥 치환 DNA 중합효소를 사용하여 3’ 말단에서 연장되며, 연장과정에서 두 가닥이 추가로 분리되어 복제가 완료된다[18].

장점은 RT-qPCR과 비교하여 검사의 완료에 약 15분 정도가 소요되어 가장 빠른 핵산 증폭기법이며, 37∼42°C 까지만 가열이 필요하므로 장비의 온도 조절 모듈이 훨씬 단순하고 검사과정도 단순하기 때문에 비용면에서 효율적이라는 점이다[29, 30].

(2) 전사매개 증폭 검사(transcription-mediated amplifi-cation assay, TMA assay)

TMA 분석은 RNA 주형(RNA template)에서 RNA를 증폭하는 IAT로 high-throughput 분석기의 SARS-CoV-2 진단에 적용되었다. 반응의 원리는 i) RNA 주형의 서열에 상보적인 역방향 프라이머를 사용하지만 역방향 프라이머는 또한 5’ 말단에 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터(promoter) 서열을 가진 오버행(overhang)을 포함한다. ii) 역전사는 RT에 의해 수행되며 새롭게 전사된 cDNA는 표적 서열과 T7 프로모터를 모두 포함한다. iii) RNA 주형은 RT의 RNase H 활성에 의해 소화된다. iv) dsDNA는 RT의 DNA 중합효소 활성에 의해 생성된다. v) 생성된 dsDNA는 T7 RNA 중합효소에 의해 매개되는 전사를 위한 주형으로 사용된다. 따라서 RNA는 몇 배로 증폭되고 동일한 효소들의 활성을 통해 새로운 TMA 반응의 주형으로 작용할 수 있다. 사이클이 진행됨에 따라 지수적으로 증폭된다. 증폭된 RNA의 검출은 단일가닥 RNA (single-stranded RNA, ssRNA)를 표적으로 하는 서열 특이분자 비콘(sequence-specific molecular beacons; torch) 또는 혼성화 프로브를 사용하여 수행된다[18, 31].

(3) 닉킹 효소 보조 반응(Nicking enzyme-assisted reaction, NEAR)

미국과 캐나다에서 현장검사법(POCT)용으로 사용이 허가된 검사법이다. NEAR는 일반적으로 DNA의 지수적 증폭 후 형광 검출에 결합되지만 역전사 단계를 추가하여 RNA 주형을 검출하는 데 사용될 수 있다. NEARs는 등온조건(iso-thermal conditions; 60°C)에서 두 가지 주요 효소에 의해 매개된다. DNA의 특정 제한 엔도뉴클레이즈(endonuclease) 부위는 인식하지만 한 가닥만 잘라내는 닉킹 엔도뉴클레이즈(nicking endonuclease)와 약 65°C의 온도에서 합성되는 동안 다운스트림 DNA (downstream DNA)를 치환할 수 있는 Bst와 같은 가닥 치환 DNA 중합효소이다. Bst DNA 중합효소는 다른 DNA 중합효소에 흔한 5’→3’ exonuclease 활성이 부족하기 때문에 가닥 치환(strand displacement)이 가능하다[18, 32]. NEAR 검사의 증폭반응은 60°C에서 발생하며 바이러스 로딩이 높은 양성결과는 5분, 바이러스 로딩이 낮거나 음성 결과인 검체는 15분 정도의 처리 시간을 나타낸다.

(4) 역전사 고리 매개 등온 증폭검사(reverse transcription–loop-mediated isothermal amplification assay, RT-LAMP)

RT-LAMP 진단검사는 간단하고 배경 간섭이 적으며 나노기술(nanotechnology)을 기반으로 한다, SARS-CoV-2 유전자의 특정 영역을 선택하여 특정 영역 당 4∼6개의 프라이머를 제작한 후 동일 범위 온도를 유지하며 핵산의 특정영역을 증폭하는 검사법이다[21, 33]. RT-PCR와 비슷하게 환자의 타액이나 코, 비인두 또는 구강인두 등에서 검체를 채취한 후 SARS-CoV-2의 유전자를 식별해 감염 여부를 판별하지만 RT-qPCR가 가열과 냉각의 온도 변화를 통해 유전자를 증폭시키는 것과 달리 RT-LAMP는 60∼65°C 사이의 동일한 온도에서 유전자를 증폭시켜 1시간 내 진단이 가능하다는 장점이 있다[33, 34]. 그러나 이러한 장점을 가진 RT-LAMP도 RT-qPCR의 기기를 단순화하는 열 순환기 없이 표적을 빠르게 증폭하기 때문에 바이러스 감염의 현장 진단 진단에 유망하지만, 주요 제한사항에는 경험, 해석 그리고 반응 최적화가 필요하다. 또한 4∼6개의 프라이머가 필요하기 때문에 RT-LAMP에 대한 분석 설계는 상대적으로 복잡하며, RT-qPCR 검사법에 비해서 민감도와 특이도가 낮은 정성적인 검사법이다. 하지만 검출에 최적화 된 경우 RT-qPCR과 유사하게 <10 viral copies/reaction을 검출할 수 있을 만큼 민감하다[34].

(5) Droplet digital PCR (ddPCR)

최근 COVID-19의 진단을 위하여 현장진단이 어려운 RT-qPCR의 단점을 보완하는 ddPCR 검사방법도 개발되었다. ddPCR의 원리는 특정 프라이머와 프로브를 SARS-CoV-2의 특정 유전자 염기서열에 하이브리드화(hybrisization)하는 RT-qPCR법과 유사하다. 상용화된 ddPCR system은 광원제어 시스템(integrates light source control)과 열제어 센서(thermal control sensors)를 소형화하여 RT-qPCR과 비교하여 적은 공간으로 사용을 할 수 있다. 방법은 검체로부터 RNA를 추출하여 cDNA로 합성 후 각 웰에 oil-water emulsion 되어있는 상용화된 카트리지(cartridge)와 드롭플렛 제너레이터(droplet generator)에 첨가한 후 PCR 장비에서 드롭플렛을 증폭한다. 증폭과 형광 분석은 각 웰에서 동시에 수행된다. 그 후 프롭플렛 판독기에서 결과를 분석한다. RT-qPCR과 비교하여 장점은 증폭과 형광 분석 과정에 의한 위음성 발생 확률이 낮고 소형화 및 높은 정확도를 나타내기 때문에 향후 현장검사법으로서의 역할을 할 수 있다[35]. 현재 국내에서 긴급사용이 승인된 제품으로 Kogen Biotech, Seegene, Solgent, SD Biosensor, 그리고 Biosewoom 등의 제품이 있다. 이 중 Seegene 사의 Dr. PCR 20 K COVD-19 Detection kit (RdRp와 E 유전자 표적)가 미국 FDA의 승인을 받았다[35]. 비록 적은 검체이지만 총 50검체를 이용한 실험에서 RT-qPCR과 동일한 실험 결과인 위음성 및 위양성 비율이 0, 민감도와 특이도는 1을 나타내어 일치함을 확인하였다. 또한 감염 초기 극소량의 SARS-CoV-2에 감염되었을 경우 ddPCR이 RT-qPCR에 비해 유용한 검사결과를 나타내었다[35].

(6) Clustered regularly interspaced short palindromic repeat associated Cas (CRISPR-Cas)

COVID-19의 진단을 위하여 RT-qPCR 분자진단법의 대안으로 간편하고 신속한 CRISPR 유전자 가위 기술을 이용한 진단기술이 차세대 유망기술로 주목받고 있다. SARS-CoV-2 검출의 경우, CRISPR-Cas 시스템에서 정제된 RNA는 더 높은 민감도를 나타내었다[36, 37].

이중 표지된 ssDNA 또는 fluorophore-quencher가 결합된 RNA 프로브를 사용할 수 있으며, Cas12a 또는 Cas13 단백질이 표적 DNA 또는 RNA에 결합하면 Cas 단백질이 활성화되어 표적과 프로브를 절단한다. 즉 유전자가위를 이용하여 잘라낼 RNA에 형광물질을 표지한 후 가이드 RNA (guide RNA, gRNA)가 SARS-CoV-2 유전자를 인식했을 때 CRISPR 유전자가위(Cas12, Cas13)가 활성화 되어 리포터 RNA를 자르면 동시에 형광분자 신호를 생성하도록 만들어 감염 여부를 판별할 수 있는 기술로 우수한 분석 감도와 민감도를 가져 임상 진단에서 위양성 및 위음성을 최소화 할 수 있다. 모든 CRISPR-Cas 방법은 SARS-CoV-2 RNA를 dsDNA로 변환해야 하며, 이는 RT-qPCR, RT-LAMP 또는 RT-RPA에 의해 수행될 수 있다. CRISPR-Cas 기술의 분석 성능은 SARS-CoV-2를 검출할 수 있는 가능성을 보여주었지만, 임상 검체에 대한 검증은 현재까지 거의 이루어지지 않고 있다[37].

SARS-CoV-2의 특정영역을 선택하여 각 2∼6개의 프라이머를 제작한 후 PCR이나 등온증폭과정을 이용하여 검체에서 분리한 핵산을 증폭한다. 형광신호의 유무에 따라 진단하며 1시간 이내에 결과를 분석할 수 있다[36, 37].

(7) 차세대염기서열(next-generation sequencing, NGS)

SARS-CoV-2의 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS) 기법을 통해 이 바이러스의 기원을 식별할 수 있으며, 전염에 대한 과정을 묘사하고, 병인에 대한 단서를 풀 수도 있으며, 진단검사와 항바이러스 치료제 개발을 위한 잠재적 분자 표적을 식별하는 데 중요한 역할을 한다. 또한 시간 경과에 따른 바이러스의 진화를 모니터링 하는데 도움이 될 수 있다[18, 38].

현재 NGS 검사법으로 합성에 의한 염기서열에 기초한 COVID-19에 대한 임상 진단 검사는 FDA에 의해 승인되었지만 성능, 장점, 또는 한계를 나타내는 데이터는 아직까지 없다. Bhoyar 등의 연구에서 NGS와 RT-qPCR을 비교하였을 때 100%의 일치성을 보이거나 더 높은 민감도를 나타냈다[39-41]. 이러한 결과들로 보아 SARS-CoV-2의 진단 도구로서 NGS는 우수하지만 그것의 장점과 한계를 이해하기 위해서는 추가 분석이 필요하다. NGS의 또 다른 한계는 고비용이며, 이는 진단검사를 수행할 수 없는 이유가 된다. 또한 NGS의 복잡성과 정교한 기기 및 생물정보학 전문 지식에 대한 요구는 많은 검사실에서 NGS를 수행하기에 높은 장벽이 될 수 있다. NGS가 임상 진단검사실에서 SARS-CoV-2의 진단검사가 될지 아직 결정되지는 않았지만 NGS 기법을 사용한 SARS-CoV-2 양성 검체의 genome 염기서열은 질병 발생, 역학, 바이러스 계통발생학, SARS-CoV-2의 진화 그리고 진단 검사 또는 치료제 및 백신과 같은 개입에 미치는 영향 등 수많은 응용 분야를 위한 터전이 되었다[42, 43].

2. 면역기반검사(immune based tests, IBTs)

1) 신속항원검사(antigen-rapid detection tests, Ag-RDTs): LFIA

SARS-CoV-2 신속항원검사(antigen-rapid detection tests, Ag-RDTs)는 RT-qPCR을 사용할 수 없을 때 경제적이고 간단하며 편리한 진단 방법을 제공하고 NAATs와 마찬가지로 SARS-CoV-2의 감염 초기에 활성 복제 바이러스를 검출하는데 사용한다. 바이러스 RNA를 검출하는 NAATs와는 달리 항원 검출은 SARS-CoV-2 단백질 항원의 식별을 기반으로 하며, 두 가지 주요 항원은 S와 N 단백질이다[18]. 다른 호흡기 바이러스에 교차반응(cross reaction)을 일으켜 위양성(false positive) 결과가 나올 수 있으며 위음성(false negative) 결과도 높아 RT-qPCR에 비해 민감도와 특이도가 낮다고 알려져 있다[43]. 비강 검체(nasal swabs), 비인두 검체(nasopharyngeal swabs) 그리고 타액(saliva) 검체를 이용하여 검사한다.

현재 항원 검출 검사법은 측면 유동 면역크로마토그래피 검사법(lateral flow immunochromatographic assays, LFIA)과 같은 휴대용 장치를 사용하여 사용이 쉽고, 간편하며 신속한 검사를 할 수 있도록 개발되었다. LFIA은 항원을 검출하는 방법과 항체를 검출하는 방법으로 나눌 수 있으며, SARS-CoV-2 감염 진단에 도움을 주기 위해 보조적으로 사용된다[44]. 호흡기 감염 증상이 있는 환자의 비인두 도말 검체에서 SARS-CoV-2 항원(S 또는 N 단백질)을 면역크로마토그래피법(Immuno-chromatographic assay, ICA)을 이용하는 정성검사 방법이다. 이 검사법은 과정이 단순하고, 숙련된 검사자나 고가의 검사 장비가 필요하지 않으며, 항원의 존재 여부를 30분 이내에 알 수 있기 때문에[43-46] POCT로써 최적의 검사법이 될 수 있으나 무증상 감염자에 대한 민감도가 떨어진다는 단점이 있어 보조적인 진단법으로 사용하거나, 대규모의 집단을 대상으로 신속한 진단검사를 위해 활용 가능성이 있다[44-47].

WHO의 권고사항으로 SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 Ag-RDTs는 민감도 80% 이상, 특이도 97% 이상이면서 NAATs를 시행할 수 없거나 NAATs의 검사소요 시간이 길어 실제적으로 임상에서 유용하게 사용할 수 없을 경우 증상 발현 후 5∼7일 사이의 환자를 대상으로 숙련된 검사자가 시행할 수 있는 것으로 제시하고 있다. 또한 낮은 민감도를 경고하면서, 반복 검사나 NAATs로 확인할 것과 Ag-RDTs에서의 음성 결과를 격리해제 등의 근거로 사용하지 말도록 권고하고 있다[44].

Ag-RDTs의 평균 민감도는 56.2%로 나타났으며, 평균 특이도는 99.5%였다. RT-qPCR에 비해 낮은 민감도가 나타난 이질성에 대해 SARS-CoV-2 검출에 사용된 방법, 평가 중 대조군 방법, 평가된 환자 모집단, SARS-CoV-2 유병률, 검체 채취 시기, 사용된 검체 유형, 분석 중 항원 안정성 등의 요인이라고 설명했다[48, 49]. WHO는 NAATs에 비해 상대적으로 낮은 민감도이지만 Ag-RDTs에 대한 잠재적 역할을 인식하면서 Ag-RDTs의 사용에 대해 NAATs를 사용할 수 없는 지역(예: 원격 지역) 또는 NAATs를 사용한 결과 반환 시간이 긴 경우 시험, 발병 조사에서 이러한 환경에서의 시험의 빈도가 불분명할 경우, 유병률이 높은 지역 그리고 양성 사례의 무증상 접촉 검사에 대한 사용을 권고하였다[44, 49].

2) 혈청학적 분석(serological assays)

혈청학적 검사는 항원에 대해 체내에서 생성된 항체를 측정하는 방식으로 혈청(serum), 혈장(plasma) 또는 전혈(whole blood)로부터 SARS-CoV-2의 특이 항체(specific antibodies)인 IgM 및 IgG를 검출한다[18]. 항체 검사는 현재 바이러스가 체내에 존재하는지의 여부를 알 수 없기 때문에 감염의 진단을 위한 목적으로 부적합하지만, 과거에 감염 이력이 있었는지는 확인할 수 있는 진단검사방법이다. SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 검출하는 데 필요한 일반적인 시간이 약 1∼2주임을 감안할 때, 혈청학적 검사는 질병의 급성 단계에서 SARS-CoV-2 진단에 대한 유용성이 제한적이지만 일단 면역 반응이 발생하면 가치가 있을 수 있다[50].

혈청학적 분석은 종종 SARS-CoV-2 특이적 항체를 포착하기 위해 재조합 항원(recombinant antigens)을 사용하는데, 가장 풍부한 단백질인 N 단백질과 S 단백질 S1 서브유닛(subunit)의 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)이 가장 일반적으로 사용되는 항원이다. 하나 이상의 면역글로불린 아이소타입(isotypes) 즉 IgA, IgM 또는 IgG을 대상으로 할 수 있다. IgM과 IgG는 SARS-CoV-2의 혈청학적 검사에 사용되는 반면, IgA 검출은 덜 사용된다. IgA와 IgM은 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 조기에 발견하는 데 어느 정도 장점을 보였다[51]. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 96웰 플레이트(96 well plasts) 형식의 ELISA와 자동화된 high-throughput 장치를 위한 화학발광 면역측정법(CLIA)이며, 빠른 결과를 제공할 수 있다는 장점이 있다[21].

(1) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

ELISA는 마이크로웰, 플레이트 기반 검사(microwell, plate-based assay)이며, 간접방법(indirect method), 직접방법(direct method) 그리고 샌드위치 방법(sandwich method)이 있다. COVID-19 진단을 위한 검사로 ELISA는 대부분 간접방법을 사용하고, 비용 효율성과 작동 용이성으로 인해 검사실에서 항체의 검출에 널리 사용되며, 무증상이거나 회복된 사람을 포함하여 노출된 개인을 조사하기 위한 도구로서 역학 및 감시 목적으로 정량화 할 수 있는 검사법이다[52]. SARS-CoV-2 노출을 평가하기 위한 기존 플랫폼으로 가장 낮은 농도인 picogram/mL 범위에서 항체를 검출할 수 있다. 전체적인 과정은 2∼5시간이지만 한 번에 최대 96개의 검체를 검사할 수 있다[18].

96웰 플레이트 COVID-19 ELISA는 anti-SARS-CoV-2 항체에 의해 인식되고 결합되는 비활성화된 바이러스 또는 재조합 바이러스 항원인 S 단백질 또는 N 단백질이 웰의 바닥에 코팅되어 있다. 환자의 혈청을 웰에 첨가하고 플레이트를 배양한다. 일련의 세척과정을 수행하여 혈청 및 결합되지 않은 항체를 제거한다. 이어서 인간 면역글로불린에 특이적인 접합된 항체를 각 웰에 첨가한다. 바이러스 단백질에 대한 항체가 존재하면 항원-항체 복합체가 형성된다. 추가적으로 세척한 후 복합체는 human antibodies (anti-human IgG/IgM)에 대하여 제작된 효소 결합 또는 형광이 부착된 2차 항체에 의해 검출된다. 사용된 2차 항체의 유형에 따라 비색(colorimetric) 또는 형광 신호(fluorescent signal)가 생성되며, 그 강도는 희석 인자에 맞춰 조정한 후 검체 내에 존재하는 항체의 양을 반영한다. 이 과정은 검체에 존재하는 IgG 또는 IgM 항체의 양을 나타내는 형광 또는 화학발광에 의해 쉽게 검출할 수 있는 비색반응(colorimetric reaction)이다[8, 52, 53]. 샌드위치 방법은 간접 방법과 유사하지만 각각의 웰에 SARS-CoV-2 항체를 코팅하여 항원을 검출하는 방법이다.

(2) 화학발광 면역측정(chemiluminescence immunoassay, CLIA)

CLIA은 자동화된 혈청학 기기에서 사용되는 면역 측정법(immunoassay)으로, 다른 혈청학적 측정법에 비해 민감도가 높다고 알려져 있다. ELISA와 유사하게 간접방법 및 샌드위치 방법과 같은 다양한 SARS-CoV-2 항체의 검출에 적용된다[18, 53].

CLIA는 ELISA와 크게 두 가지 차이점이 있다. 첫째로 최종 반응은 절대값이 OD가 아닌 상대 광도 단위(relative light units, RLU)로 광도계(luminometer)에 의해 감지되는 빛을 생성한다. 빛을 생성하기 위해 접합체(conjugate)는 alkaline phosphatase (ALP)와 lumigen APS-5 기질과 같은 효소-기질 반응을 사용한다. 두 번째로 멀티웰 플레이드(multiwell plates)가 아닌 liquid-phase 반응의 자기 마이크로스페어(magnetic microspheres)는 항원성 물질로 코팅되어 있어 자석(magnet)에 의해 결합 분자와 비결합 분자를 쉽게 분리할 수 있고, 넓은 표면적을 제공하며, 반응이 완전한 현탁액(suspension) 상태에서 일어날 수 있기 때문에 더 빠른 반응을 가능하게 한다. 이 검사는 완전히 자동화된 방식으로 최대 170개의 결과를 제공할 수 있어 ELISA 검사법과 더불어 민감도가 높으며 다량의 검체를 동시에 검사하기에 편리하다는 장점이 있다[52, 54, 55].

(3) 형광 미립자 면역 측정법(fluorescent microparticle immunoassays, FMI)

Norman 등은 S, S1, S2, 그리고 N 단백질에 결합되어 SARS-CoV-2 IgM, IgG 및 IgA 항체의 검출 및 분화에 사용되는 4가지 유형의 dye-encoded beads로 구성된 형광 나노입자 면역분석(fluorescent nanoparticle immunoassay, FMI) 기반 단일분자 어레이 분석(single-molecule array assay)에 대하여 발표하였다[56]. 이 검사법에서는 0개 또는 1개의 항체 분자가 각 비드(bead)에 결합하는 방식으로 검체의 항체분자의 수와 비교하여 과량의 비드가 사용된다. 코팅된 비드와 항체 그리고 다른 시약들 간에 반응이 일어난 후 비드는 이미지를 만들기 위해 웰 어레이에 로드하여 단일 분자 분해능(single-molecule resolution)으로 항체를 검출할 수 있다. 81 혈장 샘플에서 검사하였을 때 증상 발생 후 첫 주 동안 샘플에 대해 86%의 민감도와 100% 특이성을 보였으며 증상 발생 후 첫 주 이후에 채취한 샘플에 대해서는 100% 민감도와 특이도를 보였다[56].

(4)측면 유동 면역크로마토그래피 검사법(lateral flow immunochromatographic assays, LFIA)

혈청학적 기반 LFIA에서 항체는 SARS-CoV-2의 감염 후에도 일정기간 동안 인체 내에 존재함으로 현재(현성) 감염 뿐만 아니라, 환자의 회복 상태 추정하거나, 치료 효과, 역학 조사, 백신의 유용성 등을 평가하는데 사용되는 정성적인 검사법이다. Figure 2에서와 같이 SARS-CoV-2 감염으로 인해 인체에서 항체가 생성되었을 때 환자의 검체(혈액)와 SARS-CoV-2 특이 재조합 항원을 혼합함으로써 항원-항체 반응을 유도하여 감염을 진단할 수 있다. 이용되는 항원은 재조합 S 및 N 단백질로서 IgM과 IgG를 검출하거나 구별하기 위해 사용된다[51].

이 검사법은 몇 마이크로의 샘플을 사용하여 과정이 단순하고, 고가의 검사 장비가 필요하지 않으며, 휴대하기가 용이하고 항체의 존재 여부를 빠른 시간에 알 수 있기 때문에 POCT로써 최적의 검사법이 될 수 있다[47]. 하지만 면역 후 반응을 나타내기 때문에 감염 초기에는 음성결과를 나타낼 수 있으며 이전에 감염되었지만 증상이 없는 사람에게서 바이러스를 검출할 수도 있다[17, 21]. 약 90%의 정확도(accuracy)로 20분 내에 검사가 완료되며 IgM과 IgG를 동시에 검출할 수 있다. SARS-CoV-2 검출은 혈청 중화항체의 존재와 병행하여 검출이 불가능하다[21]. 원리는 금나노입자(gold nanoparticles, AuNP)와 비색라벨(colorimetric label)을 사용하여 환자의 검체와 접촉하는 단계에서 혈청학적 검출을 위한 신속한 플랫폼을 제공한다. SARS-CoV-2 특이적 재조합 항원이 금나노입자(gold nanoparticles, AuNP)와 결합한 chromatographic lateral flow 장치에 검체를 로딩(loading)하면 IgM와 IgG은 모세관 현상을 통해 고정된 시약 방향으로 이동하여 시약과 반응하여 콜로이드 금 나노입자(colloidal gold nanoparticles, AuNPs)와 결합된 재조합 SARS-CoV-2 항원과 결합하여 복합체가 형성된다. 복합체는 장치 내부를 IgM 구역과 IgG 구역을 차례대로 흐르는 과정에서 anti-human IgM/IgG antibodies와 결합하며 나타나는 색의 띠(colored band)에 의해 존재하는 IgM/IgG를 검출할 수 있다. 대조라인(control line)에 색이 형성되며 검사부위(test window)에 색이 나타나지 않을 경우 음성결과로 판독한다[21]. 향후 더욱 민감도와 특이도가 개선된 시약이 개발된다면 진단에 도움이 될 것으로 예상하고 있으며, 우리나라에서도 민감도와 특이도를 높이는 연구가 진행되고 있다[57].

Table 3, 4에서는 식품의약품안전처에서 현재 국내 진단키트로서 허가를 받은 제품으로서 앞서 소개한 효소면역검사법, 화학발광면역측정법, 면역 크로마토그래피법 등의 원리를 이용하여 SARS-CoV-2의 항원 및 항체를 검출하는 제품을 소개하였다[25].

List of COVID-19 diagnostic devices to detect SARS-CoV-2 antigens approved by Ministry of Foods and Drug Safety in Korea

Company Product Approved date
SD BIOSENSOR STANDARDTM Q COVID-19 Ag Test 20.11.11
GenBody GenBody COVID-19 Ag 20.12.24
SD BIOSENSOR STANDARDTM F COVID-19 Ag FIA 21.1.5
RapiGEN BIOCREDIT COVID-19 Ag 21.3.18
Humasis Humasis COVID-19 Ag Test 21.3.18
Humasis Humasis COVID-19 Home test 21.4.23
SD BIOSENSOR STANDARDTM Q COVID-19 Ag Home Test 21.4.23
Sugentech SGTi-flex COVID-19 Ag 21.5.25
GenBody GenBody FIA COVID-19 Ag 21.6.21
PCL PCL COVID19 Ag Gold 21.6.23
RapiGEN BIOCREDIT COVID-19 Ag Home Test Nasal 21.7.13
Boditech Med ichromaTM COVID-19 Ag 21.7.13
Boditech Med AFIAS COVID-19 Ag 21.7.15
GC녹십자MS GENEDIA W COVID-19 Ag 21.7.29
Precision Biosensor PBCheck COVID-19 Ag 21.8.3
BBB MARK-BTM COVID-19 Ag 21.8.9
Precision Biosensor Exdia COVID-19 Ag 21.8.10
MiCo BioMed VERI-Q COVID-19 Ag Rapid Test 21.8.20
WELLS BIO careUSTM COVID-19 antigen 21.8.25
ASAN PHARM Asan Easy Test COVID-19 Ag 21.9.9
Abott PanbioTM COVID-19 Ag Rapid Test Device (Nasopharyngeal) 21.9.28
wonmed WonMed Covid-19 Ag (WM COVAG-25T) 21.11.10
Z Biotech AnyLab COVID-19 Ag Test Kit 22.1.11
AccessBio CareStart COVID-19 Ag Plus 22.1.11
CALTH AllCheck COVID19 Ag 22.1.13
GenBody GenBody COVID-19 Ag Home Test 22.2.4
Sugentech SGTi-flex COVID-19 Ag Self 22.2.4
SD BIOSENSOR STANDARDTM i-Q COVID-19 Ag Home Test 22.2.11
PCL PCLOK Ⅱ ABC 22.2.15
MEDIAN Diagnostics MDx COVID-19 Ag Home Test 22.2.15
OSANG Healthcare GeneFinderTM COVID-19 Ag Self Test 22.2.15
WELLS BIO careUSTM COVID-19 Antigen Home Test 22.2.17
MEDISENSOR CareUTM COVID-19 SARS-CoV-2 Antigen Rapid Test Kit 22.2.24
GenBody GenBody Influenza/COVID-19 Ag Triple 22.4.11
MEDIAN Diagnostics MDx COVID-19 Ag Rapid Kit 22.4.12
Philosys Gmate® COVID-19 Ag 22.4.12
ImmuneMed IMMUNEMED COVID-19 Ag RAPID 22.4.21
PCL PCL SELF TEST – COVID19 Ag 22.4.29

Reference [25].


List of COVID-19 diagnostic devices to detect SARS-CoV-2 antibodies approved by Ministry of Foods and Drug Safety in Korea

Company Product Approved date
SD BIOSENSOR STANDARDTM Q COVID-19 IgM/IgG Plus Test 20.11.6
Sugentech SGTi-flex COVID-19 IgM/IgG 20.12.18
SD BIOSENSOR STANDARDTM F COVID-19 IgM/IgG Combo FIA 21.1.26
Roche Elecsys Anti-SARS-CoV-2 21.4.16
Simens Healthineers ADVIA Centaur SARS-CoV-2 Total (COV2T) 21.4.16
GenBody GenBody COVID-19 IgM/IgG 21.4.20
Humasis Humasis COVID-19 IgG/IgM Test 21.5.6
SG Medical R-FIND COVID-19 IgM ELISA 21.5.6
SG Medical R-FIND COVID-19 IgG ELISA 21.5.6
SG Medical R-FIND COVID-19 IgG/M/A ELISA 21.5.6
WELLS BIO careUSTM COVID-19 IgM/IgG Ab 21.5.27
LG Chem AdvanSureTM SARS-CoV-2 IgG (S1) ELISA 21.5.27
PCL PCL SARS-CoV-2 IgG EIA 21.8.12
MiCo BioMed COVID-19 Biokit IgG/IgM 21.8.13
Abott SARS-CoV-2 IgG Ⅱ Quant Reagent Kit 21.12.10
NanoEnTek FREND COVID-19 SP 22.1.24
PCL PCLOCK Ⅱ SARS-CoV-2 Dual IgG 22.2.15
Simens Healthineers ADVIA Centaur SARS-CoV-2 IgG (sCOVG) 22.3.11
ASAN PHARM Asan Easy Test COVID-19 IgG/IgM (N) 22.3.14
LG Chem AdvanSureTM SARS-CoV-2 IgG (RBD) ELISA 22.3.17
AccessBio CareStartTM COVID-19 IgM/IgG Ab 22.4.18

Reference [25].


결 론

SARS-COV-2 감염으로 인한 전 세계적 유행병으로 인해 경제, 산업, 사회, 문화, 환경과 기후변화 그리고 규범 등 현 시대를 살고 있는 인간의 모든 행위 영역에 미치는 영향이 매우 컸으며, 대규모의 변화가 파생되었다. 이로부터 얻은 교훈은 인간은 여전히 감염병의 위협에 노출되어 있으며 당면한 과제의 극복은 물론 향후 발생할 신종 유행병에 대비하는 사회적 전략과 지침, 검사와 치료의 역량이 제한적일 때 우선순위, 감염원의 노출에 대한 공중보건과 감염 관리, 역학, 감염원에 대한 보건 행위와 정확한 정보 그리고 빠른 백신의 개발과 치료제의 개발 등이 중요하다는 점이다. 이와 더불어 유행의 초기 단계에서 감염원의 확산을 최대한 늦추고 백신과 치료제의 개발을 위한 시간을 벌기 위해 신속하고 정확한 조기 진단검사의 중요성이 매우 중요해졌다. 특히 진단검사를 이용한 정확한 병원체(pathogen)의 검출이 팬데믹을 억제하기 위한 출발점으로써 이와 함께 임상적 특성, 감염병 관련 정보에 대한 전 세계적 공유, 병원체의 빠른 확보, 진단검사를 위한 정확한 인체 부위와 검체 채취 정보 등이 반드시 필요하다[58, 59]. SARS-CoV-2는 호흡기 에어로졸(respiratory aerosol)이나 감염매개물(fomites)에 의해 전파된다. 기관지 폐포액(bronchoalveolar lavage), 기관지 흡인액(tracheal aspirates), 흉수(pleural fluids), 소변(urine), 혈액(blood), 그리고 대변(faeces)의 검체에는 바이러스가 포함되어 있다[21]. 또한 타액(saliva)은 바이러스 특이 항체의 공급원이다. 항원과 비리온(virions)은 비인두 검체(naso-pharyngeal swab)에서 검출된다. 비강(nasal)이나 구강인두 검체(oropharyngeal samples)는 단독이나 복합적으로 채취하여 바이러스의 감염을 확인한다[21]. 부적절한 비인두 검체의 채취는 위음성 확률을 높일 수 있다. SARS-CoV-2의 세포 감염 시 ACE2의 발현이 코(nose)의 근위부(proximal part) 보다 원위부(distal part)에서 더 높은 비율로 발현되는데, 그 이유는 상부호흡기 영역에서 하부 호흡기 영역으로 이동하여 복제되기 때문이다[21, 52]. 면봉을 이용하여 검체 채취 시 상기도 부분의 구강인두 검체(oropharyngeal swabs), 코인두(nasopharynx) 부분의 찰과(swab)나 세척액 그리고 인후(throat) 부분을 정확히 채취하여야 한다[18].

본문에서 언급한 바와 같이 현재 SARS-CoV-2 감염의 진단을 위한 검사법 중 민감도와 특이도가 가장 높은 진단검사방법은 RT-qPCR로 표준검사법인 gold standard로 불리고 있지만, 증폭과정에서 소요되는 시간이 길고 전문지식과 고가의 검사 장비, 숙련된 검사 인력의 확보 그리고 고가의 검사 비용 등이 단점이다[53].

향후 언제 발생할지 모를 대규모 신종 감염병이 유행하였을 경우를 대비하여 이러한 단점을 보완한 더 신속하며 민감도와 특이도가 높은 다양한 검사기법의 개발이 여전히 시급하다. SARS-CoV-2 감염을 확인하거나 배제하기 위해 진단검사 방법을 사용할 경우, 질병의 유병률에 영향을 미칠 수 있는 검체 채취의 타이밍과 유형, 검체 채취의 해부학적 부위, 방법 및 예상되는 성능 특성, 호환 가능한 징후와 증상(무증상 테스트와 비교)과 같은 숙주 요인, 심각한 결과에 대한 위험 요인 등 많은 요인을 고려해야 한다. 또한 염기서열(sequencing) 기법을 이용한 지속적인 분자 감시(molecular surveillance)도 SARS-CoV-2 genome 염기서열 및 COVID-19 역학 변화를 모니터링 하도록 권장해야 하며, 특히 진단 검사의 실패와 관련된 변이에 중점을 두어 전염성 증가, 심각성 증가 또는 회복기 혈청 또는 백신에 대한 민감성 감소를 강조해야 한다[18, 60].

우리나라의 경우 SARS-CoV-2가 유행하기 시작한 초기에 여러 국내회사들이 NAAT법의 개발을 완료함으로써 충분한 진단검사 시약을 확보한 상태에서 RT-qPCR로 감염자를 진단하여 COVID-19 발병의 확산방지에 큰 역할을 하였다. 많은 의료관련 종사자인 보건인력들의 봉사와 사명 그리고 희생으로 이루어진 결과이다. 그 중 드러나지 않은 곳에서 검채 채취와 신속하고 정확하게 진단검사를 수행하여 전 세계적으로 우수한 대응을 보인 임상병리사들의 역할이 크게 작용하였으며 우리나라 진단검사의 수준과 능력을 몇 단계 향상시켰다[2].

본 논문에서는 SARS-CoV-2의 존재를 직접 검출할 수 있는 진단검사 플랫폼 중 핵산 적용 기반인 RT-qPCR, 등온증폭검사 그리고 genome sequencing의 분자진단학적 검사법과 SARS-CoV-2의 항원기반 검사 그리고 혈청학적 항체검사법에 대하여 소개하였다. Table 5는 각 검사법에 대한 간략한 설명과 각 진단 기술 플랫폼의 특성 비교이다. 그리고 분자진단학적 검사방법인 RT-qPCR과 항체검사의 장단점을 비교해 보았다(Table 6) [8, 14]. 감염상태에서는 혈청학적 검사를 제외한 모든 검사에서 SARS-CoV-2를 검출할 수 있으며, 면역이 형성된 후에는 혈청학적 검사로서 SARS-CoV-2를 검출할 수 있다. Genome sequencing은 NGS로 가능하며, 분자생물학적 검사법이 혈청학적 검사법보다 정확도가 높다. 신속, 사용자 친화적, 접근성, 경제성 및 POCT 방법은 혈청학적 테스트와 바이러스 항원 테스트에 용이하다[60].

SARS-CoV-2 diagnostic tests platforms

Viral RNA test: RT-qPCR Viral RNA test: RT-LAMP, CRISPR-Cas Viral genome: NGS Viral antigen tests Serological antibody tests
Infection status H H H H L
Immunity status L L L L H
Genome sequencing Possible Impossible Impossible Impossible Impossible
Accuracy H H H M Less than H,
more than M
Rapid L Less than H,
more than M
L H H
User friendly L Less than H,
more than M
L H H
Accessibility L Less than H,
more than M
L H H
Affordability Less than M,
more than L
Less than H,
more than M
L H H
Point of care Impossible Impossible Impossible Possible Possible
Sample preparation Difficult M Difficult Easy Easy
Cross reactivity Impossible Impossible Impossible Possible Possible
Airway swab, sputum Yes Yes Yes No No
Blood, serum Yes Yes Yes Yes Yes

Abbreviations: RT-qPCR, reverse transcription quantitative polymerase chain reaction; RT-LAMP, reverse transcription loop mediated isothermal amplification; CRISPR-Cas, clustered regularly interspaced short palindromic repeat-caspase; NGS, next generation sequencing; H, high; L, low; M, moderate.

References [8, 14].


Comparison of RT-qPCR and serological immunosaaay

RT-qPCR test Serological antibody test
Advantage High specific Easy to use serological sample
Restriction
  • Sensitivity can decrease due to specimen sampling errors or inadequate viral load (false negative).

  • Inactive virus and viral fragments could also test positive (false positive).

  • Not as accurate as RT-qPCR test, with false positive and false negative.

  • False positive in a low prevalence population can give an overstatement of exposure and immunity.

  • Put right Testing twice sequentially to enhance sensitivity. Analysis validation with sufficient positive and negative sample cohorts; generally cannot be used to diagnosis test newly infected patients, but can be used as a screening test
    Major utility Standard of care diagnosis of newly infected and/or active COVID-19 patients. Screening test for stratifying newly infected patients, surveillance assay for seroprevalence, immunity and vaccination efficacy.

    Abbreviation: RT-qPCR, reverse transcription quantitative polymerase chain reaction.

    References [8, 14].



    COVID-19 검출을 위해 개발 및 제안된 여러 검사법 도구 중, 5가지 검사법만이 FDA 승인을 받았으며. 승인된 검사법은 기술, 검체 수집 및 표적 대상 그리고 검체의 처리 등 다양한 레벨에서 차이가 있어 비교하였다(Table 7) [3].

    Comparisons of FDA-approved COVID-19 diagnostic assays

    RT-qPCR IAT CRISPR ELISA LFIA
    Target ORF1ab, RdRp, E, S, and N gene ORF1ab, RdRp, and N gene ORF1ab, E, and N gene IgG, IgM and IgA Ab IgG and IgM Ab
    Specimen URS, LRS, saliva and BAL URS, LRS, nasal and throat NPS or OPS and BAL Plasma or serum Serum, saliva or nasal swab fluids (Ab)
    Day post symptoms where the target is maximum First week after symptom onset First week after symptom onset First week after symptom onset
  • IgM: 10∼35 days after onset

  • IgG: 10 days after onset

  • IgM: 10∼35 days after onset

  • IgG: 10 days after onset

  • Ag: before or at symp-toms onset

  • Assay to result time 120 min (excluding RNA extraction) 15∼60 min 30∼40 min (DETECTR)
    ∼60 min (SHERLOCK)
    35 min 15∼20 min
    Sample to result time 8 hour 1 hour 45 min∼1 hour 1∼5 hour 20∼30 min
    Result type Quantitative Qualitative Qualitative Quantitative Qualitative
    Sensitivity 93.4∼100% 100% 95% 87.5∼100% Ab: 82∼93.8%
    Ag: 80%
    Specificity 94.9∼100% 100% 100% 95∼100% Ab: 90.6∼100%
    Ag: 100%
    Scale of production Hard Hard Easy Easy Easy
    Cost High Moderate-low Low High-moderate Low

    Abbreviations: RT-PCR, reverse transcription quantitative polymerase chain reaction; IAT, isothermal amplification test; CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeat; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; LFIA, lateral flow immunochromatographic assays; ORF, open reading frame; E, envelop protein; S, spike protein; N, nucleocapsid protein; RdRp, RNA dependent RNA polymerase; IgG, immunoglobulin G; IgM, immunoglobulin M; IgA, immunoglobulin A; Ab, antibody; URS, Upper respiratory specimens; LRS, lower respiratory specimens; BAL, bronchoalveolar lavage fluids; NPS, nasopharyngeal swab; OPS, oropharyngeal swab; Ag, antigen.

    Reference [3].



    백신의 가용성에도 불구하고 SARS-CoV-2가 전 세계적으로 지속적으로 확산됨에 따라 진단검사는 공중 보건의 억제 및 완화 전략의 초석이 되었다. 감염에 대한 징후와 증상 또는 질병의 바이오마커에 대한 정기적인 진단검사는 진단의 역학조사에서 중요한 역할을 하지만 COVID-19을 진단하는 것은 검사방법들 각각의 장점과 단점이 있기 때문에 어느 것 하나만으로 충분하지 않다. 이에 새로운 팬데믹 상황이 발생할 경우 검사실의 용량 수요를 충족시키기 위해 대량의 검사 기구 등을 신속하게 조달하고 추가 인력을 교육하며 검체, 시약 그리고 장비를 검증해야 할 필요성에 직면했다. 또한 COVID-19의 경험을 바탕으로 감염원의 특성을 정확하게 파악한 후 기존 진단검사는 민감도와 특이도를 높이고 신속한 진단결과를 낼 수 있도록 발전시키고 또한 디지털 헬스 케어 도입 등의 새로운 진단검사의 플랫폼의 개발이 이어져야 미래의 팬데믹에 대항할 수 있는 효율적인 대안이 될 것으로 사료된다.

    요 약

    COVID-19로 인한 높은 전염성과 호흡기 질환의 심각성 때문에, 전염의 확산을 더 잘 모니터링하고 예방하기 위해 경제적이고 정확한 검사가 필요하다. COVID-19 대유행의 초기 단계에서 SARS-CoV-2의 구조적 및 분자적 특성이 밝혀짐에 따라, 많은 COVID-19 진단 키트 제조업체들은 진단 테스트의 설계, 개발, 검증 및 구현에 적극적으로 투자했다. 현재, SARS-CoV-2에 대한 진단검사로써 신속한 항원, 특정 IgG 및 IgM 항체검사를 위한 면역 혈청학적 검사 그리고 분자 진단 검사가 가장 널리 사용되고 검증된 기술이다. 분자 진단 분석법은 SARS-CoV-2에 감염된 것으로 의심되는 개인에서 바이러스 RNA를 직접 검출하기 위한 gold standard이다. 항체 기반 혈청 검사는 지역사회에서 COVID-19 유병률을 결정하고 면역력을 획득한 개인을 식별하는 데 사용되는 간접 검사이다. 본 논문에서는 시판되고 FDA가 승인한 분자 및 면역학적 진단 측정을 평가하여 성능 특성을 분석하였다.

    Acknowledgements

    This research was supported by Hyejeon College grant.

    Conflict of interest

    None

    Author’s information (Position)

    Lee CG1, Research Fellow; Lee D2, Professor.

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