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Synergistic Anti-Tumor Effect by the Combination of Cyclophosphamide and Dendritic Cell Vaccination in Murine Tumor Model that CEA Expressing
Korean J Clin Lab Sci 2022;54:38-48  
Published on March 31, 2022
Copyright © 2022 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Mi-Young Park

Department of Clinical Laboratory Science, Suwon Science College, Hwaseong, Korea
Correspondence to: Mi-Young Park
Department of Clinical Laboratory Science, Suwon Science College, 288 Seja-ro, Jeongnam-myeon, Hwaseong 18516, Korea
E-mail: miyeong@ssc.ac.kr
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8033-995X
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Carcinoembryonic antigen (CEA) is an oncofetal antigen primarily detected in the peripheral blood of cancer patients, particularly in those with colorectal cancer. CEA is considered a valuable target for antigen-specific immunotherapy. In this study, we induced the anti-tumor immunity for CEA through the administration of a dendritic cell (DC) vaccine. However, there was a limitation in inducing tumor regression in the DC vaccinated mice. To enhance the efficacy of anti-tumor immunity in MC38/CEA2 tumor-bearing mice, we evaluated the effects of DC vaccine in combination with cyclophosphamide (CYP). Administration of CYP 100 mg/kg in mice resulted in significant inhibition of tumor growth in the 2-day tumor model, whereas a lower inhibition of tumor growth was seen in the 10-day tumor model. Therefore, the 10-day tumor model was selected for testing chemo-immunotherapy. The combined CYP and DC vaccine not only increased tumor antigen-specific immune responses but also induced synergistic anti-tumor immunity. Furthermore, the adverse effects of CYP such as weight loss and immunosuppression by regulatory T cells and myeloid-derived suppressor cells showed a significant reduction in the combined chemo-immunotherapy treatment compared with CYP alone. Our data suggest that chemo-immunotherapy with the DC vaccine may offer a new therapeutic strategy to induce a potent anti-tumor effect and reduce the adverse effects of chemotherapy.
Keywords : Carcinoembryonic antigen, Chemo-immunotherapy, Cyclophosphamide, Dendritic cell vaccine
서 론

종양의 치료를 위해 수술을 통한 절제술, 방사선 치료 그리고 다양한 화학 물질 요법이 중추적으로 이용되어져 왔으나 지속적인 연구에도 불구하고 전체 종양 환자에 걸친 사망률이 증가되어 새로운 유형의 치료가 요구되어졌다.

현재 종양 치료를 목적으로 개발되고 있는 분자 또는 유전자 수준의 다양한 면역 치료법 중 종양 환자에서 종양세포에 대해 특이적인 면역반응을 유발함으로서 종양세포를 제거하기 위한 면역 치료법에 대한 연구가 진행되고 있다[1-4]. 본 연구에 사용된 종양항원인 암 태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)은 태아 결장에서는 높게, 정상 성인의 대장 상피에서는 낮은 수준으로 발현되는 180 kDa의 당단백질로서 대장 직장암, 위암, 및 췌장암에서 95%이상 발현되고, 유방암의 약 50%, 비소세포성 폐암의 70%에서 발현된다. CEA는 항암 면역반응을 유도하기 위한 항원의 표적으로 제공되고 있다[5]. 항종양 면역반응에는 일반적으로 세포성 면역반응이 관여하고, 이러한 반응은 세포독성 T세포(cytotoxic T lymphocyte, CTL, CD8+ T 세포)의 역할이 중요한 것으로 알려져 있다[6]. CEA를 발현하는 vaccinia 바이러스를 마우스에게 투여한 결과로 마우스의 비장세포에서 CEA에 대한 CTL이 유도되었고, CEA를 발현하는 종양 마우스에 CTL의 입양 세포 전이 요법(adoptive cell transfer therapy)은 종양 성장 억제 효과를 나타냈다[7]. 최근에는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 T세포에 도입한 CAR-T세포를 이용하여 CEA를 표적으로 하는 암세포를 치료하기 위한 노력들이 전임상 및 임상 1상 연구에서 활발히 이뤄지고 있다[8-11]. 수지상세포(dendritic cells, DC)는 체내의 가장 강력한 항원제시세포로서 효과적으로 종양항원을 전달하여 항원 특이 CTL을 유도하는 것으로 알려져 있다. 임상에서 종양항원을 감작시킨 수지상세포 백신을 이용하여 악성 뇌종양을 치료한 보고가 있다[12]. 면역치료는 종양세포의 감소를 목적으로 하는 화학치료에 부가적인 치료로서 주목받고 있으며 면역치료의 전략은 종양에 특이적인 CTL을 유도하여 효과적인 치료를 목적으로 한다. 그러나 최근 여러가지 전임상 및 임상 연구 결과에 의하면 수지상세포 백신 단독으로는 종양의 치료에 한계가 있음이 밝혀지고 있다[13-16].

본 연구에서는 CEA를 발현하는 종양이 확립된 마우스에 cyclophosphamide (CYP)를 주입하여 종양세포를 일차적으로 억제시키고 동시에 CEA 특이적인 수지상세포 백신을 투여하여 화학 면역치료를 함으로써 단일 치료의 한계점을 극복하고 병합치료에 대한 항종양기전을 분석하여 임상적으로 적용할 수 있는 기초 자료를 제시하고자 한다.

재료 및 방법

1. 세포주 및 배양

CEA를 발현하는 마우스 대장암 종양 세포주인 MC38/CEA2 세포주는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA)과 2 mM L-glutamine (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA), 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA)이 포함된 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지를 이용하여 37°C, 5% 이산화탄소(CO2) 배양기(Forma Steri-Cycle, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) 에서 배양하였다.

2. 골수성 수지상 세포의 배양

실험쥐 유래된 수지상세포를 배양하기 위하여 6∼8주령 암컷 C57BL/6 마우스(H-2b, 대한 바이오링크, 충북음성, 한국)의 대퇴골(femur)과 경골(tibia)에서 1 mL 주사기를 이용하여 골수 세포를 얻었다. 수집된 골수 세포는 나일론 메시 세포 여과기(40 μm, BD Falcon, Glendale, AZ, USA)를 통해 단일 세포로 만든 후, 적혈구는 Tris-buffer 0.15 M ammonium chloride (pH 7.2)로 용해시키고 남아있는 세포의 수는 혈구 계산기로 측정하였다. 6-well 배양접시에 10 ng/mL의 재조합 마우스 과립구 큰포식세포 집락자극인자(granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor, GM-CSF, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)와 10 ng/mL의 재조합 마우스 인터루킨-4 (interleukin-4, IL-4, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)가 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지에서 이틀 간격으로 7일간 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그리고, 수지상세포의 성숙을 유도하기 위하여 7일째에 1 μg/mL 농도의 lipopolysaccharide (LPS, Sigma, Schnelldorf, Germany)를 첨가하여 24시간 더 배양하였다.

3. 유세포분석

수지상세포의 표현형을 조사하기 위하여 배양된 세포를 2% FBS가 포함된 인산 완충 용액(Phosphate Buffer Saline, PBS)으로 2회 세척하고, Fluorescein isothiocyanate (FITC) 또는 phycoerythrin (PE) 형광이 결합된 특이 항체를 첨가하여 4°C에서 30분간 반응시켰다. 마우스 CD11c-PE, major histocompatibility complex (MHC) Class II-FITC, CD80-FITC, CD86-FITC, CD3-PE, CD19-FITC, NK1.1-PE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 단일클론항체가 사용되었다.

CEA를 발현하는 종양 마우스에 cyclophosphamide (CYP; C0768, Sigma, Germany) 100 mg/kg 또는 CEA 펩타이드가 감작된 수지상세포 백신(CEA/DC) 투여 및 이 두 가지를 병합 투여(CYP 100 mg/kg +CEA/DC, 화학면역치료)하였다. 종양세포 투여(0일) 후 35일째에 기억 CD8 T세포(memory CD8 T cell), 골수유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSC) 및 조절 T세포(regulatory T cells, Treg)의 발현을 확인하기 위하여 각 마우스의 비장세포를 2% FBS가 포함된 PBS 로 2회 세척하고, 형광이 결합된 특이-항체를 첨가하여 4°C에서 30분간 반응시켰다. Memory CD8 T cell의 형광염색을 위해 CD8-PE, CD44-APC, CD62L-FITC 마우스 단일클론항체(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 사용되었다. MDSC의 형광염색을 위해 CD11b-PE, Ly6G-APC와 Ly6C-FITC, Treg의 형광염색을 위해서 CD3-PE-Cy7, CD4-FITC, CD25-APC와 FoxP3-PE 마우스 단일클론항체(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 사용되었다. 세포의 형광을 유세포 측정기(FACScan, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 측정하고 FlowJo Version 6.0 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다.

4. 세포독성 T세포(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 유도

마우스 H-2Kb에 특이적인 항원 결정기로 알려진 CEA 펩타이드(EAQNTTYL)는 ANYGEN CO., LTD (Gwangju, Korea) 사에 의뢰하여 제조하였다. C57BL/6 마우스에서 유래된 수지상세포(1×106/mL)에 CEA 펩타이드를 10 μg/mL 농도로 37°C, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 감작시킨 후 PBS로 2회 세척하고 마우스의 피하층에 주사하였다. 대조군은 CEA 펩타이드가 없이 수지상세포만을 투여하였다. 일주일 간격으로 2회 더 면역시키고 7일 후 마우스의 비장세포를 나일론 울 섬유 컬럼(Polyscience, Chicago, IL, USA)을 이용하여 T세포를 순수 분리하였다. 유도된 T세포는 51Cr을 이용하여 세포 살해능을 측정하였고 유도된 CTL의 IFN-γ 분비능을 효소결합면역점(enzyme-linked immunospot, ELISPOT) 분석으로 확인하였다.

5. 51Cr에 의한 CTL의 살해능 측정

수지상세포 백신을 2회 투여하였고 1주일 후에 마우스의 비장에서 T세포를 분리하여 효과세포(effector cell)로 사용하였다. 51Cr (PerkinElmer, Akron, OH, USA)을 target cell에 100 μCi 적하하고, 37°C, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 표지하고 RPMI1640배지를 가해 3회 세척하였다. 96마이크로 플레이트 소경(well)에 effector cell (E: 각각 4×105, 2×105, 1×105/100 μL/well)과 51Cr이 표지된 target cell (T: MC38/CEA2 또는 GL26:1×104/100 μL/well)을 섞어(E: T대비=40:1 20:1, 10:1, 200 μL/well), 37°C, 5% CO2 배양기에서 5시간 혼합 배양하였다. 마이크로 플레이트용의 원심기에서 1,000회전(rpm)에서 5분간 원심하고 상청액의 100 μL를 채취하였다. 유도된 CTL (Effector cell)에 의해서 51Cr이 표지된 target cell이 파괴되면 세포 내에서 51Cr이 상청액으로 방출된다. 상청액으로 방출된 51Cr의 방사능 활성을 감마 카운터(PerkinElmer, Akron, OH, USA)에서 측정하였다. 다음과 같은 방법으로 세포 살해능을 분석하였다.

세포 살해능(%)=experimental release-spontaneous release/maximal release-spontaneous release×100

Maximum release: target cell에 1% Triton X-100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 반응시켜target cell을 완전히 용해 후 100 μL 상청액에서 회수된 cpm 값

Spontaneous release: effector cell 없이 target cell만 있는 well의 100 μL 상청액에서 회수된 cpm 값

6. ELISPOT에 의한 interferon (IFN)-γ 발현 림프구 측정

CEA 펩타이드에 대한 세포성 면역반응의 유도를 확인하기 위해서 IFN-γ 발현 림프구를 측정하였다. 마우스 수지상세포에10μg/mL의 CEA 펩타이드를 2시간 동안 37°C, 5% CO2 배양기에서 감작시켰고 자극세포(stimulator)로 이용하였다. PBS, CYP 100 mg/kg, CEA/DCx3 그리고 화학면역치료군의 각각의 마우스의 비장세포를 분리하여 적혈구를 제거한 다음 혈구계산기로 세포의 수를 측정하여 반응세포(responder)로 이용하였다. Stimulator: responder를 각각 1×105/100 μL/well의 1:1의 비율로 혼합하였다. 혼합된 세포를 마우스 포획 단일클론항체 IFN-γ가 코팅된 96마이크로 플레이트 well에 첨가시킨 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 24 시간 반응시켰다. 이후, PBS/Tween (0.05%)로 96마이크로 플레이트 well을 3회 세척하였고 2 μg/mL biotin이 부착된 항 IFN-γ 항체를 96마이크로 플레이트 well에 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 96마이크로 플레이트 well을 PBS/Tween (0.05%)로 4번 세척한 다음 avidin/alkaline phosphatase를 첨가하여 실온에서 1시간 반응을 통해 발색시켰다. 각 well의 점 갯수를 ELISPOT Reader (Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)를 이용하여 측정하였다.

7. 실험 동물 모델

C57BL/6 마우스 6주령에 MC38/CEA2 세포주를 1×106으로 피하층에 주사하였고 2일, 10일 후 CYP를 이용하여 화학치료를 하였다. 수지상세포를 이용한 백신 그리고 CYP 와 수지상세포 백신을 이용한 병합치료는 MC38/CEA2 세포주를 주사한 지 10일 후에 치료하였다. 종양 크기를 주당 3회 내경 측정기 (caliper, 엘케이에프, 안산, 대한민국)로 가로와 세로를 항상 일정한 방법으로 측정하였다. 최종적으로 70일까지 관찰하면서 마우스의 무게와 생존율을 측정하였다. 모든 동물실험은 가톨릭대학교 내 동물실험윤리위원회(IACUC. CUMC-2014-0071-02)에 의해 승인되었다.

1) CYP를 이용한 화학치료

CYP는 MC38/CEA2 세포주를 주사한 지 2일, 10일 후에 각각 100 mg/kg, 50 mg/kg, 25 mg/kg 그리고 12.5 mg/kg의 농도로 마우스의 복강 내에 주사하였고 대조군으로는 PBS를 주사하였다.

2) 수지상세포를 이용한 백신

각 마우스는 CEA 펩타이드로 감작시킨 수지상세포(1×106 세포/마우스, 수지상세포 백신)를 일주일 간격으로 각각 1회, 2회 그리고 3회 피하층에 주사하였다. 대조군으로는 PBS와 CEA 펩타이드가 감작되지 않은 수지상세포를 주사하였다.

3) CYP와 수지상세포 백신을 이용한 병합치료

각 마우스는 CYP 100 mg/kg을 복강 내에 주사한 지 6시간 후에 수지상세포 백신을 일주일 간격으로 각각 1회, 2회 그리고 3회 피하층에 주사하였고 대조군으로는 PBS를 주사하였다.

4) CYP의 농도별에 따른 면역치료의 병합치료

CYP의 농도를 100 mg/kg, 50 mg/kg, 25 mg/kg, 그리고 12.5 mg/kg으로 주입한 지 6시간 후 각각의 실험군에 수지상세포 백신을 투여하였다. 이후, 일주일 간격으로 2회 더 수지상세포 백신을 피하층에 주사하여 병합치료하였다. 대조군으로는 PBS를 주사하였다.

8. 통계학적 분석

모든 측정 결과는 평균 표준편차(mean±SEM)로 표시하였고, GraphPad PRISM Version 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)의 Student's t-test 또는 one-way ANOVA test로 통계처리하여 자료의 유의성을 검정하였으며, 모든 통계학적 유의수준은 P<0.05 이하로 하였다.

결 과

1. CEA 발현 마우스 대장암 모델에서 CYP의 항종양 효과

CEA를 발현하는 마우스 대장암 종양세포주인 MC38/CEA2를 피하에 투여하여 종양을 치료하는 CYP의 효과를 관찰하였다. 종양세포를 주입한 지 2일 후와 10일 후에 각각 100 mg/kg, 50 mg/kg, 25 mg/kg, 12.5 mg/kg의 농도로 마우스의 복강 내에 CYP를 주사하였다. 2일 소종양군에서 종양세포를 주입한 지 35일째에 고농도 100 mg/kg 순으로 각각 1050.12± 107.26 mm3, 3084.09±297.15 mm3, 6017.56±403.22 mm3 그리고 8141.85±778.11 mm3의 종양의 부피가 관찰되었고 CYP 농도에 비례하여 종양 성장의 지연이 관찰되었다. 그러나 10일 대종양군에서 종양세포를 주입한 지 35일째에 100 mg/kg과50 mg/kg은 각각 7105.57±598.60 mm3과 9247.92± 877.29 mm3의 종양의 부피가 관찰되었고 25 mg/kg과 12.5 mg/kg의 농도로 투여된 마우스는 28일∼35일 사이에 모두 사망하였다. 2일 소종양군과 비교하여 10일 대종양군에서는 종양 성장의 억제가 감소된 것으로 나타났다(Figure 1).

Fig. 1. Effect of MC38/CEA2 tumors for treatment with various doses of cyclophosphamide. (A) Schematic representation of the experimental groups and schedule. Mice were subcutaneously given 1×106 MC38/CEA2 cells on day 0 in the right flank. On days 2 (B) or days 10 (C), the mice received 100 mg/kg (○), 50 mg/kg (◇), 25 mg/kg (●), 12.5 mg/kg (■) of cyclophosphamide intraperitoneal, respectively. The results represent the average values±SD of ten mice per group in a representative experiment of three separate experiments. ***P<0.001 compared with the CYP 50 mg/kg group.

2. 수지상세포백신을 이용한 화학면역치료

마우스의 골수로부터 배양된 수지상세포의 표현형을 조사한 결과, CD11c, MHC Class II, CD80 (B7-1) 및 CD86 (B7-2) 분자들이 80∼90%의 발현율을 보였다. CD3 T 세포, CD19 B 세포 및 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포)는 3% 미만으로 나타났다(Figure 2).

Fig. 2. Phenotypical analysis of bone marrow dendritic cells (DC) generated from C57BL/6 mice. DC were stained with fluorescence conjugated monoclonal antibody as described in Materials and Methods and then analyzed. The frequency of positive staining for CD11c, MHC class II, CD80 and CD86 was over 80%, while staining for CD3 and CD19 was less than 3%.

10일 대종양군의 마우스에 수지상세포 백신 횟수에 따른 항종양 효과와 CYP와 수지상세포 백신이 병합된 항종양 효과를 조사하였다(Figure 3A). 수지상세포 백신 3회 투여군과 2회 투여군은 각각 5,100 mm3과 8,240 mm3의 종양의 부피가 측정되어 항종양 효과를 나타냈다. 하지만 2회까지 백신의 횟수를 늘려도 대조군 PBS군과 비교하여 유의한 효과는 없었다(Figure 3B). CYP 100 mg/kg에 수지상세포 백신을 병합 시 1회 투여군은 3,708.61±405.40 mm3, 2회 투여군은 2150.08± 169.23 mm3 그리고 3회 투여군은 1536.17±104.75 mm3 의 종양의 부피를 나타내어 강력한 항종양 효과가 관찰되었으나 CYP 투여 후 뒤따른 수지상세포 백신의 횟수에 따른 유의성은 없었다(Figure 3C). CYP 100 mg/kg, 50 mg/kg, 25 mg/kg, 그리고 12.5 mg/kg을 각각 투여 후 수지상세포 백신을 3회씩 병합치료한 실험군에서는 1536.17±104.75 mm3, 3,091.28± 313.69 mm3, 4,525.07±297.66 mm3 그리고 7,100.83± 506.18 mm3의 종양 부피를 나타냈다(Figure 3D).

Fig. 3. Effect of cyclophosphamide on tumor growth following DC vaccine. (A) Schematic representation of the experimental groups and schedule. Mice were subcutaneously implanted with 1 x 106 MC38/CEA2 cells in the right flank on 10 days. (B) After 10 days, the mice were subcutaneously vaccinated in the opposite flank either once (●), or twice (■), or thrice (▲) with 1×106 CEA peptide pulsed DC or mock DC (thrice: ○) or PBS (X) at intervals of one week. (C) After 10 days, the mice were intraperitoneal (i.p.) injected with cyclophosphamide 100 mg/kg followed 6 hr later by the subcutaneous (s.c.) injection of 1×106 CEA peptide pulsed DC on 10 days (once ●), 17 days (twice ■), and 24 days (thrice ▲), repectively. (D) Various dose (100: ●, 50: ▲, 25: ■, 12.5 mg/kg: ○) of cyclophosphamide i.p. followed 6 hr later by the s.c. injection of 1×106 CEA peptide pulsed DC: thrice weekly. The results represent the average values±SD of ten mice per group in a representative experiment of three separate experiments. The numbers in parentheses refer to the survival mice per total number of mice in each group. **P<0.01, *P<0.05.

3. 화학치료에 의한 체중 감소를 완화시키는 화학면역치료

10일 대종양군의 마우스에서 CYP 100 mg/kg 치료군, 수지상세포 백신 3회(CEA/DCx3) 치료군과 CYP 100 mg/kg에 CEA/DCx3을 병합하는 화학면역치료군(CYP 100 mg/kg+ CEA/DCx3)의 체중과 종양 억제능을 측정하였다(Figure 4A). 종양세포 투여 후 35일에 화학면역치료군은 CYP 100 mg/kg 치료군과 비교하여 마우스의 체중과 종양 억제능에서 유의한 차이를 나타냈다. CYP 100 mg/kg 치료군은 30.5%의 종양 억제능을 보였고 CEA/DCx3 치료군은 50.2%의 종양 억제능을 보였다(Figure 4B). CYP 100 mg/kg 치료군은 14.4 g의 체중이 측정되었고 25.2 g의 CEA/DCx3와 비교하여 유의성 있는 체중의 감소를 보였다(Figure 4C). 반면에 화학면역치료군은 90.1%에 달하는 강력한 종양 억제능(Figure 4B)을 보였을 뿐만 아니라 20.5 g의 체중(Figure 4C)을 나타내어 CYP 100 mg/kg 치료군과 비교하여 체중의 감소가 유의하게 완화되었다.

Fig. 4. Induction of potent anti-tumor immunity and amelioration of body weight loss by chemo-immunotherapy. (A) Schematic representation of the experimental groups and schedule. (B) The data represents an inhibition of tumor growth on 35 days in administered mice by each treatment in Figure 1, Figure 3. (C) Mice were injected with CYP 100 mg/kg (i.p.×1) or 1×106 CEA peptide-pulsed DC×3 (CEA/DC×3) or CYP 100 mg/kg (i.p.×1)+CEA/DC×3 on 10 days after s.c. implantation of MC38/CEA2 cells in the right flank. CEA/DC×3 was subcutaneously vaccinated three times every week in the opposite flank. The data shows a body weight on 35 days in administered mice by each treatment. The results represent the average values±SD of ten mice per group in a representative experiment of three separate experiments. ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.

4. 화학면역치료에 의해 증가된 종양항원 특이 T세포 면역반응 및 기억 CD8 T세포

화학치료 또는 면역치료보다 화학면역치료에 의해 종양항원 특이 T세포 면역반응이 증가되는지를 조사하였다. MC38/CEA2 표적세포에 대해서 CYP 100 mg/kg 치료군은 20.5%, CEA/DCx3 치료군은 25.6% 그리고 화학면역치료군은 45.1%의 종양항원 특이 살해능이 관찰되었다(Figure 5A). 반면에 모든 치료군에서 마우스 뇌종양 세포주인 GL26 (CEA를 발현하지 않는 세포주)에 대해서는 종양항원 특이 살해능이 없는 것으로 나타났다.

Fig. 5. Increase of tumor antigen specific T cells immune responses and memory CD8 T cells by chemo-immunotherapy. (A) Target cells of MC38/CEA2 and GL26 were labeled with 51Cr and incubated with effector cells in the ratio indicated. The results show the mean specific lysis of splenocytes from individually tested mice. (B) The results represent the mean number of IFN-γ spots per 5×104 splenocytes from individually tested mice using ELISPOT. (C) At days 35 post tumor challenge, the splenocytes from mice of each group were harvested and stained with anti-CD8, anti-CD44 and anti-CD62L antibodies. The proportion of central memory T cells (TCM) and effector memory T cells (TEM) gated on CD8 T cells were measured by flow cytometry. ***P<0.001 indicates a statistically significant difference of the underlined groups. The results represent the average values±SD of four mice per group in a representative experiment of three separate experiments.

종양항원 특이 T세포의 IFN-γ 분비능을 조사하였다. IFN-γ를 분비하는 CD8 T세포는 CEA/DCx3 치료군은 120±8개, CYP 100 mg/kg 치료군은 200±14개, 그리고 화학면역치료군은 290±18개의 면역점이 관찰되었다(Figure 5B).

화학치료 또는 면역치료보다 화학면역치료에 의해 memory CD8 T세포가 증가되는지를 조사하였다. 중앙 기억 CD8 T세포(central memory CD8 T cells)와 효과 기억 CD8 T세포(effector memory CD8 T cells)는 CYP 100 mg/kg 치료군에서 각각 1.5±0.2%와 3.6±0.4%를 나타냈다. CEA/DCx3 치료군에서는 각각 4.0±0.5%와 11.0±0.8%가 관찰되어 CYP 100 mg/kg 치료군보다 유의성 있게 증가되었다(Figure 5C). 특히, 화학면역치료군에서는 effector memory CD8 T cells이 23.7±1.3%를 보였고 CEA/DCx3 치료군과 비교하여 두 배 이상의 증가를 보였다.

5.화학면역치료에 의한 Treg과 MDSC의 효율적인 억제

화학치료군과 비교하여 화학면역치료군에서 증가된 항종양 특이 면역반응의 기전을 조사하고자 CYP 100 mg/kg, CEA/DCx3, 그리고 화학면역치료군의 비장세포에서 Treg과 MDSC의 영향을 관찰하였다. 종양세포 투여한 지 35일에 CYP 100 mg/kg 치료군의 마우스의 비장세포에서 11.4±0.8%의 Treg (Figure 6A)과 17.3±1.9%의 MDSC (Figure 6B)가 관찰되었다. 반면에 화학면역치료군의 비장세포에서는 4.2±0.9%의 Treg과 8.0±1.2%의 MDSC가 관찰되었고 CYP 100 mg/kg 치료군과 비교하여 면역억제 반응이 완화되는 것으로 나타났다.

Fig. 6. The proportion of regulatory T cells and myeloid-derived suppressor cells in the splenocytes of administered tumor bearing mice by each treatment. At days 11 post all treatment, the splenocytes from each mouse were harvested and stained with Treg (A) antibodies and MDSC (B) antibodies. The proportion of Treg (upper panel) and MDSC (bottom panel) were measured by flow cytometry. ***P<0.001, **P<0.01 indicates a statistically significant difference of the underlined groups. The results represent the average values±SD of four mice per group in a representative experiment of three separate experiments.
고 찰

현재 종양환자를 치료하기 위한 방법으로는 수술, 화학치료, 방사선치료 등이 있다. 그러나 각각의 치료방법이 한계를 갖고 있어 종양을 완치하지 못하는 경우가 많다. 수술에 의해 종양 조직을 제거하더라도 소수의 종양세포가 다른 부위로 전이될 가능성이 크고 화학치료는 비교적 광범위하게 치료에 사용할 수 있으나, 대부분의 고형 종양에서 치료율이 좋지 않고 정상적인 세포들도 죽여 여러 가지 부작용이 있다. 따라서 새로운 치료기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

수지상세포는 종양 관련 항원을 효과적으로 면역 세포에 전달하여 항암 효능 세포가 활성화되도록 하는 데 가장 중심 역할을 하는 것으로 알려져 있다[17]. 본 실험을 위해 배양된 수지상세포는 항원 제시 기능을 담당할 수 있는 MHC Class II 분자를 높게 발현하였고, CD11c 및 공동자극분자(CD80, CD86)들의 발현도 높게 나타났다(Figure 2). CEA 특이 CTL을 유도하기 위해 수지상세포 백신을 마우스에 3회 투여함으로써 CEA 항원에 대한 특이적인 CTL의 활성이 증가하는 것을 관찰하였다 (Figure 5A). CEA 발현 마우스 종양모델에 수지상세포 백신의 투여는 central memory CD8 T세포와 effector memory CD8 T세포를 효과적으로 유도하였고 화학면역치료군은 effector memory CD8 T세포에서 상승적인 효과를 보였다(Figure 5C). 이러한 실험 결과를 바탕으로 CEA를 발현하는 마우스 대장암 종양 세포주인 MC38/CEA2를 피하에 주입하였고 10일 대종양군에서 수지상세포 백신을 이용한 항종양의 효과를 관찰하였다. CEA/DCx3에 의해서는 종양 성장의 억제가 50.2%에 그쳤고(Figure 4B), 이는 종양의 완전한 관해는 수지상세포 백신 단독 치료만으로는 부족한 것으로 나타났다.

이러한 면역치료 단독의 한계점을 보완하기 위하여 화학치료제인 CYP단독의 효과를 검증하였다. 알킬화제 항암제인 CYP는 입양전이된 T세포의 항종양 효과를 더하여 준다[18]. 다른 기전은 CYP가 유도하는 싸이토카인의 생성이다. 즉, CTL을 유도하는 I형 인터페론(α/β-인터페론)을 형성한다[19]. 2일 소종양군에 비해 10일 대종양군은 CYP 100 mg/kg의 농도에서도 42일 만에 모두 사망하여 CYP에 의한 억제 효과가 적게 나타났으며 화학치료에 의해 치료하기 어려운 생체 내 모델로 적합한 것으로 판단하여 면역치료와의 병합치료는 10일 대종양군으로 설정하였다(Figure 1).

본 연구에서는 CYP 농도와 면역세포 농도와의 상관관계를 알아보고자 CYP 농도를 다르게 주입 후 CEA/DCx3을 병합하였다. Vierboom 등에 의해 화학치료와 면역치료를 병합치료하기 위한 적절한 시간에 대한 연구가 보고되었다. CYP를 투여 후 시간별로(1, 4, 8, 24, 48시간) p53 특이 CTL의 세포 살해능을 측정한 결과 1시간 후는 적합하지 못했고 24시간이 가장 적합하였다. 1시간을 제외한 다른 시간에서는 CYP가 CTL의 생존율 등 독성에 대한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다[20]. 본 연구에서는 이 연구 결과를 바탕으로 CYP를 주입한 지 6시간 후에 CEA/DC를 이용한 병합치료를 하는 것으로 결정하였다. CYP 100 mg/kg, 50 mg/kg, 25 mg/kg 그리고 12.5 mg/kg의 각각의 종양군에 CEA/DCx3을 병합치료를 하였을 때 CYP농도에 의존적인 방식으로 항종양 효과가 나타나는 것을 확인하였다(Figure 3D). CYP의 농도를 증가시킴으로써 수지상세포 백신의 효과가 유의하게 증가되었고 확립된 큰 종양을 치료하기 위해 화학치료제, 항체 치료제 등 항종양성 물질의 적정한 농도의 선택이 중요하다는 것을 제시한다[21]. 위의 실험과 연관하여 일정한 CYP 농도(100 mg/kg)에 CEA/DC를 각각 1회, 2회, 3회 병합한 군에서는 항종양 효과의 유의한 차이가 없었다(Figure 3C). 그러므로 면역치료는 화학치료에 의해 크기가 감소된 종양에서 더욱 효과적임을 알 수 있었다. 흑색종의 10일 대종양군에서 CYP를 정기적인 용량(metronomic dose, 175 mg/kg을 80일 동안 6일 간격으로 주입)와 기존의 표준 항암 치료로 환자에게 안전하게 사용할 수 있는 최대 용량(maximum tolerated dose, MTD, 1cycle: 150 mg/kg을 6일 동안 매일 주입 후 15일 쉬고 1 cycle 더 반복하여 주입)로 이용하여 치료하였다. MTD는 34일까지, metronomic dose는 42일까지 생존하였다. CYP의 metronomic dose와 흑색종 연관 DNA 백신(DNA-mel3)을 병합함으로써 종양 주입 후 81일에 마우스 5마리 중 2마리의 종양을 제거하였다는 보고가 있다[22]. 4T1과 4T07의 유방암을 치료하기 위해 4일 후 4T1, 4T1-IL-2, 4T07-IL-2 백신으로 감작된 배출 림프절(draining lymph node, DLN)의 세포를 CYP 100 mg/kg과 병합하여 치료했으나 대조군과 비교하여 항종양 효과가 없었고, bryostatin1과 ionomycin으로 DLN 세포(4일 소종양: 1×107 세포, 10일 대종양: 5×107 세포)를 활성화시킨 후 CYP 100 mg/kg과 병합하여 4T1종양을 완전히 제거시켰다[23]. 이러한 보고들에서 알 수 있듯이 이미 확립된 종양을 치료하기는 매우 어려우므로 백신의 횟수, 투여 경로, 항원의 양, 치료 시기 등의 특성을 고려하여야 할 것으로 생각된다.

CYP가 숙주에 어떤 영향을 끼치는지 알아보기 위해 마우스의 체중과 종양의 부피를 동시에 측정하였다. 화학면역치료군과 비교했을 때 CYP 치료군은 종양세포 주입 후 35일(CYP 주입 후 25일)에 마우스의 무게가 크게 감소하였다(Figure 4C). 화학약품을 이용한 항암제는 탈모, 체중 감소, 복통, 구토 등 숙주에게 여러 가지 부작용을 일으키는 것으로 널리 알려져 있다. 본 연구 결과에서는 화학면역치료군과 면역치료군에서는 체중 감소의 현상이 관찰되지 않았다. 면역치료가 화학치료의 부작용을 개선시키는 것으로 생각된다. 종양을 치료하기 위한 단독 화학치료는 생체 내에서 Treg과 MDSC의 축적으로 항원 특이CTL의 면역반응을 억제한다[24-28]. 화학면역치료군에서는 CYP치료군과 비교하여 Treg과 MDSC가 유의하게 감소되었다(Figure 6). 이러한 결과는 종양세포가 매개하는 면역억제의 환경을 화학면역치료가 개선함으로써 항종양 면역 반응을 증진시키는 것이다.

결론적으로 CYP를 이용한 화학치료와 수지상세포 백신을 병합한 화학면역치료는 상승적인 항종양 효과 및 화학치료에 의한 부작용의 개선을 증명하며, 기존의 종양치료법의 한계를 보완할 수 있는 치료모델로써 이용될 수 있을 것이다.

요 약

Carcinoembryonic antigen (CEA)는 다양한 종양에서 발현되는 자가 항원으로 면역치료에서 강력한 표지 인자이며 면역치료를 위한 표적 종양항원으로 널리 알려져 있다. 그러나 수지상세포 단독 치료는 동물모델에서 종양의 발생을 억제하는 데 효과가 있지만 이미 확립된 종양을 제거하는 데는 한계가 있다. 본 연구에서는 항종양 면역 효과를 증가시키기 위하여 화학치료제인 cyclophosphamide (CYP)와 종양 특이 면역치료법인 수지상세포 백신의 병합치료 효과를 CEA를 발현하는 마우스 종양 모델에서 검증하였다. 종양세포 주입 후 2일 소종양군과 10일 대종양군에서 CYP의 항종양 효과를 비교한 결과, 소종양군에서는 100 mg/kg에서 뚜렷한 종양 성장의 억제 효과가 관찰되었지만 대종양군에서는 약한 억제 효과가 관찰되어 본 연구에서는 대종양군을 병합치료의 적합한 모델로 설정하였다. CYP 와 수지상세포 백신의 병합치료(화학면역치료) 시 종양항원 특이 면역반응이 증가되었을 뿐만 아니라 상승적인 항종양 효과가 나타났다. 또한 CYP 치료에서 나타나는 체중 감소 및 조절 T세포와 골수유래 억제세포의 증가에 의한 면역억제는 화학면역치료에 의해 개선되었다. 항원 특이 면역치료를 병합한 화학면역치료가 화학치료의 부작용을 감소시키고 항종양 효과를 증가시킬 수 있는 치료 전략이 될 수 있을 것이다.

Acknowledgements

This article is based on a part of the first author’s master’s thesis from University.

Conflict of interest

None

Author’s information (Position)

Park MY, Professor.

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