
치매(dementia)를 비롯한 파킨슨병(Parkinsonism)이나 헌팅톤병(Huntington’s disease)은 모두 뇌세포의 손상이나 퇴화에 기인한 뇌질환으로서, 이들 질환에 이완될 경우 정상적인 삶의 영위가 어렵게 된다[1]. 최근, 많은 선진국들이 고령사회로 접어 들면서 노인인구의 급증으로 말미암아 치매를 비롯한 고혈압, 골다공증, 당뇨와 같은 만성퇴행성질환이 사회적 관심의 대상이 되었다[2]. 특히, 치매는 뇌조직의 노화나 뇌출혈을 비롯한 외상이나 화학약제, 중금속과 같은 외부요인 등에 의한 뇌세포의 퇴행성 변화로 신경세포간의 연접이상이나 전달물질 분비이상 또는 세포내 아밀로이드 단백질 침착, 세포내 구성성분의 구조적 변화 등과 같은 여러 요인에 의하여 입력된 외부의 정보가 정상적으로 전달되지 못하는데 그 원인이 있다[3].
치매는 인류를 위협하는 가장 위험한 질환의 하나로서 아직까지 이에 대한 뚜렷한 예방이나 치료방법 및 치료약제의 개발이 매우 미흡한 수준에 있다. 현재 치료로는 콜린에스테라아제(cholinesterase) 저해제 투여로 치료하고 있는 실정이다[1]. 치매의 유발요인의 하나로 중금속의 일종인 알루미늄이 제시된 바, 염화알루미늄(AlCl3)과 같은 알루미늄화합물들은 페인트제조를 비롯한 석유정제나 윤활유합성, 매염제, 탈취제와 같은 여러 공정에 사용되지만, 특히 도시락용기를 비롯한 음료수 캔과 같은 식생활수단으로 사용됨으로써 인체의 건강과 매우 밀접하게 연관되어 있다[4]. 따라서, 알루미늄의 독성이 사회적 관심으로 떠오르게 되면서 이에 대한 독성기전규명이나 치료를 위한 대체약물의 개발이 시급한 과제가 되었다[5].
치매와 같은 뇌병변에 이완될 경우, 가장 먼저 활성화되어 반응하는 세포는 신경세포(neuron)를 지지해 주는 신경아교세포(neuroglial cell)이다. 신경아교세포는 손상된 뇌세포의 회복을 위하여 신경세포에 대하여 영양공급을 비롯한 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)형성, 죽은 세포의 처리 및 신경돌기재생과 같은 다양한 보호기능을 수행한다. 신경아교세포의 활성은 질환의 치료적 예후와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려지면서 이를 활용한 병변의 치료적 접근이 시도되었다[6]. 근래, 수은이나 철, 구리, 카드뮴과 같은 중금속화합물들이 인체내에서 붕괴되는 과정에서 자유라디칼(free radicals)을 생성한다고 제시되면서 독성과 산화적 손상에 대한 연구가 이루어지고 있다. 항산화제인 비타민 E가 메틸 수은의 독성을 방어했다고 보고한 연구가 이를 뒷받침하고 있다[7].
근래, 각종 식물에는 여러 질환에 유효한 생리활성물질이 들어 있다고 제시되면서 이들 성분의 효능에 대한 연구가 이루어지고 있다[8]. 예를 들면, 식물에 항암이나 항균, 항염 등에 유용한 페놀성 화합물이나 이소프레노이드 또는 단백질이나 아미노산과 같은 배당체 물질들이 다량 함유되어 있다고 밝혀지면서 이를 이용한 치료와 관련된 연구가 시도되고 있다[9]. 식물 중 쑥부쟁이[
근래 세포배양기법이 발달되면서 배양 세포를 이용한 병변의 기전규명이나 대체물질의 효능검정 및 약제의 안전성 검사와 같은 시험관내 정량적 분석도구로 자리잡고 있다. 특히, 신경아교세포주인 C6 glioma세포는 백서의 신경아교암세포에서 유래한 세포주로서 별아교세포(astrocyte)의 형태와 생화학적으로 유사한 특징을 가지고 있다[22]. 본 연구는 치매유발물질인 알루미늄화합물의 일종인 AlCl3에 대한 신경독성을 신경아교세포주인 배양 C6 glioma세포를 가지고 산화적 손상 측면에서 분석하였으며, 이와 동시에, AlCl3의 독성에 대한 AY 추출물의 영향을 항산화 측면에서 조사하여 산화적 손상과 관련된 치매유발 중금속화합물의 독성에 대한 치료적 대체물질로 천연소재의 가능성을 알아보고자 하였다.
본 실험에 사용한 시약으로 AlCl3, rutin, 10% aluminum nitrate, potassium phosphate buffer (pH 7.5), xanthine, trypsin, nitroblue tetrazolium, 1 N HCl, tannic acid, dimethyl sulfoxide (DMSO), kaempferol, phosphate buffered salin (PBS), hydrogen peroxide (H2O2) 및 2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-caboxanilide, disodium salt (XTT)는 Sigma사(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. AlCl3의 제조는 PBS로 50, 100, 150, 200 μM의 각 저장액을 만들어 사용하였다. XTT (50 μg/mL) 저장액은 실험 당일 필요한 농도로 PBS에 희석 사용하였다.
전북 야산에서 3∼10월 사이에 AY 전초를 채취한 후 깨끗이 잘 씻어 통풍이 잘되고 양지바른 곳에서 말린 다음 시료로 보관하여 사용하였다. 추출을 위해 시료 74.4 g과 약 260 mL의 증류수를 1,000 mL 환저플라스크에 넣고 3시간 동안 가열하는 과정을 4회 반복하여 얻은 액을 모아 여과한 후 574 × g에서 30분 동안 원심분리한 다음 감압농축시켜 수율이 3.2%인 2.4 g의 시료를 얻었다.
C6 glioma세포주(ATCC, CCL 107)는 trypsin에 의한 해리술을 사용하여 배양용기로부터 세포를 분리하였다. 분리된 세포들은 10% 혈청, 10 units/mL penicillin과 10 μg/mL streptomycin 함유된 배양액에 분주 후 1×105 cells/well의 밀도로 96-well 배양용기에 넣어 72시간 동안 36°C, 5% CO2의 항온기에서 배양하였다. 세포생존율은 배양 세포에 각 well당 10 μL의 XTT (50 μg/mL)를 넣은 다음 항온기에서 4시간 동안 배양하였다[23]. 배양 후 DMSO로 처리한 다음, ELISA reader (Spectra max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3회 반복 실험하였다. XTT50값은 회귀직선식으로 구하였다.
배양 C6 glioma세포에 AlCl3가 110∼150 μM의 농도로 각각 포함된 배양액에서 48시간 동안 처리하고 난 후 세포생존율에 의한 XTT50값을 측정한 다음 이를 본 실험분석에 사용하였다. 본 실험은 3회 반복 실험하였다.
쑥부쟁이 추출물 속에 함유된 여러 성분 중 항산화능이 강한 QU 성분에 대한 항산화능을 비교하기 위하여 15 μM H2O2를 배양 세포에 처리전에 먼저 QU, 40 μM과 60 μM의 각각 농도를 2시간 동안 처리한 후 이것의 영향을 세포생존율에 의하여 조사하였다. 또한, AlCl3에 대한 QU의 영향은 XTT50 농도의 AlCl3 처리전에 40 μM과 60 μM QU를 2시간 동안 처리 후 각각의 세포생존율을 조사하였다. 본 실험은 3회 반복 실험하였다.
AY 추출물에 대한 독성 조사를 위하여 30∼90 μg/mL 추출물 각각의 농도를 배양 세포에 48시간 동안 처리하고 난 후 세포생존율을 조사하였다. 이 과정에서 추출물의 최대허용한계농도를 측정하고 한계농도 이하 농도 두개를 분석에 사용하였다. 또한, AlCl3에 대한 AY 추출물의 영향조사는, XTT50 농도의 AlCl3를 배양 세포에 처리하기에 앞서 50 μg/mL와 70 μg/mL의 추출물을 2시간 동안 처리하고 난 후 세포생존율에 의한 각각의 영향을 조사하였다. 본 실험은 3회 반복 실험하였다.
AOAC [24] 방법에 따라, 폴리페놀 분석은 시료추출 0.2 mL와 phenol reagent 0.2 mM을 혼합하여 3분간 반응시키고 나서 0.4 mL sodiμM carbonate에서 1시간 동안 처리한 다음 ELISA reader를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 타닌산(tannic acid)을 표준시약으로 검량곡선을 작성하였다. Nieva Moreno 등[25]의 방법에 따라, 플라보노이드 분석은 25°C에서 시료용액 0.1 mL와 10% aluminum nitrate, 1 M potassium acetate 혼합물 0.2 mL에, 에탄올 4.7 mL를 첨가하여 40분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였고, 루틴(rutin)을 표준시약으로 검량곡선을 작성하였다. 본 실험은 3회 반복 실험하였다.
Stirpe and Corte [26]의 방법에 의해 XO 저해 활성 측정은 희석추출물 0.1 mL와 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5)에 xanthine 기질액과 0.1 mL를 가하여 25°C에서 15분 동안 반응시켰다. 반응시킨 후 1 N HCl을 넣어 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader로 292 nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해 활성은 시료무첨가군에 대한 시료첨가군의 백분율로 나타냈으며, XO 저해능=100−[(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100]으로 하였으며, QU를 양성대조군으로 사용하였다. 본 실험은 3회 반복 실험하였다.
SAR-소거 활성 측정은 nitroblue tetrazolium (NBT)의 환원방법에 의해 시료용액 0.1 mL와 0.4 M potassium phosphate buffer, 0.4 xanthine, NBT를 가하여 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 1 N HCl을 넣어 정지시킨 다음 ELISA reader로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소거 활성은 시료무첨가군에 대한 시료첨가군의 백분율로 나타냈으며, SAR 소거능=100−[(시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100]으로 하였으며, QU를 양성대조군으로 사용하였다. 본 실험은 3회 반복 실험하였다.
모든 실험값의 자료는 SPSS/WIN (18.0)을 이용하여 Mean±SD로 나타냈으며, 각 군간의 비교를 위해 one way ANOVA를 시행한 후 Tukey HSD로 사후 분석을 하였다. 유의성 수준은
AlCl3의 독성을 알아보기 위하여 배양 C6 glioma세포에 110∼150 μM 각각 농도의 AlCl3를 48시간 동안 배양한 결과, 세포생존율이 AlCl3의 처리농도에 의존적으로 유의한 감소를 보여 독성을 나타냈다(
QU의 항산화능 조사를 위해 배양 세포에 15 μM의 H2O2를 처리하기 전에 QU, 40 μM과 60 μM을 2시간 동안 각각 처리하였다. 그 결과, H2O2만의 처리에서는 대조군에 비하여 세포생존율이 39.6% (0.19±0.03)로 나타난 반면, 40 μM과 60 μM의 QU의 처리에서는 각각 64.6% (0.31±0.02)와 89.6% (0.43± 0.05)로 나타나, H2O2만을 처리에 비하여 모두 유의하게 세포생존율이 증가하였다(
The antioxidative ability of quercetin (QU) on the hydrogen peroxide (H2O2) in cultured C6 glioma cells
Concentrations of QU (μM) | XTT assay (450 nm) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|
Mean±SD | ||||
Controla | 0.48±0.05 | 92.73 | <0.001 | a>d>c>b |
15 μM H2O2b | 0.19±0.03 | |||
40c | 0.31±0.02 | |||
60d | 0.43±0.05 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: QU, quercetin; H2O2, hydrogen peroxide.
항산화제인 QU의 AlCl3의 세포독성에 대한 영향을 알아보기 위하여 XTT50 농도의 AlCl3를 배양 세포에 처리하기 2시간 전에 QU, 40 μM과 60 μM 각각 농도를 처리하였다. 그 결과, AlCl3만의 처리에서 세포생존율이 대조군에 비하여 37.0% (0.17±0.01)로 나타났고, 40 μM과 60 μM QU의 처리에서는 각각 60.9% (0.28±0.04)와 76.1% (0.35±0.01)로 나타났다(
The effect of quercetin (QU) on the cytotoxicity induced by aluminum chloride (AlCl3) in cultured C6 glioma cells
Concentrations of QU (μM) | XTT assay (450 nm) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|
Mean±SD | ||||
Controla | 0.46±0.03 | 205.61 | <0.001 | a>d>c>b |
AlCl3 (XTT50)b | 0.17±0.01 | |||
40c | 0.28±0.04 | |||
60d | 0.35±0.01 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: QU, quercetin; AlCl3, aluminum chloride.
AY 추출물의 독성분석을 위하여 추출물이 각각 30∼90 μg/mL 농도로 각각 포함된 배양액에서 세포를 처리한 결과 30 μg/mL와 50 μg/mL 농도에서 세포생존율이 대조군에 비하여 98.0% (0.50±0.03)와 96.1% (0.49±0.02)로 각각 나타났다. 또한, 70 μg/mL와 90 μg/mL 농도에서 세포생존율은 각각 92.2% (0.47±0.02)와 86.3% (0.44±0.02)로 나타났다(
AY 추출물성분 중 폴리페놀의 함량은 35.2 mg/g으로, 플라보노이드 함량은 24.9 mg/g으로 각각 나타났다(Figure 3).
AlCl3의 세포독성에 대한 AY 추출물의 영향에 있어서, XTT50 농도의 AlCl3를 배양 세포에 처리하기 전에 50 μg/mL와 70 μg/mL의 추출물을 각각 처리한 결과, AlCl3의 처리에서는 세포생존율이 대조군에 비하여 39.5% (0.15±0.03)로 나타난데 비하여 50 μg/mL 추출물 처리에서는 52.6% (0.20±0.04)로 나타났다. 또한 70 μg/mL 추출물 처리에서는 63.2% (0.24±0.02)로 나타나 AlCl3만의 처리에 비하여 유의한 증가를 나타냈다(
The protective effect of
Concentrations of AY extract (μg/mL) | XTT assay (450 nm) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|
Mean±SD | ||||
Controla | 0.38±0.03 | 91.33 | <0.001 | a>d>c>b |
AlCl3 (XTT50)b | 0.15±0.03 | |||
50c | 0.20±0.04 | |||
70d | 0.24±0.02 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: AY,
XO 저해 활성 측정을 위하여 AY 추출물 50 μg/mL와 70 μg/mL의 시료를 각각 분석한 결과 50 μg/mL 추출물의 처리에서는 XO 활성이 78.3% (0.47±0.04)로 나타났으며, 70 μg/mL의 처리에서는 73.3% (0.44±0.02)로 나타났다(Table 4). 따라서, XO 저해능은 50 μg/mL와 70 μg/mL에서 각각 21.7%와 26.7%로 대조군에 비하여 유의한 저해능을 나타냈고(
The inhibitory activity of xanthine oxidase (XO) of
Concentrations of AY extract (μg/mL) | XO-inhibitory activity (292 nm) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|
Mean±SD | ||||
Controla | 0.60±0.04 | 236.43 | <0.001 | a>c, d>b |
60 μM QUb | 0.16±0.02 | |||
50c | 0.47±0.04 | |||
70d | 0.44±0.02 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: AY,
SAR-소거 활성 측정을 위한 AY 추출물 50 μg/mL와 70 μg/mL의 시료를 각각 분석한 결과 50 μg/mL 추출물의 처리에서는 SAR 활성이 81.4% (0.35±0.02)로 나타났으며, 70 μg/mL의 처리에서는 76.7% (0.33±0.03)로 나타났다(Table 5). 따라서, SAR-소거능은 50 μg/mL와 70 μg/mL에서 각각 18.6%와 23.3%로 이는 대조군에 비하여 유의한 소거능을 나타냈고(
Superoxide anion-radical (SAR) scavenging activity of
Concentrations of AY extract (μg/mL) | SAR-scavenging activity (560 nm) | F | Tukey HSD | |
---|---|---|---|---|
Mean±SD | ||||
Controla | 0.43±0.02 | 286.91 | <0.001 | a>c, d>b |
60 μM QUb | 0.13±0.01 | |||
50c | 0.35±0.02 | |||
70d | 0.33±0.03 |
The data indicate the mean±SD for triplicate experiments.
Abbreviations: AY,
염화알루미늄(AlCl3)은 수렴제를 비롯하여 화장품, 의약품, 섬유염색과 같은 산업용품제조에 있어 사용용도가 다양하지만, 이보다는 음식물의 포장지를 비롯한 방부제나 음식이나 음료용기 등에 사용됨으로써 우리의 식생활과도 직접적으로 연관되어 있다[8]. 따라서, AlCl3 독성이 중요시되면서 독성에 대한 예방이나 치료에 대한 관심이 높아지게 되었으며, AlCl3와 같은 알루미늄화합물들은 치매유발물질로 알려져 있는 만큼 이의 취급이나 관리에 많은 주의가 요구되고 있다[5]. 따라서, 본 연구에서는 AlCl3에 대한 신경독성을 조사하기 위하여, 배양중인 C6 glioma세포에 AlCl3가 각각 110∼150 μM로 포함된 배양액에서 48시간 동안 처리한 결과 처리농도에 비례하여 세포생존율이 유의하게 감소함으로써 신경독성을 나타냈으며, 이 과정에서 XTT50값이 130.0 μM에서 나타나 Borenfreund와 Puerner [27]의 독성판정기준으로 중간독성(mid-cytotoxic)으로 나타났다. 본 연구 결과는 뇌세포에서 알루미늄의 신경독성[28]을 보고한 결과와 알루미늄의 뇌독성[5]을 보고한 결과와 일치하였다. 본 연구와 같이 AlCl3의 독성현상은 AlCl3가 신경세포의 전달물질분비방해[29]나 신경세포내 신경원섬유의 변화를 초래하여 세포를 퇴화시켰을 가능성도 배제할 수는 없지만[30], 그 보다 AlCl3의 산화적 손상에 의한 가능성이 클 것으로 생각된다. 이 같은 이유의 하나로 AlCl3의 독성이 항산화제인 비타민 E에 의하여 방어되었다는 보고가 이를 제시하고 있다[8]. 따라서, 본 연구에서는 AlCl3의 독성과 산화적 손상의 관련성을 알아보기 위하여 항산화제의 일종인 QU를 AlCl3 XTT50 농도를 배양 세포에 처리하기 전 40 μM과 60 μM 농도를 각각 처리한 결과 AlCl3만의 처리에서는 세포생존율이 37.0%로 나타난데 비하여 QU의 처리에서는 각각 60.9%와 76.1%로 나타나 모두 AlCl3만의 처리보다 유의한 세포생존율의 증가를 나타냈다. 이 같은 결과는 AlCl3의 독성에 의한 산화적 손상을 항산화제인 QU가 방어한 것으로 AlCl3의 독성에 자유라디칼이 관여하고 있음을 증명하고 있다. 이는 AlCl3의 독성을 항산화제인 비타민 E [8]와, BHT [28]가 방어하였다는 연구 결과와 일치함을 알 수 있었다. 한편, AlCl3의 독성에 대한 AY 추출물의 영향을 항산화 측면에서 알아보기 위하여 먼저 AY 추출물에 대한 항산화 성분에 대한 함량분석을 시행하였다. 이를 위해 추출물속에 함유되어 있는 캠퍼롤을 비롯한 QU나 quercetinrhamnoside, kaempferol-3-glucorhamnoside. 이소퀘르시트린과 같은 페놀성 플라보노이드계통에 대한 총 폴리페놀과 총 플리보노이드 함량을 조사한 결과 각각 35.2 mg/g과 24.9 mg/g으로 나타났다. 본 결과는 Lee 등[11]이 AY 추출물에서 측정한 32.7 mg/g과 21.1 mg/g보다는 다소 높으나 거의 유사한 함량인 것으로 나타났다. 추출물속의 페놀성 성분함량이 많을수록 더 높은 항산화능을 나타내게 됨은 이미 잘 알려진 사실이다. 따라서, 본 연구에서는 AY 추출물의 항산화능에 대한 분석을 위하여 XO 저해능과 SAR-소거능과 같은 항산화 분석을 행하였다. XO 저해능의 측정은 세포의 대사 중에 XO는 산소를 전자수용체로 이동시켜서 XO나 하이포크산틴(hypoxanthie)으로부터 요산이 생성되게 하는데 이 대사과정 중에 자유라디칼이 형성되므로 XO의 활성 저해는 결국 자유라디칼의 생성을 저해하는 것이 된다[26]. SAR-소거능 분석은 자유라디칼의 일종인 초과산화물음이온(O2−)을 제거하는 능력을 측정하는 정량적 분석법이다[31]. 먼저, XO 저해능 조사에 있어서, 추출물 50 μg/mL와 70 μg/mL에서 각각 21.7%와 26.7%로 나타나 대조군에 비하여 모두 높은 저해능을 나타냈다. 이 같은 결과는 한련초(
본 연구는 치매유발물질의 하나인 염화알루미늄(AlCl3)의 신경독성을 C6 glioma세포를 배양하여 조사하였으며, AlCl3의 독성에 대한 쑥부쟁이[
This paper was supported by Wonkwang Health Science University in 2020.
None
Seo YM, Professor.