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High Prevalence and Genotypic Characterization of Metallo-β-Lactamase (MBL)-Producing Acinetobacter spp. Isolates Disseminated in a Korean Hospital
Korean J Clin Lab Sci 2019;51:444-452  
Published on December 31, 2019
Copyright © 2019 Korean Society for Clinical Laboratory Science.

Jong Hwa Yum

Department of Clinical Laboratory Science, Dongeui University, Busan, Korea
Correspondence to: * Jong Hwa Yum
Department of Clinical Laboratory Science, Dongeui University, 176 Eomgwang-ro, Busanjin-gu, Busan 47340, Korea
E-mail: auxotype@deu.ac.kr
* ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9264-1347
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Carbapenem resistance, mediated by the major acquired metallo-β;-lactamase (MBL) genes, has been increasingly reported, particularly for clinical isolates of Acinetobacter spp. Of the 191 nonduplicate clinical isolates of the carbapenem-nonsusceptible Acinetobacter spp. evaluated, 125 isolates (65.4%) were positive for the modified imipenem or meropenem-Hodge test, and 49 isolates (25.7%) were positive for the imipenem-EDTA+SMA double disk synergy test (DDS). PCR and sequencing of the blaVIM-2-allele and blaIMP-1-allele showed that 29 A. baumannii isolates and 1 A. calcoaceticus isolate had blaVIM-2, whereas 16 A. baumannii isolates and 2 A. calcoaceticus isolates had blaIMP-6; 1 isolate of the A. genomospecies 3 had blaVIM-2 and blaAIM-1. All the above MBL genes belong to class 1 integron. The size of class 1 integron encompassing blaVIM-2 or blaIMP-6 ranges from 2.8 kb to 3.2 kb in clinical isolates of A. baumannii, and 3.2 kb to 3.5 kb in clinical isolates of A. genomospecies 3. blaVIM-2 was most often located first or second in the class 1 integron, and these integrons often included aacA4. Due to dispersion of the MBL-producing Acinetobacter spp. as well as integron, which may encompass various resistance genes, there is an expectation for the increase of multidrug resistant Gram-negative bacteria, including resistance of carbapenems such as imipenem or meropenem. Hence, the development of new antimicrobial agents for treating severe Acinetobacter spp. infections is needed.
Keywords : Acinetobacter spp., blaIMP-6, blaVIM-2, Carbapenem resistant, Metallo-β-lactamase
서 론

다제 내성 Acinetobacter spp.에 의한 감염이 증가하고 있어 이들 세균에 의한 감염증 치료에 어려움이 자주 발생하고 있다[1]. 이들 균종은 신속한 집락화와 감염으로 인해 병원 환경에서 가장 까다로운 병원균 중 하나로 취급된다. Acinetobacter spp.은 폐렴, 패혈증, 심내막염, 창상감염, 요로감염, 수막염 등 다양한 감염증의 원인균으로 알려져 있으며[1-5], 주요한 원내 감염균이기도 하다[6]. Carbapenem은 Acinetobacter spp. 감염에 가장 우수한 약제로 알려져 있으나, carbapenem 내성 Acinetobacter spp.의 증가를 막기위해 이들 약제는 제한적으로 사용하고 있다.

Carbapenem 내성에 관여하는 기전은 carbapenem 가수분해 β-lactamase (carbapenemase), 막 투과 감소 및 efflux pump의 활성이 있다[7, 8]. Carbapenemase는 serine-β-lactamase와 metallo-β-lactamase (MBL)가 주요 효소이다. MBL은 분자구조에 따라 6가지 형으로 나뉘며, IMP, VIM, GIM, SIM, AIM 및 SPM 형이 있다[9-11]. 이들 MBL 중 IMP, VIM 및 SIM과 같은 MBL 유전자는 흔히 integron에 위치하여 플라스미드 등과 관련하여 동종간 혹은 이종간 전파가 용이하다[10]. IMP 및 VIM형 및 그 외 class B metallo-β-lactamase 생성 그람음성 막대균이 임상 검체에서 분리율이 계속적으로 증가하고 있다[12, 13]. MBL 중 VIM의 경우 1997년 프랑스에서 분리된 P. aeruginosa에서 class 1 integron에 위치한 blaVIM-2가 검출되었으며[14], 여러 나라에서 점차 출현율이 증가하고 있다. 또한, MBL 유전자 중 하나인 blaIMP-1은 1988년 일본에서 처음 보고되었으며[15], 이들 MBL 변이종은 점차 증가하고 전파 확산되고 있다. 2003년 국내 임상에서 분리한 Acinetobacter spp. 267주중 MBL 생성 균주는 38주(14.2%)이었으나[16], 계속적인 증가 추가에 있다. 또한, 최근 권 등은 IMP-1 생성 균주가 대부분이었고, NDM-1 생성 균주가 2주 검출된 바 있으며, IMP-1과 NDM-1을 동시 생성하는 A. pittii를 국내에서 분리 보고한 바 있다[17]. 따라서, 본 연구에서는 국내 유행하는 MBL 생성 Acinetobacter spp.의 빈도를 조사하고 integron에 위치한 MBL 유전자의 유전형을 규명하고 이들 분리 균주들의 항균제 내성 양상을 분석하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 균주 수집

2005년부터 2009년까지 국내 경기지역 일개 대학병원 임상검체에서 분리된 Acinetobacter spp. 중 imipenem 혹은 meropenem에 대하여 비감수성 균주 191주를 수집하였으며, 한 환자에서 중복 분리된 균주는 제외하였다. 균종 동정은 전통적인 생화학방법과 상품화된 키트(ID 32 GN system, bioMerieuex, Marcy-l'Etoile, France)를 이용하였다.

2. 분자유전학적 동정

16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 균종 동정하였다. 시험 균주를 부유시킨 멸균수 100 µL를 100°C에서 12분간 중탕 후 4°C에서 13,000 rpm으로 2분간 원심분리한 후 상청액 10 µL를 주형 DNA로 사용하여 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 시발체는 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′과 5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′를 사용하였으며, Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭시켰다[17]. 중합효소연쇄반응 조건은 94°C 5분 predenaturation 후, 94°C 20초 denaturation, 50°C 40초 annealing, 72°C 2분 extension의 과정을 35회 반복 후 72°C 5분 extension을 실시하였다. 중합효소연쇄반응 산물은 전기영동하여 band를 확인한 후에 QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 증폭된 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 사용하여 유전자의 염기서열을 GenBank data base의 DNA 염기서열과 비교분석하였다.

3. Carbapenemase 생성 균주의 선별

Imipenem 혹은 meropenem을 이용한 Hodge 변법 시험을 시행하고, E. coli ATCC 25922를 지시세균으로 이용하였다. E. coli ATCC 25922를 McFarland No. 0.5 탁도관에 맞추어 MacConkey agar에 멸균된 면봉을 이용하여 고르게 접종한 후, 중앙에 imipenem 혹은 meropenem 10 µg disk (Oxoid, Cambridge, UK)를 얹고 시험 균을 한 줄로 획선하여 36°C에서 18시간 배양하였다. 시험 세균 주변을 따라 지시세균의 성장이 증가하면 양성으로 판독하여, carbapenemase 생성 Acinetobacter spp.로 감별하여 분리 수집하였다[18-20].

4. Carbapenem-EDTA+SMA double disk synergy 시험

Imipenem 혹은 meropenem-Hodge 변법시험에 양성인 균주는 imipenem 혹은 meropenem과 EDTA+sodium mercaptoacetic acid (SMA) double disk synergy 시험(DDS)을 시행하였다[19, 20]. 시험균주를 McFarland 0.5관 탁도로 조정하여 Muller hinton agar에 고르게 접종한 후, imipenem 혹은 meropenem 10 µg disk와 760 µg EDTA+2 mg SMA disk를 가장자리가 10 mm 간격으로 놓고 36°C에서 18시간 배양하였다. 두 디스크 사이의 억제대가 커지면 MBL 생성 균주로 판독하였고, 이들 세균은 20% skim milk에 부유하여 −70°C에 보관하여 시험에 사용하였다.

5. MBL 유전자 분석

중합효소연쇄반응법(PCR)을 이용하여, MBL 유전자인 blaIMP-1, blaVIM-2, blaAIM-1, blaVIM-1, blaNDM-1blaSIM-1 유전자를 검출하였다. 시험에 사용한 시발체는 Table 1에 나타내었다. 균주를 멸균수 100 µL에 부유하여 10분간 중탕하고 13,000 rpm에서 2분간 원심후 상청액을 주형 DNA로 이용하였다. 중합효소연쇄반응 반응은 AccuPower PCR Premix (Bioneer, Daejeon, Korea)에 주형 DNA 1 µL, 20 pmol의 시발체 1 µL, 증류수 17 µL를 첨가하여 최종 20 µL으로 반응하였다. Mastercycler Gradient 5331 (Eppendorf)를 이용하여 94°C 4분 predenaturation, denaturation 94°C 30초, annealing 55°C 30초, extension 72°C 45초의 조건으로 30회 반응하고 72°C 7분간 extension하여 반응을 종료하였다. 중합효소연쇄반응 산물의 확인은 1% agarose gel에서 100 V 30분간 전기영동하고, 중합효소연쇄반응 산물의 크기 추정을 위하여 500 bp DNA ladder (Takara, Shiga, Japan)를 사용하였다[9]. 중합효소연쇄반응 산물은 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)를 사용하여 유전자의 염기서열을 분석하였다.

Primers used for detection or sequencing of the MBL genes

Target Primer Sequence (5′ to 3′) Size of product Gene bank accession number
blaIMP-1 IMP1-F CAT GGT TTG GTG GTT CTT GT 448 bp AB753459.1
IMP1-R ATA ATT TGG CGG ACT TTG GC
blaVIM-2 VIM2-FR-F ATG TTC AAA CTT TTG AGT AAG 801 bp AF191564
VIM2-FR-R CTA CTC AAC GAC TGA GCG
blaAIM-1 AIM1-F ATG AAA CGT CGC TTC ACC CTG 912 bp AM998375
AIM1-R TCA AGG CCG CGC GCC CC
blaVIM-1 VIM1-F CAC TTC TCG GCG GAG ATT GAA 495 bp KC417378.1
VIM1-R GTG CTT TGA CAA CGT TCG CT
blaNDM-1 NDM1-F TCG CAC CGA ATG TCT GGC AGC A 454 bp KF699332.1
NDM1-R AAA GCG ATG TCG GTG CCG TCG A
blaSIM-1 SIM1-F TAC AAG GGA TTC GGC ATC G 571 bp AY887066.1
SIM1-R TAA TGG CCT GTT CCC ATG TG


6. Integron 유전자 분석

Class 1 integron은 중합효소연쇄반응법에 의해 검출하였고, Riccio 등이 제시한 시발체를 사용하였다[21]. 중합효소연쇄반응 조건은 Levesque 등의 방법을 변형하여 시행하였다[22]. 중합효소연쇄반응은 3U LA Taq DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan)에 주형 DNA 5 µL, 20 pmol의 시발체 5′CS-F와 3′CS-R 1 µL를 첨가하고, 최종 100 µL로 반응하였다. 중합효소연쇄반응은 Mastercycler Gradient 5331 (Eppendorf)를 이용하여 predenaturation 94°C 12분, 94°C 1분, 56°C 1분, 72°C 5분으로 35회 시행하였다. 매 회 마다 extension 시간은 5초씩 증가시켰다. Integrase 유전자, intI1, intI2 및 intI3의 검출은 Shibata 등이 제시한 시발체와 중합효소연쇄반응 조건으로 시행하였다[23].

중합효소연쇄반응 산물은 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석하였다.

7. 항균제 감수성 시험

항균제 감수성 시험은 CLSI [24]의 권고에 따라 104 colony forming units의 접종액을 Mueller-Hinton agar (Difco Laboratories, USA)에 접종하여 고체한천희석법으로 시행하였다. E. coli ATCC 25922와 P. aeruginosa ATCC 27853를 항균제 감수성 시험에 참조균주로 사용하였다. 시험에 사용한 항균제는 ampicillin과 cephalothin (Sigma Chemical Co., USA), piperacillin (Wyeth, USA), sulbactam (Pfizer Korea, Seoul, Korea), ceftazidime (GlaxoSmithKline, UK), cefotaxime (Handok, Korea), cefoxitin과 imipenem (Merck Sharp & Dohme, USA), meropenem (Sumitomo, Japan), aztreonam (Bristol-Myers Squibb, USA), amikacin (Dong-A Pharmaceutical, Seoul, Korea), ciprofloxacin (Sigma-Aldrich, China), 그리고 colistin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이었다.

결 과

국내 대학병원에서 환자에서 분리된 imipenem 혹은 meropenem 내성 Acinetobacter spp. 191주에 대하여 imipenem혹은 meropenem-Hodge 변법 시험을 시행하였다. Imipenem에 의해서는 A. baumannii 121주, A. calcoaceticus 3주 및 A. genomospecies 3 1주가 양성을 보였으며, meropenem에 의해서는 A. baumannii 가 74주, A. calcoaceticus 2주, A. genomospecies 3 1주가 양성을 보여 총 125주의 carbapenemase 생성 균주를 검출하였다(Table 2). Acinetobacter spp. 균주를 대상으로 시행한 Hodge 변법시험에서 meropenem 보다는 imipenem을 사용하는 것이 검출율이 높았다.

Results of Hodge test, double disk synergy test of Acinetobacter spp.

Strains No. of isolates Hodge test positive strains Double disc synergy test positive strains


Imipenem Meropenem Imipenem Meropenem
A. baumannii 187 121 74 45 7
A. calcoaceticus 3 3 2 3 3
A. genomospecies 3 1 1 1 1 1
Total 191 125 77 49 11


2. MBL 생성 균주

Imipenem 혹은 meropenem-Hodge 변법시험에 양성인 균주에 대하여 imipenem 혹은 meropenem-EDTA+SMA DDS 양성인 Acinetobacter spp.는 imipenem에 의해서는 49주, meropenem에 의해서는 11주가 MBL생성 균주가 검출되었다(Table 3). MBL 생성 Acinetobacter spp. 균주 검출시 DDS 시험에서 meropenem 보다 imipenem을 사용하는 것이 4배 이상 검출율이 높았다.

MBL gene types and integron classes of Acinetobacter spp.

Strains No. of isolates

MBL gene type Class of integron


blaVIM-2 blaIMP-6 blaAIM-1 Int1 Int2 Int3
A. baumannii 29 16 0 45 0 0
A. calcoaceticus 1 2 0 3 0 0
A. genomospecies 3 1 0 1 1 0 0
Total 31 18 1 49 0 0


3. MBL 유전자 및 Integron

Imipenem 혹은 meropenem-EDTA+SMA DDS 양성인 49주의 MBL 유전자 검출을 위하여 중합효소연쇄반응법을 이용하였다. A. baumannii 29주와 A. calcoaceticus 1주에서 blaVIM-2 allele가 검출되었다(Table 3). 이들 균주들의 MBL 유전형은 중합효소연쇄반응 산물을 염기서열 분석을 이용하여 모두 blaVIM-2 유전자임을 확인하였다. A. baumannii 16주와 A. calcoaceticus 1주에서 blaIMP-1 allele가 검출되었으며, 염기서열 분석으로 이들 균주들의 MBL 유전형은 모두 blaIMP-6임을 확인하였다. A. genomospecies 3 1주에서 blaVIM-2blaAIM-1이 동시에 검출되었다. blaVIM-2, blaIMP-6blaAIM-1외의 blaVIM-1, blaSIMblaNDM allele는 검출되지않았다. 이들 49 균주는 모두 class 1 integron이 검출되었다(Table 3). 또한, blaVIM-2 혹은 blaIMP-6를 갖는 integron은 aacA4 유전자를 흔히 갖고 있었고(data not shown), A. baumannii는 2.8 kb와 3.2 kb의 integron을 A. calcoaceticus는 3.2 kb와 3.5 kb의 integron을 A. genomospecies 3는 5.2 kb와 5.5 kb의 integron이 검출되었다.

MBL 생성 Acinetobacter spp.는 객담 검체에서 28주(57.14%), 삽관에서 9주(18.37%), 소변에서 7주(14.29%), 농에서 3주(6.12%) 및 그 외 검체에서 2주(4.08%)가 검출되었다(Table 4). MBL 생성 A. baumannii는 객담, 삽관 및 소변에서 각각 27주, 9주 및 6주로 객담에서 가장 많이 검출되었고, A. calcoaceticus 1주가 혈액에서 검출되었다. VIM-2 생성 Acinetobacter spp.는 객담 검체에서 19주, 삽관에서 5주, 소변에서 4주, 농에서 2주 및 창상에서 1주가 검출되었다. IMP-6 생성 Acinetobacter spp.는 객담, 삽관 및 소변에서 각각 9주, 4주 및 3주가 검출되었고, 그 외 농과 혈액에서 각각 1주씩 검출되었다. VIM-2와 AIM-1을 동시에 생성하는 A. genomospecies 3 1주는 창상검체에서 검출되었다.

Specimens of MBL gene PCR-positive Acinetobacter spp. isolates

Specimens No. (%) of MBL PCR-positive No. (%) of isolates


blaVIM-2 blaIMP-6 blaAIM-1 ABA ACA AG3 Total
Sputum 19 9 0 27 1 0 28 (57.14)
Catheter TIP 5 4 0 9 0 0 9 (18.37)
Urine 4 3 0 6 1 0 7 (14.29)
Pus 2 1 0 3 0 0 3 (6.12)
Blood 0 1 0 0 1 0 1 (2.04)
Wound 1 0 1 0 0 1 1 (2.04)
Total 31 (62.00) 18 (36.00) 1 (2.00) 45 (91.84) 3 (6.12) 1 (2.04) 49 (100)

Abbreviations: ABA, A. baumannii; ACA, A. calcoaceticus; AG3, A. genomospecies 3.



4. MBL 생성 Acinetobacter spp.에 대한 항균제 감수성

VIM-2 생성 A. baumannii에 대한 imipenem과 meropenem의 MIC는 각각 16∼64 µg/mL와 8∼64 µg/mL이었고, ampicillin/sulbactam의 MIC는 32∼128 µg/mL이었고, cefotaxime, ceftazidime 및 cefoxitin의 MIC는 각각 >128 µg/mL, 64∼ >128 µg/mL, 그리고 64∼ >128 µg/mL이었고, 대부분의 β-lactam제제에 높은 MIC값을 보였다(Table 5). Aztreonam의 MIC는 16∼128 µg/mL로 비교적 낮은 MIC을 보이는 균주도 있었다. Amikacin의 MIC는 4∼ >128 µg/mL이었고, colistin의 MIC는 0.25∼4 µg/mL로 비교적 낮은 값을 나타냈다. VIM-2 생성 A. calcoaceticusA. baumannii와 유사한 결과를 보였고, colistin의 MIC는 0.5 µg/mL로 감수성이었다. IMP-6 생성 Acinetobacter spp.에 대한 imipenem과 meropenem의 MIC는 모두 8∼32 µg/mL로 MIC값이 유사한 경향을 보였다(Table 5). 이들 균주에 대한 ampicillin/ sulbactam의 MIC는 32∼ >128 µg/mL이었고, cefotaxime, ceftazidime, cefoxitin 및 aztreonam의 MIC는 각각 >128 µg/mL, 64∼ >128 µg/mL, >128 µg/mL 및 4∼64 µg/mL이었다. Amikacin의 MIC는 128∼ >128 µg/mL으로 IMP-6 생성 Acinetobacter spp.는 대부분의 β-lactam 제제에 대해 모두 높은 MIC 값으로 내성을 보였다. Colistin의 MIC는 0.25∼0.5 µg/mL이었고, 이들 IMP-6 생성 Acinetobacter spp. 모두 감수성이었다. AIM 생성 A. genomospecies 3 균주에 대한 imipenem과 meropenem의 MIC는 각각 32 µg/mL 과 16 µg/mL로 meropenem의 MIC값이 약간 낮았고, 다른 시험 항균제에 대해서는 Acinetobacter spp.와 유사한 결과를 보였다.

MICs of antimicrobial agents for MBL-producing clinical isolates of Acineotobacter spp. in a Korean hospital

MBL types Strains (No. of isolates) MIC range (mg/mL)

IPM MEM AZT CTX CAZ CEP FOX SAM PIP AMK CIP COL
VIM-2 ABA (29) 16∼64 8∼64 16∼128 >128 64∼>128 >128 64∼>128 32∼>128 64∼ >256 4∼>128 0.25∼64 0.25∼4
ACA (1) 16 8 64 >128 >128 >128 >128 64 >256 32 32 0.5
IMP-6 ABA (16) 8∼32 8∼32 4∼64 >128 64∼>128 >128 >128 32∼>128 64∼256 128∼>128 0.5∼64 0.25∼0.5
ACA (2) 16 16 32∼64 >128 >128 >128 >128 32∼64 128∼>128 128 16 0.5
VIM-2+AIM-1 AG3 (1) 32 16 32 >128 >128 >128 >128 64 >128 >128 64 0.5

Abbreviations: IMP, imipenem; MEM, meropenem; AZT, aztreonam; CTX, cefotaxime; CAZ, ceftazidime; CEP, cephalothin; FOX, cefoxitin; SAM, ampicillin/sulbactam; PIP, piperacillin; AMK, amikacin; CIP, ciprofloxacin; COL, colistin; ABA, A. baumannii; ACA, A. calcoaceticus; AG3, A. genomospecies 3.


고 찰

2010년 E. coli, Enterobacter cloacae, P. aeruginosaA. baumannii 등과 같은 그람음성 막대균을 대상으로 carbapenemase 생성균 선별에 imipenem-Hodge 변법시험이 유용함을 Lee 등이 발표한 바 있다[19, 20, 25]. 본 연구에서 imipenem혹은 meropenem-Hodge 변법시험을 시행한 결과, A. baumannii 121주, A. calcoaceticus 3주 및 A. genomospecies 3 1주가 imipenem-Hodge 변법 시험에 양성을 보였으며, A. baumannii 가 74주, A. calcoaceticus 2주, A. genomospecies 3 1주가 meropenem-Hodge 변법시험에 양성을 보여 총 125주의 carbapenemase 생성 Acinetobacter spp.를 검출하였다(Table 2). Acinetobacter spp. 균주를 대상으로 carbapenemase 생성 균주 검출시 Hodge 변법시험에 meropenem보다는 imipenem을 사용하는 것이 일선 검사실에서 균주 선별을 위해서는 유용성이 높은 것으로 나타났다. 그러나, A. baumannii 6주는 imipenem-Hodge 변법시험에서 음성을 보였으나 Meropenem-Hodge 변법시험에서 양성을 보여(data not shown), imipenem 디스크와 meropenem 디스크를 동시에 사용하는 것이 carbapenemase 생성 Acinetobacter spp. 선별시 검출율을 높일 수 있는 것으로 나타났다.

일선 검사실에서 그람음성 막대균 중 MBL 생성 균주를 선별시 carbapenem-DDS 시험에 imipenem 디스크를 흔히 사용하여 한다[19, 20]. 그러나, 일본의 Arakawa 등은 IMP-1을 생성하는 Klebsiella penumoniae, Citrobacter freundii, P. aeruginosaSerratia marcescens 등의 그람음성 세균 중 MBL 생성 균주 선별에 사용하는 DDS 시험에 caftazidime을 이용하는 것이 유리하다고 보고한 바 있다[26]. 그러나, MBL 생성 균주 선별에 imipenem-DDS 시험이 효율적이라고 보고한 연구자도 있다[19, 20]. 본 연구에서 imipenenm 혹은 meropenem 내성 A. baumannii 121주를 대상으로 유사 항균제인 imipenem과 meropenem을 사용한 DDS 시험에서 imipenem-DDS 시험에서 45주가 양성이고, meropenem-DDS 시험에서 7주가 양성으로 나타나(Table 3), imiepenem 디스크를 사용하는 것이 meropenem을 사용하는 것 보다 6배 이상 효과적이었다. 이는 MBL 생성 세균 중에는 imipenem과 meropenem에 대한 가수분해 활성 차이로 인해 meropenem을 이용한 DDS 시험에 음성 결과를 보이는 경우가 있는 것으로 추정된다. 따라서, 일선 검사실에서 MBL 생성 Acinetobacter spp. 검출시 DDS 시험에 imipenem 디스크를 사용하는 것이 효율적인 것으로 판단된다.

Surveillance of Multicenter Antimicrobial Resistance in Taiwan (SMART)의 조사 연구에서 7개의 주요 대형병원의 중환자실에서 검출한 A. baumannii complex 138주 중 객담, 혈액 및 소변 검체에서 각각 115주, 9주 및 6주가 검출되어 주로 이들 균주는 객담에서 많이 검출되는 것으로 발표한 바 있다[27]. 본 연구에서 MBL 생성 Acinetobacter spp.는 객담에서 28 (57.14%)주가 검출되어 가장 많았고, 삽관과 소변 검체에서 각각 9 (18.38%)주와 7 (14.29%)주가 검출되어 유사한 검출율을 보였다.

Yong과 Yum 등은 국내 대학병원에서 imipenem 내성 Acinetobacter spp.는 1998년 이미 높은 분리율을 보고한 바 있고, 이들 세균은 1주는 blaIMP-1을 가지고 있었고, 13주는 blaVIM-2를 가지고 있었고[28, 29], 계속적으로 이들 세균은 높은 분리율을 보였다. 2004년 국내에서 분리한 Acinetobacter spp.중 30%가 imipenem에 내성이었고, 이들 내성 균주의 27%정도는 MBL 생성 균주이었고, 이들 균주가 가지는 MBL은 integron에 위치한 blaVIM-2 allele가 64%, blaIMP-1 allele가 29%, 그리고 blaSIM-1 allele가 7%로 높은 빈도를 보였다[29].

Imipenem에 내성인 MBL 생성 Acinetobacter spp.에 대한 분자생물학적 역학조사를 미국, 폴란드, 그리스 및 이태리 등 지역이나 국가에서 시행하여 보고하였다[21, 27, 30, 31]. 최근 이들 지역 연구에서 IMP와 VIM형 MBL의 출현이 만연한 것으로 나타났다. 국내에서는 거리가 먼 유럽지역에서는 MBL 생성 그람음성 막대균에서 blaVIM형이 높은 빈도로 검출되고, 상대적으로 가까운 거리의 일본에서는 blaIMP-1형이 주로 검출되었으나, 국내에서는 1995년이후 blaVIM-2형 MBL이 이 일정 기간 동안 계속적으로 검출되었다[14, 32, 33]. 일본에서 발견된 blaIMP-6이 국내 그람음성 세균에서도 출현하고 있다. IMP-6은 IMP-1과 비교하여 하나의 아미노산 서열만이 바뀌어(Ser196Gly) penicillin에 대한 활성은 감소되고 meropenem에 대한 활성이 증가한 것으로 알려져 있다[34]. 2009년부터 국내에서 검출된 MBL 생성 P. aeruginosa과 같은 그람음성 막대균에서 IMP-6 생성 균의 출현이 증가한 것으로 보고하였다[35].

본 연구에서는 MBL 생성 A. baumannii 29주와 A. calcoaceticus 1주에서 blaVIM-2를 검출하였고, A. baumannii 16주와 A. calcoaceticus 2주에서 blaIMP-6가 검출되었고 A. genomospecies 3 1주에서 blaVIM-2blaAIM-1이 동시에 검출되어 국내 MBL 생성 Acinetobacter spp.는 blaVIM-2blaIMP-6가 주로 전파되고 있고, blaAIM-1를 가지는 세균도 출현하는 것으로 나타났다(Table 3). 따라서, 국내에서 유행하는 MBL 생성 Acinetobacter spp. 간에는 blaIMP-6보다 blaVIM-2가 보다 많이 전파확산되고 있고, 이들 내성 유전자에 의한 imipenem 혹은 meropenem에 대한 내성 세균이 증가할 것으로 판단된다.

2003년, 국내에서 SIM 생성 A. baumanni 6주가 출현하였는데, 이 SIM 유전자는 class 1 integron에 있었다[9]. 내성 유전자가 integron에 위치하는 경우, 이들 유전자의 전달이 용이할 수 있는데, 본 연구에서 MBL 생성 Acinetobacter spp.에서 SIM 유전자는 검출되지 않았다(Table 3, 4). 이는 VIM과 IMP 효소에 비해 SIM은 imipenem이나 meropenem에 대한 가수분해능이 상대적으로 낮아, 해당 항균제 압력이 있을 때 VIM이나 IMP와 같은 내성 유전자를 보다 더 잘 가지고 있는 것으로 판단된다. 또한, 과거 국내에서 출현한 MBL 생성 Acinetobacter spp.는 IMP-1을 주로 생성하였으나, 본 연구에서 IMP-6 생성 균주가 증가하는 이유는 IMP-6가 meropenem에 대한 가수분해 활성이 높은 것으로 판단되며, IMP-6 생성 균주는 계속적으로 증가할 것으로 예상된다.

blaVIM-2는 흔히 integron에 위치하는데, blaVIM-2가 위치한 integron의 크기와 카세트 배열은 다양하게 보고되었다[14, 32, 33, 36-38]. 캐나다에서 출현한 blaVIM-2를 갖는 integron은 aacC1aacA4를 함께 가지고 있었고[39], 미국에서 출현한 blaVIM-2를 갖는 integron은 blaVIM-2는 두번째 카세트에 위치하고, aacA7, dhfraacC-A5를 함께 가지고 있었다[37]. 국내에서 2002년 Yum 등이 보고한 MBL 생성 A. baumanniiAcinetobacter genomospecies 3는 첫번째 카세트에 위치한 blaVIM-2를 갖는 integron, In105는 aacA7aadA1을 갖고 있었고, In106은 aacA4aadA1을 갖고 있었다[28].

본 연구에서는 blaVIM-2 혹은 blaIMP-6를 갖는 integron은 aacA4 유전자를 흔히 갖고 있었고(data not shown), A. baumannii는 2.8 kb와 3.2 kb의 integron을 A. calcoaceticus는 3.2 kb와 3.5 kb의 integron을 A. genomospecies 3는 5.2 kb와 5.5 kb의 integron이 검출되었다(Table 3). 또한 한 균주가 2개 이상의 integron을 흔히 가지고 있었다. 본 결과로 보아, Acinetobacter spp.는 시기와 지역에 따라 MBL 유전자 뿐 아니라 다양한 내성 유전자를 갖는 integron을 흔히 2개 이상 가질 수 있는 것으로 보인다.

VIM-2 생성 Acinetobacter spp.와 IMP-6 생성 Acinetobacter spp.에 대한 imipenem의 MIC는 각각 16∼64 µg/mL과 8∼32 µg/mL이었고, meropenem의 MIC는 8∼64 µg/mL과 8∼32 µg/mL로 비교적 높은 값으로 내성이었고, ampicillin/sulbactam을 포함하여 대부분의 β-lactam제제의 MIC가 높고 ciprofoxacin과 같은 다른 계열 항균제의 MIC도 높은 균주도 많았다(Table 5). 이에 반해 colistin의 MIC는 0.25∼4 µg/mL로 낮아 대부분 감수성이었다. 그러나, colistin 의 사용이 증가한다면, 이들 항균제에 대한 내성도 증가할 것으로 예상되므로, Acinetobacter spp. 감염증 치료를 위한 새로운 항균제의 개발이 필요해 보인다.

MBL 생성 Acinetobacter spp.는 국내에서 계속적으로 높은 검출율을 보이고 있다. VIM-2 생성 Acinetobacter spp.는 1990년대 이후로 계속적으로 높은 검출율을 보이고 있으며, IMP-6 생성 Acinetobacter spp. 점진적으로 증가하고 있는 추세이다. Sung 등은 2015년, IMP-1 생성 균주가 대부분이었고, IMP-1과 NDM-1을 동시 생성하는 A. pittii를 국내에서 분리 보고한 바 있다[17]. 호주에서 2012년, 검출된 AIM-1 생성 P. aeruginosa가 출현한[11] 이후 많은 보고가 없는 AIM-1과 VIM-2를 동시에 생성하는 A. genomospecies 3도 나타나고 있어, 이들 MBL에 의한 carbapenem 내성 그람음성 세균의 증가가 예상되므로 이들 균주의 추가 확산 전파를 효과적으로 방지하기 위한 정책과 감염관리가 필요해 보인다. 또한, 다양한 나라와 지역의 의료기관에서 MBL 생성 Acinetobacter spp.뿐 아니라 다양한 내성유전자를 가질 수 있는 integron을 갖는 균주와 유전체의 전달로 imipenem과 같은 carbapenem을 포함한 다제 내성 그람음성 세균 출현의 증가가 예상되므로, 계속적이고 체계적인 분자 역학적 조사연구 등이 필요하다.

요 약

주요 획득성 metallo-β-lactamase (MBL) 유전자에 의해 매개되는 carbapenem 내성, 특히 Acinetobacter spp. 균종의 임상 분리주에 대한 보고가 증가하고 있다. 본 연구에서 임상에서 비 중복으로 분리된 carbapenem 비감수성 Acinetobacter spp. 191주 중 125 (65.4%)주가 imipenem 혹은 meropenem-Hodge 변법시험에 양성이었고, 49 (25.7%)주가 imipenem-EDTA+SMA double disk synergy (DDS) 시험에 양성이었다. blaVIM-2 allele와 blaIMP-2 allele 검출을 위한 중합효소연쇄반응과 염기서열분석을 시행한 결과, A. baumanniiA. calcoaceticus에서 각각 29주와 1주가 blaVIM-2를 갖고 있었고, A. baumannii 16주와 A. calcoaceticus 2주가 blaIMP-1을 갖고 있었다. A. genomospecies 3는 blaVIM-2blaAIM-1을 동시에 갖고 있었다. 이들 MBL 유전자는 모두 class 1 integron에 있었다. blaVIM-2 혹은 blaIMP-6를 갖는 class 1 integron의 크기는 A. baumannii 분리주에서는 2.8 kb에서 3.2 kb이었고, A. genomospecies 3 분리주에서는 3.2 kb에서 3.5 kb이었다. blaVIM-2는 대부분 class 1 integron에 첫번째 혹은 두번째에 위치하였고, aacA4를 흔히 가지고 있었다. 다양한 내성 유전자를 가질 수 있는 MBL 생성 Acinetobacter spp.뿐 아니라 다양한 내성 유전자를 가질 수 있는 integron의 전파로 imipenem이나 meropenem과 같은 carbapenem 내성을 포함하여 다제 내성 그람음성 세균의 증가가 예상된다. 또한, 위중한 Acinetobacter spp. 감염증 치료를 위한 새로운 항균제 개발이 필요하다.

Acknowledgements

I thank Prof. Hyukmin Lee Yonsei University College of Medicine, Republic of Korea for providing clinical isolates collection. This work was supported by Dong-eui University Grant (201902050001).

Conflict of interest

None

Author’s information (Position)

Yum JH, Professor.

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